唐 茜，韓云鳳，石 懿，楊春紅，賴先榮*，張富文

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 611137； 2.成都中醫(yī)大銀海眼科醫(yī)院股份有限公司，四川 成都 610081）

視力舒處方為成都中醫(yī)大瀛海眼科醫(yī)院院內(nèi)制劑，是根據(jù)陳達夫“補益肝腎、活血明目” 的近視治療理念，以“駐景丸加減方” 為基礎(chǔ)進行改進，用于能近怯遠、目睫無力、視物昏花等癥［1］，由菟絲子、楮實子、枸杞、山藥、青皮、葛根等11 味中藥組成，原方以湯劑形式服務(wù)于患者，多年臨床應(yīng)用效果滿意，為了最大程度方便患者用藥，課題組前期將其開發(fā)成顆粒劑。本實驗優(yōu)化視力舒顆粒制備工藝，并建立其物理指紋圖譜，以期為該制劑新藥開發(fā)及工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料

1.1 儀器 BSA124S 型、CPA225D 型電子分析天平［賽多利斯科學(xué)儀器（北京） 有限公司］； Agilent 1260 高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）； UPH-I-10T 型（優(yōu)普） 純水制造系統(tǒng)（成都超純科技有限公司）； ZDHW 型調(diào)溫電熱套（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）； YC-500 實驗室噴霧干燥機（上海雅程儀器設(shè)備有限公司）； DHG-9624A 電熱恒溫鼓風干燥箱（上海將任實驗設(shè)備有限公司）； HCP108恒溫恒濕箱（北京五洲東方科技發(fā)展有限公司）。

1.2 藥材 菟絲子（批號200900671，產(chǎn)地遼寧）、枸杞子（批號201100371，產(chǎn)地寧夏）、炒茺蔚子 （批號200400771，產(chǎn)地四川）、麩炒山藥（批號200700771，產(chǎn)地河南）、芡實（批號191003931，產(chǎn)地廣東）、葛根（批號200901621，產(chǎn)地四川）、油松節(jié)（批號190800181，產(chǎn)地四川）、伸筋草 （批號200800261，產(chǎn)地四川）、炒楮實子（批號 200600201，產(chǎn)地湖北）、麩炒青皮 （ 批號200500531，產(chǎn)地四川） 均購自成都康美藥業(yè)生產(chǎn)有限公司，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)張藝研究員鑒定為正品。炒楮實子、麩炒青皮符合2015 年版《四川省中藥飲片炮制規(guī)范》 藥用標準，其余藥材均符合2020 年版《中國藥典》 一部藥用標準。

1.3 試劑 金絲桃苷 （批號DST201013-023，純度≥98.0%）、葛根素 （批號DSTDG000201，純度≥98.0%）、橙皮苷（批號DSTDG003801，純度≥98.0%） 對照品均購自成都德思特生物技術(shù)有限公司?？扇苄缘矸?（批號A16GS145576）、微晶纖維素（批號Z11N11W130285）、糊精（批號T02D11Z13024）、甘露醇（批號M24GS149532）均購自上海源葉生物科技有限公司； 蔗糖 （批號20130624） 購自成都市科龍化工試劑廠。乙腈、甲醇為色譜純（美國賽默飛世爾科技公司）； 磷酸為色譜純（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）； 水為純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 濃縮液制備 按處方量稱取11 味藥材共150 g，加11倍量水煎煮3 次，每次80 min，合并濾液，過濾濃縮至相對密度為1.05～1.08，即得。

2.2 干膏粉制備 由于處方干膏得率較大，若采用稠浸膏制粒則輔料用量較多，從而加大了服藥量，故選擇制成干膏粉進行濕法制粒。前期發(fā)現(xiàn)，真空干燥得到的干膏黏性大，難以粉碎，故采用噴霧干燥。以葛根素、金絲桃苷、橙皮苷含量，物料干燥情況，出粉率為指標，設(shè)定噴霧壓力為0.05 MPa，風機頻率為40 Hz，蠕動速度為10 r/min，對噴霧干燥機進風口、出風口溫度進行考察，結(jié)果見表1，最終確定兩者分別為130、79 ℃。

表1 噴霧干燥機進風口、出風口溫度考察結(jié)果

2.3 顆粒制備 將干膏粉與輔料混勻，乙醇潤濕制軟材，16 號篩搖擺制粒，干燥整粒，即得，平行制備15 批（編號SLS1～SLS15）。

2.4 評價指標選擇及測定 顆粒成型率、吸濕率、休止角是評價成型工藝是否符合要求、顆粒品質(zhì)穩(wěn)定性、顆粒質(zhì)量能否準確分裝的關(guān)鍵指標［2-4］，金絲桃苷、葛根素、橙皮苷保留率是保證顆粒藥效的重要指標，故本實驗選擇以上指標進行綜合評價。

