陳思思，王 俊，鄭杭生

（1.湖州市第三人民醫(yī)院，浙江 湖州 313000； 2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 310000）

肝纖維化（hepatic fibrosis，HF） 是肝臟在多種因素刺激下產(chǎn)生的慢性進(jìn)行性肝臟損傷，如長期過量飲酒、病毒感染或長期服用肝毒性藥物等［1］。主要表現(xiàn)為肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cells，HSC） 的激活，導(dǎo)致過多的細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM），如膠原蛋白、非膠原性糖蛋白、蛋白聚糖等在肝臟中沉積，從而促使HF 的發(fā)生與發(fā)展［2-3］。由于HF 具有可逆性，故及時(shí)有效的治療可防止肝硬化和肝癌的發(fā)生［4］。

三七皂苷類成分是五加科人參屬植物三七的主要活性成分，可統(tǒng)稱為三七總皂苷（panax notoginseng saponins，PNS），其包含多種單體皂苷成分，如人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1和人參皂苷Re 等?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明其在治療心血管疾病、抗炎、抗纖維化、抗腫瘤、改善物質(zhì)代謝等方面具有顯著功效［5-7］。近年來，隨著對(duì)三七皂苷類成分的深入研究，其在抗HF 作用方面取得了一些新進(jìn)展，故有必要對(duì)HF 的發(fā)生機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)闡述，并根據(jù)目前的研究結(jié)果對(duì)三七皂苷類成分治療HF 的分子機(jī)制進(jìn)行綜述，為三七皂苷類成分治療HF 的研究提供理論依據(jù)。

1 肝纖維化發(fā)生的機(jī)制

HF 是肝臟在遭受多種因素長期、反復(fù)的刺激下引發(fā)慢性肝損傷后，在其修復(fù)的過程中產(chǎn)生的一種代償性反應(yīng)，是慢性肝損傷發(fā)展為肝硬化或肝癌的重要中間環(huán)節(jié)［8］。中醫(yī)學(xué)者們根據(jù)HF 患者的臨床表現(xiàn)，將其歸為“淤血” “脅痛” “積聚” “黃疸” 等病癥范疇，認(rèn)為其病機(jī)關(guān)鍵是肝血瘀阻所致的肝郁脾虛，常以“活血化瘀、軟堅(jiān)散結(jié)” 為治療原則［9］。西醫(yī)認(rèn)為HF 的發(fā)病機(jī)制主要是ECM 在細(xì)胞間質(zhì)過度沉積所致。

HF 的發(fā)生機(jī)制主要涉及氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、增殖、凋亡和多種細(xì)胞因子的作用等。HF 是在肝細(xì)胞損傷后進(jìn)行自我修復(fù)、產(chǎn)生炎癥免疫反應(yīng)和ECM 過量沉積的過程中所形成的，其中，ECM 過多沉積與降解相對(duì)不足是其形成的直接原因［10-11］。當(dāng)肝臟遭受長期刺激后機(jī)體會(huì)產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致自由基的大量生成，引起脂質(zhì)過氧化，從而造成肝細(xì)胞損傷； 肝細(xì)胞的損傷會(huì)引發(fā)枯否細(xì)胞活化，從而釋放出血小板衍生生長因子 （platelet derived growth factor，PDGF）、轉(zhuǎn)化生長因子-β （transforming growth factor-β，TGF-β）、白細(xì)胞介素-1β （interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF） 等炎癥細(xì)胞因子［12-13］。上述炎癥細(xì)胞因子和受損的肝細(xì)胞可直接活化HSC 成為肌成纖維細(xì)胞（myofibroblasts，MFs），后者通過高表達(dá)α 平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA），產(chǎn)生大量I 型膠原、Ⅲ型膠原、透明質(zhì)酸、纖維連接蛋白等ECM 成分沉積于肝臟內(nèi)，這是導(dǎo)致HF 形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［14］。正常情況下ECM 的降解或沉積受到基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs） 和金屬蛋白酶抑制劑 （tissue inhibitor of matrix metalloproteinases，TIMPs）的共同調(diào)節(jié)，TIMPs 通過與MMPs 結(jié)合使其失去蛋白水解活性，從而抑制MMPs 的活化，阻止ECM 降解［15］。在肝臟遭受炎癥細(xì)胞因子的刺激過程中，TIMPs 的持續(xù)增多是導(dǎo)致MMPs 活性降低甚至失活的重要原因，“MMPs-TIMPs” 的平衡一旦被打破，就會(huì)造成ECM 大量沉積，推動(dòng)HF 的進(jìn)展。HSC 的活化機(jī)制非常復(fù)雜，目前報(bào)道的信號(hào)通路主要包括TGF-β1/Smad 信號(hào)通路、PI3K-Akt 信號(hào)通路、ERK1/2-MAPK 信號(hào)通路、NF-κB 信號(hào)通路和Wnt/βcatenin 信號(hào)通路等［16-20］，這些信號(hào)通路共同介導(dǎo)HSC 的活化增殖。最終ECM 沉積過多，肝臟形成纖維化（圖1）。HF 的不斷加重可導(dǎo)致肝硬化，甚至惡變形成肝癌。目前HF 的治療主要依靠藥物，西藥通過抑制肝臟細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，保護(hù)肝細(xì)胞，抑制HSC 活化增殖和ECM 的合成； 中藥則通過清除自由基，去除HF 形成的誘因，抑制HSC 的活化和增殖，阻斷ECM 的生成和促進(jìn)ECM 的降解。

