孟令杰，孔慶宏，姜 念，呂慧婧，黎成錦，郭朝霞，劉 云，3*

（1.遵義醫(yī)科大學(xué)，貴州省普通高等學(xué)校特色藥物腫瘤防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563000； 2.遵義醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州 遵義 563000； 3.遵義醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，貴州 遵義 563000）

蟾蜍屬動(dòng)物有250 多種，分布于世界各地，我國(guó)有近10 種，主要有大蟾蜍華西亞種Bufobufo andrewsiSchmidt、大蟾蜍中華亞種Bufobufo gargarizansCantor 以及黑眶蟾蜍BufomelanostitusSchneider 三種［1］。其中，蟾皮為中華大蟾蜍和黑眶蟾蜍除去內(nèi)臟的干燥皮，是臨床常用中藥，具有清熱解毒、利水消腫的功效［2］?！侗静菥V目》 中記載蟾蜍皮主治惡瘡、破癥結(jié)、腫毒、腸頭挺出和一切惡腫［3］。我國(guó)民間多用蟾皮治療原發(fā)性肝癌、肺癌等，特別是以干蟾皮為原料制成的華蟾素注射液抗癌效果顯著，例如給癌癥晚期患者靜脈滴注華蟾素注射液，在沒(méi)有顯著不良事件或疾病進(jìn)展的情況下，40%患者病情平穩(wěn)或顯示出輕微的腫瘤體積收縮［4-5］。現(xiàn)代醫(yī)藥學(xué)研究表明，蟾皮具有抗腫瘤、強(qiáng)心等作用［6-8］，其化學(xué)成分主要包括蟾蜍甾烯類、生物堿類［9-14］。為進(jìn)一步完善蟾皮的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，本研究采用多種色譜學(xué)方法和波譜學(xué)技術(shù)對(duì)中華大蟾蜍皮95%乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部位進(jìn)行研究，從中發(fā)現(xiàn)1 個(gè)結(jié)構(gòu)新穎且具有顯著抗結(jié)腸癌活性的蟾蜍甾烯類化合物。

1 材料

Bruker AVANCE-500 MHz NMR 核磁共振波譜儀（德國(guó)Bruker 公司）； Agilent 1260/6120 液質(zhì)聯(lián)用-單四極桿質(zhì)譜儀（美國(guó)Aglient 公司）； LCMSIT-TOF 質(zhì)譜儀（日本島津公司）； GX-281 全自動(dòng)制備液相色譜（法國(guó)Gilson 公司）； 半制備HPLC色譜柱（10 mm×250 mm，5 μm，sunfire C18，美國(guó)Waters 公司）； 制備型HPLC 色譜柱［30 mm×150 mm，5 μm，XB-C8，月旭科技（上海） 股份有限公司］； 中壓制備液相色譜系統(tǒng) （瑞士Buchi 公司）； N1200 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 （日本EYELA 公司）；Sephadex LH-20 凝膠（美國(guó)GE 公司）； DLK-5010快速低溫冷卻循環(huán)機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）； SHZ-D （Ⅲ） 循環(huán)水式多用真空泵（河南予華儀器有限公司）； BS-100A 自動(dòng)部分收集器（上海滬西電器有限公司）； SpectraMAX i3x 多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Molecular Devices 公司）； 200 ～300目柱層析硅膠、GF254薄層板（青島海洋化工有限公司）。中華大蟾蜍皮購(gòu)自河北安國(guó)藥材市場(chǎng)，經(jīng)遵義醫(yī)科大學(xué)宋長(zhǎng)偉博士鑒定為中華大蟾蜍BufobufogargarizansCantor 的干燥皮。

人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116、HT-29 （上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司）； 五氟尿嘧啶（5-FU，上海麥克林生化科技股份有限公司）； 胎牛血清（以色列BI 公司）； PBS （北京索萊寶公司）； SRB、DMSO （美國(guó)Sigma 公司）。

2 提取與分離

取中華大蟾蜍皮20 kg 粉碎，95%乙醇20 L 加熱回流提取3 次，每次2 h，合并提取液，減壓濃縮得浸膏1 kg，將浸膏加水混懸至5 000 mL，依次用石油醚、乙酸乙酯進(jìn)行萃取，減壓濃縮后得石油醚部位（95 g） 和乙酸乙酯部位（220 g）。