2.4.1 各成分含量測定 采用HPLC 法。

2.4.1.1 色譜條件 Swell Chromplus C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流動相乙腈-0.1% 磷酸，梯度洗脫（0 ～10 min，5% ～10%乙腈； 10～20 min，10% ～17%乙腈； 20～40 min，17% ～25%乙腈； 40～45 min，25% ～5%乙腈）； 體積流量1.0 mL/min； 柱溫30 ℃； 檢測波長250 nm （金絲桃苷、葛根素）、280 nm （橙皮苷）； 進樣量10 μL。

2.4.1.2 對照品溶液制備 分別精密稱取對照品金絲桃苷0.92 mg、橙皮苷2.38 mg、葛根素4.99 mg，置于10 mL 量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得。

2.4.1.3 供試品溶液制備 精密稱取相當于0.5 g 干膏粉的顆粒適量，置于具塞錐形瓶中，加20 mL 甲醇，稱定質(zhì)量，超聲（頻率25 Hz，功率100 W） 處理1 h，放冷，稱定質(zhì)量，甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，過0.45 μm 微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.4.1.4 陰性樣品溶液制備 分別制備缺菟絲子、缺青皮、缺葛根的陰性樣品，按 “2.4.1.3” 項下方法制備，即得。

2.4.1.5 專屬性試驗 取對照品、供試品、陰性樣品溶液各10 μL，在“2.4.1.1” 項色譜條件下進樣測定，結(jié)果見圖1。由此可知，該方法專屬性良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖

2.4.1.6 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.4.1.2” 項下對照品溶液適量，甲醇稀釋成6 個質(zhì)量濃度，在“2.4.1.1” 項色譜條件下各進樣10 μL 測定。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y） 進行回歸，得各成分方程分別為金絲桃苷Y＝21.444X-0.964 2 （R2＝0.999 8），線性范圍2.48 ～92.00 μg/mL； 葛根素Y＝39.523X+23.316（R2＝0.999 9），線性范圍13.47 ～499.00 μg/mL； 橙皮苷Y＝15.307X+9.502 2 （R2＝0.999 8），線性范圍6.43 ～238.00 μg/mL，均在各自范圍線性關(guān)系良好。

2.4.1.7 精密度試驗 精密吸取“2.4.1.2” 項下對照品溶液適量，在“2.4.1.1” 項色譜條件下進樣測定6 次，測得金絲桃苷、橙皮苷、葛根素峰面積RSD 分別為1.88%、1.11%、1.02%，表明儀器精密度良好。

2.4.1.8 重復(fù)性試驗 按“2.4.1.3” 項下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.4.1.1” 項色譜條件下進樣測定，測得金絲桃苷、橙皮苷、葛根素含量RSD 分別為1.26%、1.06%、1.90%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.1.9 穩(wěn)定性試驗 按“2.4.1.3” 項下方法制備供試品溶液，室溫下于0、2、4、8、16、24 h 在“2.4.1.1” 項色譜條件下各進樣10 μL 測定，測得金絲桃苷、橙皮苷、葛根素峰面積RSD 分別為2.37%、1.17%、0.85%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定良好。

2.4.1.10 加樣回收率試驗 精密量取2 mL 各成分含量已知的供試品溶液6 份，按100%水平精密加入對照品溶液，在“2.4.1.1” 項色譜條件下進樣測定，測得金絲桃苷、葛根素、橙皮苷平均加樣回收率分別為100.11%、101.84%、102.28%，RSD 分別為1.96%、1.77%、1.89%。

2.4.2 保留率測定 精密稱取干膏粉0.5 g、相當于干膏粉0.5 g 的顆粒適量，按“2.4.1.3” 項下方法制備供試品溶液，在“2.4.1.1” 項色譜條件下進樣測定，計算保留率，公式為保留率＝ （制粒后成分含量/制粒前成分含量） ×100%。

2.4.3 成型率測定 參考文獻［5］ 報道，取顆粒適量（m1），稱定能通過1 號篩但被5 號篩截留的顆粒質(zhì)量（m2），計算成型率，公式為成型率＝ （m2/m1） ×100%

2.4.4 吸濕率測定 參考文獻［6］ 報道，將恒重稱量瓶放在盛有過飽和氯化鈉溶液的干燥器中，置于25 ℃恒溫箱中平衡24 h 后取出，精密稱定質(zhì)量（m1）； 精密稱取顆粒適量（m2），平鋪于稱量瓶底部，放回25 ℃恒溫箱中24 h后取出，稱定質(zhì)量（m3），計算吸濕率，公式為吸濕率＝［（m3-m1-m2） /m2］ ×100%。

