馬漢偉，張 明，白銀亮*，張有成

（1.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院小兒消化科，甘肅 蘭州 730030； 2.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院藥劑科，甘肅 蘭州 730030；3.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院普外科，甘肅 蘭州 730030）

甘草為豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.、脹果甘草GlycyrrhizainflataBat.或光果甘草GlycyrrhizaglabraL.的干燥根和根莖［1］。迄今為止，從甘草中分離出的化合物已達四百余個，藥理研究也證實甘草屬的不同提取物以及分離的次生代謝產(chǎn)物具有多種生物學(xué)活性［2-4］。甘草西定是甘草的活性成分之一，1968 年由日本學(xué)者首次從甘草的根部提取并鑒定［5］，隨后其多種生物學(xué)作用被相繼報道，特別在抗菌、治療口腔疾病、抗腫瘤等方面療效顯著。甘草西定是一種白色針狀結(jié)晶，在二氯甲烷中的熔點為161～162.5 ℃，CAS 編號30508-27-1，分子式C26H32O5，化學(xué)結(jié)構(gòu)3＇，6-雙異戊烯基-2＇，4＇，7-三羥基-5-甲氧基異黃烷（圖1）［5］。異戊烯基的存在會增加黃酮類化合物的親脂性，增強其對生物膜的親和力和對靶蛋白的結(jié)合力［6-7］，這也可能是甘草西定具有廣泛藥理作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。本文將對甘草西定的現(xiàn)代藥理學(xué)研究進展進行綜述，探討其研究方向和應(yīng)用前景，為該化合物今后成為新藥研發(fā)的有效候選分子提供理論依據(jù)。

圖1 甘草西定結(jié)構(gòu)式

1 提取方法

目前甘草西定的提取方法主要是利用有機溶劑進行的，但由于異戊烯基黃酮類化合物在甘草中的含量極低（＜100 μg/g）［8］，提取效率并不理想。近年來倡導(dǎo)的綠色溶劑具有良好的熱穩(wěn)定性、不揮發(fā)性、不燃性，以及能夠更好地溶解細胞壁纖維素和釋放目標(biāo)分子等特性［9-10］。Ji 等［11］設(shè)計的疏水性離子液體［C8MIM］ BF4 （1-辛基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽），能夠與甘草西定產(chǎn)生很強的相互作用，同時［C8MIM］ BF4 可再循環(huán)利用，這使得甘草西定的提取效率明顯提高，為今后批量提取提供了先進的技術(shù)保障。

2 藥動學(xué)研究

王牧原［12］首次建立HPLC 法測定血漿中的甘草西定，當(dāng)其血藥濃度在0.1 ～10 μg/mL 時，與峰面積的線性關(guān)系良好，回收率高，重復(fù)性好，甘草西定的標(biāo)準(zhǔn)貯備液和生物樣品在不同溫度條件下長期保存時藥效穩(wěn)定。在平行人工膜透性試驗（PAMPA） 中，當(dāng)pH 為4.0、7.4 時，甘草西定對PAMPA 的通透性均中等，提示甘草西定可能在胃和小腸中吸收［13］。肝微粒體對甘草西定的代謝具有顯著的物種差異，人類的代謝能力低于大鼠、小型豬、兔、狗、猴等物種［13］。Wang 等［14］給予大鼠甘草西定灌胃后，僅在糞便中檢測到1 種甘草西定的單羥基化衍生物，并認為此羥基化反應(yīng)可能發(fā)生在異戊烯基的反式甲基上。CYP 亞型（ CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4） 參與了甘草西定的代謝，可通過氫鍵和π-π 堆積發(fā)生相互作用［13］。甘草西定也可被UGT1A9 選擇性代謝，產(chǎn)生7-葡糖醛酸甘草西定［15］。因此，水化和羥基化是甘草西定的主要生物轉(zhuǎn)化方式，葡萄糖醛酸化也是清除甘草西定的重要途徑。另有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)甘草西定濃度為10 μmol/L 時，對CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19 的抑制率超過50%［16］； 濃度為100 μmol/L 時，對CYP2C9、CYP2C19、CYP3A4 的抑制率超過 90%，對 UGT1A3、UGT1A6、UGT1A7、UGT1A9、UGT2B4、UGT2B7、UGT2B15則能夠完全抑制［13］，這些發(fā)現(xiàn)將有助于為接受甘草西定治療的患者提供更合理的臨床用藥指導(dǎo)。