圖1 肝纖維化形成機(jī)制

2 三七皂苷類成分防治肝纖維化的細(xì)胞和分子作用機(jī)制

2.1 對(duì)氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響 氧化應(yīng)激反應(yīng)是指機(jī)體受到外界因素刺激后造成“氧化-抗氧化” 平衡系統(tǒng)被破壞，相應(yīng)的組織發(fā)生損傷，使得器官代謝活動(dòng)發(fā)生異常的一種應(yīng)激狀態(tài)。氧化應(yīng)激是肝纖維化、酒精中毒性肝病、感染性肝炎和糖尿病肝病等多種肝臟疾病的共同發(fā)病機(jī)制，在此過程中所生成的過量氧自由基是氧化應(yīng)激損傷發(fā)生的主要原由［21］。肝臟的氧化應(yīng)激指標(biāo)主要包括還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）、谷胱甘肽過氧化物酶 （glutathione peroxidase，GSH-Px）、超氧化物歧化酶 （ superoxide dismutase，SOD） 和丙二醛（malondialdehyde，MDA） 等。其中，GSH 廣泛存在于哺乳動(dòng)物組織中，其作為一種重要的抗氧化劑，能夠清除多種活性氧物質(zhì)，有效減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)對(duì)組織器官的損傷； SOD 是機(jī)體內(nèi)存在的一種主要的抗氧化金屬酶，可催化超氧陰離子自由基歧化生成氧和過氧化氫，減少氧自由基對(duì)肝細(xì)胞的傷害，對(duì)維持“氧化-抗氧化” 平衡起著至關(guān)重要的作用； MDA 作為脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的最終產(chǎn)物之一，是機(jī)體細(xì)胞氧化損傷的一個(gè)重要檢測指標(biāo)，可通過直接激活枯否細(xì)胞和HSC，造成肝細(xì)胞的損傷甚至死亡［22］。董婧婧等［23］在開展三七（主要活性成分為三七總皂苷） 對(duì)慢性肝損傷保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究中，以皮下注射四氯化碳（CCl4） 誘導(dǎo)建立大鼠慢性HF 模型，通過測定肝組織MDA 水平，評(píng)價(jià)三七對(duì)模型大鼠體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度的影響，同時(shí)檢測肝組織中SOD、GSH、GSHPx 水平來衡量三七對(duì)模型大鼠的抗氧化能力，結(jié)果表明，三七通過提高模型大鼠肝組織中GSH 水平和SOD、GSH-Px活性，降低MDA 水平，以增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力，實(shí)現(xiàn)對(duì)HF 的防治作用。硫氧還蛋白-1 （thioredoxin-1，Trx-1） 是一種小分子蛋白，具有多種生物學(xué)功能，其廣泛存在于原核生物和真核生物體內(nèi)。研究表明，Trx-1 與GSH 一樣具有還原性，可以通過調(diào)節(jié)機(jī)體氧化還原平衡來減輕肝臟的炎癥反應(yīng)，減少氧化應(yīng)激損傷，抵抗HF［24］。鄭灃［25］對(duì)三七皂苷抵抗納曲酮所致HF 的分子機(jī)制進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在納曲酮的長期作用下，小鼠肝臟中Trx-1 的表達(dá)顯著下降，而三七皂苷能誘導(dǎo)Trx-1 的高表達(dá)，且三七皂苷與納曲酮的聯(lián)合用藥能明顯緩解納曲酮引起的Trx-1 低表達(dá)，這一研究結(jié)果證實(shí)了三七皂苷很可能是通過誘導(dǎo)Trx-1 的高表達(dá)發(fā)揮抗HF 作用。此外，該研究也揭示了Trx-1 緩解HF的生物學(xué)作用是多方面的，包括抗氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子活性、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和抑制細(xì)胞凋亡等多種作用，Trx-1 可以作為HF 預(yù)防和治療的一個(gè)重要靶點(diǎn)。