取乙酸乙酯部位200 g，經(jīng)硅膠柱分離，以石油醚-乙酸乙酯（1 ∶0 ～0 ∶1） 梯度洗脫，得到Fr.1～Fr.16。Fr.12 （26 g） 經(jīng)ODS 柱分離，以甲醇-水（1 ∶1 ～1 ∶0） 梯度洗脫，得到Fr.12.1 ～Fr.12.6。Fr.12.3 （2.8 g） 經(jīng)制備HPLC 純化，以甲醇-水（3 ∶7 ～1 ∶0） 梯度洗脫 （體積流量8 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm），得到Fr.12.3.1 ～Fr.12.3.6。Fr.12.3.2 （1.3 g） 經(jīng)Sephadex LH-20柱分離，以二氯甲烷-甲醇 （1 ∶1） 洗脫，得到Fr.12.3.2.1～Fr.12.3.2.4。Fr.12.3.2.1 （18 mg）經(jīng)半制備HPLC 純化，以24% 乙腈洗脫（體積流量2.5 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm），得到化合物1（3.7 mg，tR＝88 min）； Fr.12.3.2.4 （32 mg） 經(jīng)反相半制備HPLC 純化，以25% 乙腈洗脫（體積流量2 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm），得到化合物5（0.7 mg，tR＝75 min）、4 （1.8 mg，tR＝80 min）。Fr.10 （14.8 g） 經(jīng)Sephadex LH-20 柱分離，以甲醇洗脫，得到 Fr.10.1 ～ Fr.10.10。Fr.10.4（2.5 g） 經(jīng)硅膠柱分離，以二氯甲烷-甲醇（1 ∶0～0 ∶1） 梯度洗脫，得到Fr.10.4.1 ～Fr.10.4.6。Fr.10.4.4 （1.1 g） 經(jīng)ODS 柱分離，以甲醇-水（4 ∶6～1 ∶ 0） 梯度洗脫，得到Fr.10.4.4.1 ～Fr.10.4.4.6。Fr.10.4.4.1 （58 mg） 經(jīng)制備HPLC純化，以54%甲醇洗脫（體積流量5 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm），得到化合物2 （1.9 mg，tR＝101 min）； Fr.10.4.4.3 經(jīng)制備HPLC 純化，以55%甲醇洗脫（體積流量5 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm），得到化合物3 （1.9 mg，tR＝101 min）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1： 白色無(wú)定型粉末，ESI-MSm/z：481 ［M+Na］+，939 ［2M+Na］+，HR-ESI-MSm/z：481.219 5 ［M+Na］+，分子式C26H34O7。［α］20D+10.8 （c1.0，CH3OH）； UV （CH3OH）λmaxlog 203 （3.47），212 （2.45），294 （2.75） nm；3 414，3 082，2 925，1 725，1 633，1 536，1 430，1 378，1 266，1 123，1 044，954，789，615 cm-1。1H-NMR、13C-NMR 譜顯示結(jié)構(gòu)中存在1個(gè)六元不飽和內(nèi)酯環(huán) ［δH7.36 （brs，H-21），8.01 （brd，J＝9.8 Hz，H-22），6.23 （d，J＝9.8 Hz，H-23）；δC118.3 （C-20），153.5 （C-21），150.8 （C-22），114.1 （C-23），164.0 （C-24）］；2 個(gè)角甲基 ［δH0.81 （s，H-18），δC17.4；δH0.91 （s，H-19），δC16.6］； 3 個(gè)連氧次甲基［δH3.93 （s，H-2），δC68.3；δH3.75 （d，J＝1.2 Hz，H-15），δC60.8；δH5.47 （dd，J＝9.4，1.2 Hz，H-16），δC76.5］； 2 個(gè)連氧季碳 ［δC75.6（C-5），73.5 （C-14）］； 1 個(gè)乙?；?［δH1.85（s，H-26），δC20.3 （C-26），171.6 （C-25）］。根據(jù)以上信息，結(jié)合前期從蟾皮中分離鑒定化合物的情況［15-18］，初步推斷化合物1 具有蟾蜍甾烯母核。在HMBC 譜中，可觀察到H-1 與C-2，H-2 與C-3，H-3 與C-5，H-19 與C-1、C-5 的相關(guān)信號(hào)，表明2 個(gè)羥基分別位于C-2、C-5 位； 同時(shí)，HMBC譜還顯示H-8 與C-13、C-14，H-15 與C-14、C-17，H-18 與C-12、C-13、C-17 的相關(guān)信號(hào)，提示結(jié)構(gòu)中存在14β，15β-環(huán)氧片段； 此外，H-16 與C-20、C-25，H-26 與C-25 的相關(guān)信號(hào)確定乙?；挝挥贑-16 位。綜上所述，化合物1 的平面結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。在NOESY 譜中，可觀察到H-2 與H-4b，H-9與H-2，H-7b、H-17、H-7b 與H-15、H-16 的相關(guān)信號(hào)，提示上述質(zhì)子均為α 構(gòu)型； 同時(shí)可觀察到H-8 與H-18、H-19 的相關(guān)信號(hào)，提示上述質(zhì)子為β 構(gòu)型。見(jiàn)表1、圖2。確定化合物1 為 （2β，5β，14β，15β，16β） -2，15-二羥基-14，15-環(huán)氧-16-乙酰基-蟾蜍甾-20，22-二烯。

表1 化合物1 的1H-NMR、13C-NMR 數(shù)據(jù)Tab.1 1H-NMR and 13C-NMR datas of compound 1

圖1 化合物1 的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of compound 1

圖2 化合物1 的1H-1HCOSY、HMBC、NOESY 相關(guān)譜圖Fig.2 1H-1HCOSY，HMBC，NOESY correlation spectra of compound 1