3 藥理作用

甘草西定最初是研究者在尋找具有抗胃潰瘍的活性成分時，從光果甘草的根部提取并鑒定的化合物［5］。隨著研究的深入，該化合物的多種藥理學(xué)活性被逐漸報道，涉及抗菌、抗病毒、抗炎、抗氧化、抗腫瘤等多個方面。

3.1 抗菌 因黃酮類化合物具有較強的抗菌活性，故有“植物抗菌素” 之稱。研究發(fā)現(xiàn)，黃酮類化合物特定位置的某些官能團（如烷基鏈、烷基氨基鏈、異戊二烯基、含有氧或氮的雜環(huán)單元等疏水取代基） 的存在會增加化合物的親脂性，環(huán)A 和B 上不同位置的OH 基團的存在則增加了抗菌活性［17-19］。因此，甘草西定的抗菌活性可能與其同時具有多個異戊烯基和羥基的特殊結(jié)構(gòu)有關(guān)。詳見表1。

表1 甘草西定的抗菌活性

3.1.1 常見耐藥菌 抗生素的使用雖然在很大程度上降低了感染性疾病的發(fā)病率和嚴(yán)重程度，但隨之出現(xiàn)的細菌耐藥問題給臨床診療帶來了新的挑戰(zhàn)，其中以耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA） 和萬古霉素耐藥腸球菌（VRE）最為常見。研究顯示，8 μg/mL 甘草西定與苯唑西林聯(lián)用時，可使苯唑西林對MRSA 的最低抑菌濃度（MIC） 降至0.5 μg/mL 以下，而PBP2＇的形成并未受影響，提示甘草西定可能通過修復(fù)苯唑西林的抗菌活性而降低其耐藥性［20-21］。另有研究發(fā)現(xiàn)，甘草西定對VRE 菌株的抗菌作用顯著，MIC 為1.9×10-5mol/L［22］。因此，利用結(jié)構(gòu)特點，優(yōu)化甘草西定與抗生素的聯(lián)合用藥方案，可能為今后耐藥菌的治療提供新的思路。

3.1.2 口腔致病菌 變形鏈球菌是齲齒形成的主要病原體，可通過分解膳食中的碳水化合物而產(chǎn)生有機酸，導(dǎo)致牙齒鈣化組織的局部溶解和破壞。甘草西定能夠有效抑制變形鏈球菌（MIC 為6.25 ～12.5 μg/mL）［26-28］，減少酸性物質(zhì)的產(chǎn)生，降低其黏附性，且對口腔膠質(zhì)細胞的形成幾乎沒有毒性［28］。牙齦卟啉單胞菌是一種革蘭氏陰性兼性厭氧球桿菌，是促發(fā)慢性牙周炎的關(guān)鍵病原體。該細菌通過破壞宿主免疫穩(wěn)態(tài)誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致牙齦組織破壞和牙齒周圍的牙槽骨進行性喪失［32-33］。甘草西定除了能夠抑制牙齦卟啉單胞菌生長［27-34］外，還可抑制NF-κB p65 的磷酸化，減少白細胞介素-6 （IL-6）、趨化因子配體5 （CCL5）、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP） -7/8/9 等的分泌［35］。糞腸球菌感染后會在牙本質(zhì)、牙膠、羥基磷灰石和骨等不同基質(zhì)上形成致密的生物膜，對抗菌藥物具有高度耐藥性，是牙髓治療失敗的主要原因［36］。Marcoux 等［26］發(fā)現(xiàn)，甘草西定對糞腸球菌等牙根管病原體的殺菌作用與氯已定相當(dāng)，并且對牙齦成纖維細胞不產(chǎn)生細胞毒性。若甘草西定與乳鏈菌肽聯(lián)合，則對糞腸球菌具有協(xié)同殺菌作用，還能夠抑制糞腸球菌誘導(dǎo)NF-κB 信號通路的活化，阻斷炎性因子的釋放，從而達到根管消毒的目的［25］。Tanabe 等［29］在唾液模型中發(fā)現(xiàn)，甘草西定能夠顯著抑制莫雷梭菌、牙齦卟啉單胞菌、中間普氏菌等細菌的生長，減少揮發(fā)性硫化合物（VSCs）的生成，從而有效緩解口臭。此外，甘草西定對牙髓卟啉單胞菌、衣氏放線菌、具核梭桿菌、遠緣鏈球菌等口腔常見致病菌也表現(xiàn)出良好的抗菌活性［26-34］。因此，甘草西定可用于研發(fā)新型的口腔消毒藥品及口腔保健食品的添加劑。