2.2 對(duì)炎癥免疫反應(yīng)和肝細(xì)胞凋亡的影響 HF 是在肝臟炎癥和肝細(xì)胞壞死的基礎(chǔ)上，纖維結(jié)締組織異常增生的病理過程。肝臟炎癥作為HF 的驅(qū)動(dòng)因素［26］，在病程早期，炎癥反應(yīng)的長期、反復(fù)刺激會(huì)加劇肝組織損傷，造成肝細(xì)胞壞死，從而推動(dòng)纖維化的進(jìn)展。大量研究證實(shí)［27-28］，HF機(jī)體內(nèi)的一些炎癥細(xì)胞因子表達(dá)異常，其中，肝臟核因子-κB （nuclear factor-κB，NF-κB）、TGF-β 蛋白表達(dá)、肝組織中腫瘤壞死因子-α （tumor necrosis factor-α，TNF-α） 和TGF-βmRNA 表達(dá)及血清中白細(xì)胞介素-1 （interleukin-1，IL-1）、IL-22、IL-6 水平升高，而血清IL-10 水平降低。NFκB 是炎癥反應(yīng)最為重要的轉(zhuǎn)錄因子，可激活HSC，促使其分泌IL-6、IL-1、TGF-β、TNF-α 等細(xì)胞因子。TGF-β 能誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡，促進(jìn)HSC 增生，誘導(dǎo)ECM 形成，同時(shí)抑制ECM 降解，故TGF-β 水平可反映機(jī)體中肝組織炎癥壞死及纖維化的程度。TNF-α 可以增強(qiáng)HSC 的趨化性，激活HSC，同時(shí)，它能刺激肝臟的炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步發(fā)揮促纖維化作用。IL-1、IL-22 和IL-6 可刺激HSC 增殖和促進(jìn)膠原合成，同時(shí)通過抑制MMPs 產(chǎn)生、減少膠原降解，促進(jìn)HF 生成。而IL-10 作為主要的負(fù)反饋免疫調(diào)節(jié)因子，主要通過下調(diào)TGF-β 和TNF-α 等炎癥因子的表達(dá)以抑制HSC 激活，同時(shí)也能調(diào)節(jié)ECM 的合成與降解，從而抑制HF 的發(fā)生［19，29-30］。研究顯示，三七總皂苷作用于CCl4誘導(dǎo)的HF 大鼠后能夠通過調(diào)控其細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)平衡，發(fā)揮抗HF 作用［31］，主要表現(xiàn)為抑制NF-κB、TGF-β、TNF-α、IL-1、IL-6 水平，升高IL-10 水平。

細(xì)胞凋亡的調(diào)控機(jī)制非常復(fù)雜，細(xì)胞是否發(fā)生凋亡與“促凋亡基因-凋亡基因” 之間的平衡直接相關(guān)。細(xì)胞凋亡受多種基因調(diào)控，Bcl-2 和Bax基因發(fā)揮著重要作用，其中，Bax基因能促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而Bcl-2 基因則能抑制細(xì)胞的凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，HF 模型大鼠肝組織中Bax和Bcl-2 的表達(dá)較正常組均升高，表明機(jī)體在通過代償機(jī)制來升高抗凋亡蛋白的表達(dá)以對(duì)抗肝細(xì)胞凋亡［32］。在此基礎(chǔ)上，給予三七總皂苷干預(yù)10 周后，與模型組比較，三七總皂苷中、高劑量組（100、200 mg/kg）Bcl-2 表達(dá)升高，Bax表達(dá)則降低，說明三七總皂苷可以通過升高Bcl-2 表達(dá)，同時(shí)降低Bax表達(dá)，以抑制肝細(xì)胞的凋亡，發(fā)揮抗HF 作用。