2.4.5 休止角測定 采用固定漏斗法［7］。用鐵架臺將3 個串聯(lián)漏斗固定，最下方漏斗與坐標紙的距離為H，從最上方漏斗緩慢倒入顆粒，當其形成的圓錐體頂尖與最下方漏斗頂尖發(fā)生接觸時停止傾倒，底部半徑為R，計算休止角，公式為休止角＝arctan （H/R）。

2.5 輔料篩選 以顆粒制備難易程度、溶化性、成型率為指標進行篩選，結(jié)果見表2，最終確定為甘露醇。

表2 輔料篩選結(jié)果

2.6 Plackett-Burman 試驗 在濕法制粒過程中，影響顆粒成型的因素主要有藥輔比、乙醇體積分數(shù)、乙醇用量、干燥時間、干燥溫度［8-9］。本實驗在前期單因素試驗基礎(chǔ)上進行Plackett-Burman 試驗，分別采用AHP、CRITIC、AHPCRITIC 混合加權(quán)法對各指標進行綜合評價，因素水平見表3，結(jié)果見表4。

表3 Plackett-Burman 試驗因素水平

表4 Plackett-Burman 試驗設(shè)計與結(jié)果

2.6.1 AHP 法 AHP 法屬于主觀賦權(quán)法［10-11］。本實驗通過分析成分和3 個物理屬性指標重要性，將各指標劃分為4個層次，由層次劃分結(jié)果構(gòu)成兩兩比較優(yōu)先判斷矩陣，權(quán)重系數(shù)見表5，再按文獻 ［12］ 報道計算一致性比率（CR），測得金絲桃苷、葛根素、橙皮苷轉(zhuǎn)移率及成型率、吸濕率、休止角的權(quán)重系數(shù)分別為0.242 7、0.242 7、0.242 7、0.136 2、0.082 5、0.053 0，CR ＝0.010 9＜0.10，表明權(quán)重系數(shù)有效。

表5 各指標權(quán)重系數(shù)

2.6.2 CRITIC 法 CRITIC 作為客觀賦權(quán)法［13-14］，是完全利用數(shù)據(jù)自身的客觀屬性進行科學(xué)評價［15］。本實驗將表4數(shù)據(jù)進行無量綱化處理，金絲桃苷、葛根素、橙皮苷轉(zhuǎn)移率及成型率均越大越好，吸濕率、休止角均越小越好，參考文獻［16］ 報道計算權(quán)重，測得金絲桃苷、葛根素、橙皮苷轉(zhuǎn)移率及成型率、吸濕率、休止角權(quán)重系數(shù)分別為0.161 9、0.117 6、0.129 7、0.230 4、0.236 6、0.123 8。

2.6.3 AHP-CRITIC 混合加權(quán)法 將AHP 法與CRITIC 法結(jié)合進行權(quán)重分配時，能兼顧主客觀因素，使評分更科學(xué)，公式為ω綜合ij＝ωAHPijωCRITICij/∑ωAHPijωCRITICij，測得金絲桃苷、葛根素、橙皮苷轉(zhuǎn)移率及成型率、吸濕率、休止角的權(quán)重系數(shù)分別為0.256 3、0.186 0、0.205 1、0.204 5、0.066 5、0.081 6。

2.6.4 綜合評分計算 結(jié)果見表6，可知3 種評分方法兩兩之間的相關(guān)系數(shù)均大于0.98 （P＜0.01），表明三者具有一致性； AHP 法、CRITIC 法所得權(quán)重相關(guān)系數(shù)為-0.620（P＞0.05），即反映的信息不具有疊加性，表明AHPCRITIC 混合加權(quán)法更全面。

表6 Plackett-Burman 試驗綜合評分計算結(jié)果（分）

2.6.5 方差分析 采用Minitab 19 軟件對表4 數(shù)據(jù)進行處理，結(jié)果見表7。由此可知，模型P＜0.01，具有高度顯著性； 輔料用量、潤濕劑體積分數(shù)、干燥溫度對綜合評分具有顯著影響（P＜0.05），故選擇三者進行后續(xù)考察。同時，固定潤濕劑用量為45%，干燥時間為120 min。

表7 Plackett-Burman 試驗方差分析

2.7 Box-Behnken 響應(yīng)面法 采用Design-Expert 10.0 軟件，以輔料用量（A）、潤濕劑體積分數(shù)（B）、干燥溫度（C）為影響因素，各指標綜合評分為評價指標，按-1、0、1 水平編碼，結(jié)果見表8～9。由此可知，3 種評分方法兩兩之間的相關(guān)系數(shù)均大于0.98 （P＜0.01），表明三者具有一致性；AHP 法、CRITIC 法所得權(quán)重相關(guān)系數(shù)為-0.557 （P＞0.05），即反映的信息不具有疊加性，表明AHP-CRITIC 混合加權(quán)法更全面。