3.1.3 幽門螺桿菌 根除幽門螺桿菌（Hp） 是治療消化性潰瘍的重要措施之一，但目前Hp 耐藥的形勢日益嚴(yán)峻，治療難度增加。體外研究顯示，甘草西定對4 種Hp 菌株的抗菌作用顯著，特別是對阿莫西林和克拉霉素的耐藥菌GP98，MIC 為6.25～12.5 μg/mL［30］，這也間接解釋了甘草西定能夠治療胃潰瘍［5］的原因。

除此之外，甘草西定對化膿性鏈球菌、流感嗜血桿菌、卡他莫拉菌等上呼吸道病原菌以及枯草芽孢桿菌、藤黃葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌等的抗菌作用顯著［23-31］，這些研究將為今后感染性疾病的治療提供重要依據(jù)。

3.2 抗腫瘤 據(jù)統(tǒng)計，自20 世紀(jì)40 年代以來，約53.4%的小分子抗腫瘤藥物來源于天然藥物或天然藥物的半合成品［37］，以藥用植物為代表的天然藥物在腫瘤的防治方面正發(fā)揮著越來越重要的作用。

3.2.1 腫瘤的預(yù)防N-甲基-N-亞硝基脲（MNU） 是一種DNA 烷基化致癌物。Inami 等［38］利用TA1535 鼠傷寒沙門氏菌研究了甘草西定對MNU 的抗誘變活性，證實該化合物可通過抑制MNU 造成的DNA 損傷來發(fā)揮化學(xué)預(yù)防癌癥的作用。

3.2.2 腫瘤的治療 2010 年韓國學(xué)者研究首次報道了甘草西定的抗癌作用。該研究首先發(fā)現(xiàn)一種烏拉爾甘草的己烷乙醇提取物，命名為“HEGU”，對表皮生長因子（EGF）誘導(dǎo)的DU145 細胞具有抗轉(zhuǎn)移作用，經(jīng)提取和鑒定后證實“HEGU” 的活性成分是甘草西定。與對照組比較，甘草西定能夠抑制癌細胞遷移，降低MMP-9、尿激酶型纖溶酶原激活劑（uPA）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF） 表達，減少黏附分子的分泌［39］。隨后該團隊又建立了小鼠乳腺癌4T1細胞動物模型，給予甘草西定腹腔注射21 d。結(jié)果顯示，給藥組小鼠腫瘤組織內(nèi)的血紅蛋白表達降低，轉(zhuǎn)移性肺結(jié)節(jié)數(shù)量減少，肺質(zhì)量減輕。進一步探討機制后發(fā)現(xiàn)，甘草西定可通過減少癌細胞遷移、抑制血管生成及淋巴管生成來抑制肺轉(zhuǎn)移。該研究還發(fā)現(xiàn)，甘草西定能夠抑制CD45、F4/80、CD206 等M2 巨噬細胞標(biāo)記蛋白的表達，降低HIF-1α、iNOS、COX-2 等炎癥相關(guān)蛋白表達，從改善腫瘤微環(huán)境的角度闡明了其抗腫瘤作用［40］。

Cevik 等［41］探討了多種甘草根部提取物對腫瘤細胞的細胞毒性，其中以甘草西定對肝細胞癌Huh7 細胞的抑制作用最強，IC50為4.7 μmol/L，能夠抑制肝癌細胞增殖、促進凋亡，阻滯細胞周期于SubG1期（提示凋亡細胞死亡）、G1期和G2/M 期，但具體的作用機制尚不明確。Ji 等［42］通過體內(nèi)外實驗發(fā)現(xiàn)，甘草西定能夠有效抑制結(jié)直腸腺癌細胞SW480 增殖、阻滯細胞周期、誘導(dǎo)細胞凋亡和自噬。利用AMPK 顯性負性突變體，使甘草西定的上述抗腫瘤作用成功逆轉(zhuǎn)，從而證實甘草西定可通過活化AMPK 以誘導(dǎo)癌細胞發(fā)生凋亡和自噬。課題組在甘草西定能夠治療胃潰瘍、抑制Hp 的研究基礎(chǔ)上，通過體內(nèi)和體外實驗證實了甘草西定的抗胃癌作用，其機制為抑制MGC-803 胃癌細胞增殖、促進凋亡，將細胞周期阻滯于G0/G1期，減弱癌細胞的侵襲和遷移能力，并利用定量蛋白質(zhì)組學(xué)、生物信息學(xué)及分子對接等技術(shù)，篩選出可能的藥物作用靶點，最終闡明甘草西定可能通過阻斷ICMT/Ras 信號通路發(fā)揮抗胃癌活性［43］。