2.3 對(duì)肝臟線粒體功能的影響 線粒體作為能量轉(zhuǎn)換細(xì)胞器，能夠提供能量、促進(jìn)新陳代謝，對(duì)維持細(xì)胞的正常生理功能發(fā)揮關(guān)鍵作用。肝臟線粒體氧化磷酸化功能改變被認(rèn)為與HF 的發(fā)生發(fā)展息息相關(guān)［33］。線粒體DNA 三磷酸腺苷（adenine triphosphate，ATP） 酶6 亞基和8 亞基基因的突變會(huì)直接導(dǎo)致ATP 酶合成減少，造成線粒體中ATP 水平下降從而影響肝細(xì)胞的正常生理功能，致使肝細(xì)胞壞死，誘導(dǎo)HF 發(fā)生［34］。李劍瑜等［35］對(duì)人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1干預(yù)下，HF 大鼠肝臟線粒體DNA ATP 酶6 亞基和ATP酶8 亞基的基因突變情況和線粒體中ATP 水平變化進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1能減少肝臟線粒體DNA ATP 酶6 亞基和ATP 酶8 亞基的基因突變，抑制線粒體ATP 水平下降，恢復(fù)肝細(xì)胞的正常生理功能，延緩HF的發(fā)生發(fā)展。此外，李劍瑜等［36］還發(fā)現(xiàn)，HF 大鼠中肝臟線粒體質(zhì)子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)能力降低，同時(shí)伴隨著線粒體膜流動(dòng)性減弱，導(dǎo)致氧化磷酸化功能異常，ATP 無法合成，造成肝細(xì)胞內(nèi)能量代謝障礙，加速HF 的形成。人參皂苷Rg1能夠保護(hù)大鼠肝臟線粒體的質(zhì)子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)能力，使肝臟線粒體微黏度降低，增加線粒體膜流動(dòng)性，恢復(fù)線粒體的氧化磷酸化功能，維持肝細(xì)胞的正常生理功能，防止HF 的產(chǎn)生。

在HF 形成的早中期階段，大量肝細(xì)胞遭受破壞會(huì)促使巨噬細(xì)胞和肝細(xì)胞產(chǎn)生過量的NO，而NO 能夠抑制肝細(xì)胞線粒體的呼吸鏈和蛋白合成以加重肝細(xì)胞損傷，促使疾病進(jìn)展，其水平與HF 程度呈正相關(guān)性［37］。研究表明，三七總皂苷能降低HF 小鼠血清中的NO 水平，保護(hù)肝細(xì)胞，減輕HF 程度［38］。

2.4 對(duì)HSC 活化與凋亡的影響 HSC 作為體內(nèi)重要的間充質(zhì)細(xì)胞，正常情況下，其在肝臟中處于靜止?fàn)顟B(tài)。當(dāng)肝臟受損后，產(chǎn)生的大量炎癥細(xì)胞因子可直接激活HSC 為MFs，后者可產(chǎn)生大量Ⅰ/Ⅲ膠原、透明質(zhì)酸等ECM 成分沉積于肝臟內(nèi)，最終導(dǎo)致HF 的形成［39］。由此可見，HSC 的活化是導(dǎo)致ECM 過度沉積和HF 持續(xù)進(jìn)展的主要驅(qū)動(dòng)力［40-41］，因此通過抑制HSC 的活化或誘導(dǎo)其凋亡可有效逆轉(zhuǎn)HF 的發(fā)生發(fā)展［42］。研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1/Smad 通路和Wnt/β-catenin 通路的異常激活與HF、肝癌密切相關(guān)［43-44］。賀微微等［20］研究了人參皂苷Rg1對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的非酒精性脂肪性肝病小鼠HF 的作用，研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)人參皂苷Rg1處理后的小鼠肝組織纖維化程度明顯降低，并能有效抑制I/Ⅲ膠原的表達(dá)。此外，該研究還發(fā)現(xiàn)模型組小鼠TGF-β1/Smad 通路和Wnt/β-catenin 通路呈過度激活狀態(tài)，而人參皂苷Rg1能夠有效抑制這2 個(gè)通路的活化，說明人參皂苷Rg1可能是通過抑制TGF-β1/Smad 通路和Wnt/β-catenin 通路發(fā)揮其抗HF 的作用。Jiang 等［45］發(fā)現(xiàn)，三七總皂苷通過調(diào)節(jié)Jak2/Stat3 信號(hào)通路以抑制HSC 的活化，能改善大鼠肝臟總膽紅素、總膽汁酸、ALT 和AST 水平，發(fā)揮抗HF 作用。另有研究表明，三七總皂苷可以通過誘導(dǎo)活化的HSC 凋亡逆轉(zhuǎn)HF，且隨著三七總皂苷劑量增加，細(xì)胞凋亡的比例隨之增高［46］。