表8 Box-Behnken 響應(yīng)面法設(shè)計與結(jié)果

表9 Box-Behnken 響應(yīng)面法綜合評分計算結(jié)果（分）

采用Design-Expert 10.0 軟件對表8 數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合，方差分析見表10，可知模型P＜0.01，具有高度顯著性； 相關(guān)系數(shù)R2＝0.953 3＞0.9，表明預(yù)測值與實測值的相關(guān)性較好，可用于分析； 各因素影響程度依次為B＞A＞C，并且均有極顯著影響（P＜0.01）。響應(yīng)面分析見圖2，可知最優(yōu)工藝為輔料用量0.31 倍，潤濕劑（乙醇） 體積分數(shù)87.35%，干燥溫度60 ℃，綜合評分為98.61 分，考慮到在生產(chǎn)、實驗中的便利性，將潤濕劑體積分數(shù)修正為87%。

圖2 各因素響應(yīng)面圖

表10 Box-Behnken 響應(yīng)面法方差分析

按上述優(yōu)化工藝進行3 批驗證試驗，測得平均綜合評分為98.76 分，RSD 為0.12%，與預(yù)測值98.61 分接近，表明該工藝穩(wěn)定可靠。

2.8 物理指紋圖譜建立

2.8.1 物理指標選擇及測定 結(jié)合文獻［17-18］ 報道及顆粒劑物理性質(zhì)、粉體學(xué)性質(zhì)，選擇堆積性、均一性、流動性、穩(wěn)定性作為一級指標，松密度、振實密度、相對均齊度指數(shù)、豪斯納比、休止角、干燥失重、吸濕性作為二級指標。參考文獻［19］ 報道及相關(guān)標準收載，將15 批樣品物理指標轉(zhuǎn)換成0～10，取平均值，結(jié)果見表11。

表11 物理指紋圖譜指標轉(zhuǎn)化值測定結(jié)果

2.8.2 圖譜生成及相似度分析 采用Excel 軟件對15 批樣品物理指標轉(zhuǎn)化值進行處理，繪制雷達圖，再對其平均值繪制雷達圖，得到對照物理指紋圖譜（SLS R），見圖3。然后，采用SPSS 22.0 軟件中的夾角余弦法進行相似度分析，發(fā)現(xiàn)各批樣品之間的相似度均大于0.997，與對照物理指紋圖譜的相似度均在0.999 以上，表明其穩(wěn)定性良好。

圖3 15 批視力舒顆粒物理指紋圖譜

2.9 樣品含量測定 取15 批樣品，按“2.4.1.3” 項下方法制備供試品溶液，在“2.4.1.1” 項色譜條件下進樣測定，計算含量，結(jié)果見表12。由此可知，各成分含量穩(wěn)定，表明該工藝穩(wěn)定可靠。

表12 各成分含量測定結(jié)果

3 討論

視力舒顆粒制備工藝優(yōu)化的過程遵循了質(zhì)量源于設(shè)計（QbD） 理念［20］。本實驗以3 種成分指標、3 個物理評價指標測得值的綜合評分為關(guān)鍵質(zhì)量屬性，對5 個潛在工藝參數(shù)采用Plackett-Burman 試驗進行篩選，再結(jié)合Box-Behnken響應(yīng)面法進行優(yōu)化。

在工藝優(yōu)化的多指標決策中，權(quán)重具有重要地位，其合理性會直接影響排序準確性［21］。本實驗考察了AHP 法、CRITIC 法、AHP-CRITIC 混合加權(quán)法，其中AHP 法依據(jù)成分指標與物理評價指標對顆粒質(zhì)量影響的重要性，主觀進行了層次劃分； CRITIC 法是利用數(shù)據(jù)自身的客觀屬性進行科學(xué)評價，可消除人為因素，結(jié)果兩者所得權(quán)重系數(shù)反映的信息不具有疊加性，故采用AHP-CRITIC 混合加權(quán)法，同時兼顧主客觀因素，可使評分更科學(xué)合理。

顆粒物理屬性是其質(zhì)量評價的重要方面，可作為HPLC含量測定的補充，從而其全面質(zhì)量控制提供了新思路，同時物理指紋圖譜可對其物理性質(zhì)進行全面反映［17］。本實驗按優(yōu)化工藝制備了15 批視力舒顆粒，建立了其物理指紋圖譜，并采用HPLC 法對關(guān)鍵成分進行含量測定，發(fā)現(xiàn)各批樣品質(zhì)量具有較高的一致性，可為相關(guān)新藥開發(fā)、工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。根據(jù)實驗結(jié)果，暫定視力舒顆粒質(zhì)量控制標準為物理指紋圖譜與對照物理指紋圖譜的相似度應(yīng)大于0.9，金絲桃苷、葛根素、陳皮苷含量分別應(yīng)大于0.08%、0.48%、0.32%。