吉西他濱是一種阿糖胞苷類似物，盡管它在動物實驗中表現(xiàn)出良好抗腫瘤作用，但在臨床上單藥的抗腫瘤療效并不理想，這可能與耐藥有關(guān)。Wang 等［44］發(fā)現(xiàn)，吉西他濱和甘草西定均能抑制骨肉瘤細胞株U2OS 和MG-63 增殖，促進caspase-3 蛋白表達。兩者聯(lián)合用藥后，甘草西定可增強吉西他濱的細胞毒性，并通過抑制Akt 和NF-κB 通路來協(xié)同吉西他濱發(fā)揮抗腫瘤作用。詳見表2。

表2 甘草西定的抗腫瘤活性及其相關(guān)靶標(biāo)

總之，目前的研究已證實甘草西定對多種腫瘤細胞的生物學(xué)行為具有較強的抗腫瘤活性，但未來亟需開展抗腫瘤治療靶點及機制方面的研究，以期為新型抗腫瘤藥物或聯(lián)合用藥方案提供依據(jù)。

3.3 抗炎、調(diào)節(jié)免疫 早在1991 年日本學(xué)者就觀察到甘草西定能夠抑制3＇，5＇-環(huán)磷酸腺苷（cAMP） 磷酸二酯酶［45］，發(fā)揮抗血小板聚集的作用，這為甘草西定后續(xù)的抗炎作用研究奠定了基礎(chǔ)。血小板活化因子（PAF） 是一種介導(dǎo)炎癥、過敏、內(nèi)毒素性休克等反應(yīng)的磷脂媒介，炎癥細胞在受到適當(dāng)刺激后可產(chǎn)生。乙酰輔酶A 乙酰基轉(zhuǎn)移酶（LPAFAT） 是細胞內(nèi)合成PAF 的關(guān)鍵酶［46］。體外研究顯示，甘草西定能抑制LPAFAT 活性，阻斷PAF 的生成，起到抗炎、抗過敏的作用［47］。

Lck 去磷酸化則是T 細胞活化的初始步驟，蛋白酪氨酸磷酸酶非受體1 型（PTPN1），又稱酪氨酸蛋白磷酸酶1B（PTP1B），則在T 細胞的活化中起關(guān)鍵作用。Lee 等［48］發(fā)現(xiàn)，甘草西定能夠抑制由活化T 細胞產(chǎn)生的IL-2，但對T細胞無細胞毒性作用。在體外實驗中，甘草西定通過調(diào)節(jié)PTPN1 活性來抑制Lck 的去磷酸化。在二硝基氯苯/屋塵螨提取物誘導(dǎo)特應(yīng)性皮炎的動物模型中，經(jīng)甘草西定治療的小鼠相關(guān)癥狀明顯改善，并且耳組織中炎性細胞因子的水平也降低。因此認為甘草西定具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫的作用，可用于治療特應(yīng)性皮炎。

3.4 抗氧化 Kirmizibekmez 等［23］發(fā)現(xiàn)當(dāng)甘草西定濃度為0.32 mg/mL 時，可以清除50%的DPPH 自由基，提示甘草西定具有良好的抗氧化活性。Kim 等［49］從抑制皮膚光老化的角度也證實了這一觀點。光老化是指慢性紫外線暴露引起的皮膚老化。研究顯示甘草西定對ROS 的清除能力高出L-抗壞血酸3.1 倍，抗氧化作用是α-生育酚的1.9 倍，對彈性酶活性的抑制是齊酚酸的2.1 倍，并且有效抑制了MMP-1 蛋白表達，減少了膠原蛋白等的降解，其作用機制可能是甘草西定抑制了絲裂原活化蛋白激酶（MAPK） 的磷酸化，從而導(dǎo)致c-Jun 和c-Fos 等下游信號分子表達降低。因此，甘草西定可作為抗衰老配方的活性成分。