2.5 對(duì)ECM 沉積與降解的影響 ECM 的過渡沉積是HF形成的最終環(huán)節(jié)，ECM 作為調(diào)節(jié)肝臟自身分化、增殖及代謝的一類大分子物質(zhì)，主要由膠原蛋白、蛋白多糖、彈性蛋白和透明質(zhì)酸鹽等多種成分組成，其中，膠原蛋白是ECM 的主要成分［47］。ECM 主要受TIMPs 和MMPs 的共同調(diào)節(jié)，其中，MMPs 主要來源于靜止的HSC 及MFs 等，而TIMPs 是肝臟中MMPs 的主要生理抑制劑［48］。TIMPs 作為MMPs 活化的抑制劑，可通過與其結(jié)合來阻斷MMPs 的蛋白水解活性，進(jìn)而阻止ECM 的分解。在疾病的進(jìn)展過程中會(huì)出現(xiàn)MMPs 的分泌減少和活性的下降，與此同時(shí)伴隨著TIMPs 水平的增加［15］，進(jìn)而導(dǎo)致ECM 難以溶解，加重HF。董向前等［49］將不同劑量人參皂苷Rg1干預(yù)CCl4所致HF 大鼠，通過光鏡和電鏡觀察實(shí)驗(yàn)大鼠肝組織的病理變化，結(jié)果顯示人參皂苷Rg1作為三七總皂苷中抗HF 的主要單體成分，可減輕HF 大鼠肝細(xì)胞脂肪空泡變性程度、減少HSC周圍和Disse 間隙的膠原纖維沉積，同時(shí)有助于膠原的吸收。此外，該研究還發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rg1和三七總皂苷很可能是通過降低肝組織中TIMP-1 mRNA 表達(dá)發(fā)揮抗HF 作用［50］。姜輝等［51］通過觀察三七總皂苷對(duì)HF 大鼠肝組織MMP-13 和TIMP-1 表達(dá)的影響發(fā)現(xiàn)，三七總皂苷干預(yù)10 周后，能抑制肝組織TIMP-1 表達(dá)，同時(shí)升高M(jìn)MP-13 蛋白與mRNA 表達(dá)，促進(jìn)膠原的降解。

3 結(jié)語與展望

HF 作為大多數(shù)慢性肝病過程中的重要病理過程，如不能及時(shí)得到有效治療，將最終進(jìn)展為肝硬化甚至是肝癌。尋找能夠有效控制HF，防止慢性肝病進(jìn)展為肝硬化或肝癌，提高慢性肝病患者的生活質(zhì)量與生存率的藥物或治療手段，是近年來醫(yī)藥學(xué)家們研究的主要目標(biāo)。

近些年來，中醫(yī)藥學(xué)辨證治療HF 具有良好的應(yīng)用前景，中醫(yī)藥學(xué)者們正在不斷探索能夠有效治療HF 的中藥制劑。研究發(fā)現(xiàn)三七皂苷類成分（包括三七總皂苷及其主要單體成分） 展現(xiàn)出了優(yōu)良的抗HF 作用，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)動(dòng)物研究結(jié)果顯示，其作用機(jī)制主要包括增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力以減少氧化應(yīng)激損傷、下調(diào)炎癥細(xì)胞因子同時(shí)上調(diào)負(fù)反饋免疫調(diào)節(jié)因子、抑制肝細(xì)胞凋亡、保護(hù)肝臟線粒體以維持肝細(xì)胞的正常生理功能、抑制HSC 活化并誘導(dǎo)活化的HSC 凋亡、減少ECM 沉積并促進(jìn)其降解等。由此可見，三七皂苷類成分治療HF 具有多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)。

抗HF 的研究道路可謂機(jī)遇與挑戰(zhàn)并存，多點(diǎn)分子靶向藥物以及中西醫(yī)結(jié)合治療可能是未來研究的熱點(diǎn)。