3.5 神經(jīng)保護 創(chuàng)傷性腦損傷（TBI） 是造成殘疾或死亡等意外傷害的主要原因，目前尚無有效的治療方法。Liu等［50］采用改良的重錘法構(gòu)建了小鼠腦外傷模型，在建模后30 min 給予治療，結(jié)果顯示，經(jīng)甘草西定治療后TBI 小鼠的腦水腫明顯減輕，改良的神經(jīng)損害嚴(yán)重程度評分（NSS）降低，提示甘草西定有助于促進腦損傷小鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)。該研究還發(fā)現(xiàn)甘草西定弱化了機體的脂質(zhì)過氧化作用，增強了內(nèi)源性抗氧化能力，有效抑制了神經(jīng)細胞的凋亡，并證實甘草西定可能通過調(diào)控FoxO3/Wnt/catenin 通路發(fā)揮神經(jīng)保護作用，這為今后腦外傷的治療增加了新的候選藥物。

3.6 治療肥胖及其合并癥 隨著飲食結(jié)構(gòu)的改善，肥胖人群的比例在逐年增加，隨之而引發(fā)的心腦血管疾病、代謝紊亂、腫瘤等各類疾病已造成嚴(yán)重的負擔(dān)。PTP1B 在體內(nèi)可通過對胰島素受體或其底物上的酪氨酸殘基去磷酸化，負向調(diào)節(jié)胰島素信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，是目前降糖藥物的重要靶點之一。葉敏等［51］發(fā)現(xiàn)25 μmol/L 甘草西定對PTP1B 的抑制率可達100%，因此甘草西定可用于PTP1B 抑制劑的制備。此外，將負責(zé)儲能的白色脂肪組織向負責(zé)耗能的棕色脂肪樣組織轉(zhuǎn)化的過程，稱為白色脂肪米色化，是目前肥胖治療的新方向［52］。劉威等［53］通過構(gòu)建小鼠的肥胖模型，研究了甘草西定對肥胖及其合并癥的治療作用，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，甘草西定組小鼠體質(zhì)量減輕、皮下白色脂肪組織減少、糖耐量和胰島素敏感性改善，產(chǎn)熱基因Ucp1、PGC1α、Cebpβ 表達均升高，并證實甘草西定可直接刺激皮下的白色脂肪米色化。這些研究將為肥胖及其并發(fā)癥的治療開辟新的思路。

3.7 抗病毒 目前治療新型冠狀病毒（SARS-CoV2） 感染的特效藥尚未問世，靶向病毒遺傳物質(zhì)形成過程中的關(guān)鍵蛋白是研發(fā)抗病毒藥物的一種途徑［54］。Shah 等［55］以COVID-19 主蛋白酶（3CL pro）、木瓜樣蛋白酶（PL pro）、刺突蛋白（S） -血管緊張素轉(zhuǎn)換酶-2 （ACE-2） 復(fù)合物作為研究靶點，從具有抗冠狀病毒作用的植物中篩選出能夠抑制靶點蛋白的成分，進行分子對接研究，結(jié)果顯示甘草西定與刺突蛋白（S） -血管緊張素轉(zhuǎn)換酶-2 （ACE-2） 復(fù)合物的對接分數(shù)為-85.5，氫鍵相互作用良好。與經(jīng)典的抗病毒藥物阿比多爾相比，甘草西定具有更強的親和力。ADMET特性研究也提示該化合物是良好的類藥性分子，這項研究將有助于推動抗SARS-CoV2 病毒特效藥的研發(fā)。

3.8 其他 臨床上常用乙酰膽堿酯酶（AChE） 的抑制劑治療阿爾茲海默病等神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。有研究顯示，甘草西定對AChE 的抑制率高達82%，因此可將甘草西定用于AChE 抑制劑的制備［51］。

4 結(jié)語

綜上所述，甘草西定特殊的化學(xué)結(jié)構(gòu)賦予其豐富的藥理學(xué)作用，其來源廣、易獲取、安全、高效等優(yōu)勢，正吸引著越來越多的研究者深入探索它的藥理活性及作用機制。改造藥物結(jié)構(gòu)、作為先導(dǎo)分子或成為聯(lián)合用藥的組分等多種用途選擇，必將使甘草西定在今后的新藥研發(fā)和治療方案的更新中扮演重要角色。