化合物2： 白色無(wú)定形粉末，ESI-MSm/z：403.3 ［M+H］+。1H-NMR （500 MHz，CD3OD）δ：7.98 （1H，dd，J＝9.7，2.6 Hz，H-22），7.41（1H，d，J＝2.6 Hz，H-21），6.27 （1H，d，J＝9.7 Hz，H-23），4.12 （ 1H，m，H-3），3.76（1H，m，H-3），2.53 （1H，dd，J＝9.5，6.0 Hz，H-17），1.07 （3H，s，19-CH3），0.70 （3H，s，18-CH3）；13C-NMR （150 MHz，CD3OD）δ：164.8 （C-24），150.5 （C-21），149.3 （C-22），125.0 （C-20），115.4 （C-23），86.0 （C-14），74.8 （C-1），69.4 （C-3），52.2 （C-17），49.6（C-13），43.1 （C-8），41.7 （C-12），41.2 （C-10），38.7 （C-9），34.3 （C-4），33.1 （C-15），33.0 （C-2），31.8 （C-5），29.8 （C-16），27.4（C-6），22.5 （C-7），22.2 （C-11），19.4 （C-19），17.3 （C-18）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［19］ 報(bào)道基本一致，故鑒定為1β-羥基蟾毒靈。

化合物3： 白色無(wú)定形粉末，ESI-MSm/z：401.3 ［M+H］+。1H-NMR （500 MHz，CD3OD）δ：9.58 （1H，m，H-19），8.02 （1H，dd，J＝9.6，2.6 Hz，H-22），7.45 （1H，d，J＝2.6 Hz，H-21），6.30 （1H，d，J＝9.6 Hz，H-23），4.11（1H，m，H-3），3.76 （1H，m，H-3），2.58（1H，dd，J＝9.5，6.5 Hz，H-17），0.70 （3H，s，18-CH3）；13C-NMR （150 MHz，CD3OD）δ：208.1 （C-19），164.8 （C-24），150.5 （C-21），149.4 （C-22），125.0 （C-20），115.4 （C-23），85.7 （C-14），66.5 （C-3），52.3 （C-17），52.1（C-10），49.7 （C-13），43.3 （C-8），41.8 （C-12），36.0 （C-9），33.2 （C-4），32.6 （C-15），30.4 （C-5），29.7 （C-16），29.3 （C-6），27.0（C-2），22.5 （C-7），22.2 （C-1），22.2 （C-11），17.1 （C-18）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［20］ 報(bào)道基本一致，故鑒定為19-oxobufalin。

化合物4： 白色無(wú)定形粉末，ESI-MSm/z：413.3 ［M-H］-。1H-NMR （500 MHz，CD3OD）δ：7.95 （1H，dd，J＝9.6，2.6 Hz，H-22），7.59（1H，d，J＝2.6 Hz，H-21），6.30 （1H，d，J＝9.6 Hz，H-23），3.80 （1H，dd，J＝9.7，6.1 Hz，H-17），3.60 （1H，m，H-3），2.78 （1H，dd，J＝12.7，5.4 Hz，H-17），1.20 （3H，s，19-CH3），0.77 （3H，s，18-CH3）；13C-NMR （150 MHz，CD3OD）δ： 201.9 （ C-12），164.5 （ C-24），151.8 （C-21），149.1 （C-22），142.6 （C-11），132.9 （C-9），123.2 （C-20），115.7 （C-23），83.6 （C-14），71.6 （C-3），60.5 （C-13），45.2 （C-17），44.3 （C-5），42.5 （C-10），41.1（C-8），39.8 （C-4），39.2 （C-1），35.3 （C-2），34.0 （C-15），29.0 （C-16），28.7 （C-19），27.4（C-6），22.7 （C-7），16.7 （C-18）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［8］ 報(bào)道基本一致，故鑒定為 （3α，5β，14β） -3，11，14-trihydroxy-12-oxo-bufa-9 （11），20，22-trienolide。

化合物5： 白色無(wú)定形粉末，ESI-MSm/z：423.1 ［M+Na］+。1H-NMR （500 MHz，CD3OD）δ：7.60 （1H，dd，J＝9.2，2.6 Hz，H-22），7.58（1H，brs，H-21），6.35 （1H，d，J＝9.2 Hz，H-23），4.96 （1H，m，H-16），4.10 （1H，m，H-3），2.55 （1H，d，J＝8.2 Hz，H-17），2.18（1H，d，J＝3.2 Hz，H-4a），2.15 （1H，m，H-6a），1.80 （1H，m，H-6b），1.50 （1H，m，H-4b），0.95 （3H，s，19-CH3），0.83 （3H，s，18-CH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［11］ 報(bào)道基本一致，故鑒定為（3β，5β，16α） -3，5，16-trihydroxy-bufa-14，20，22-trienolide。

4 細(xì)胞毒活性評(píng)價(jià)

以五氟尿嘧啶（5-FU） 為陽(yáng)性對(duì)照，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116、HT-29，以每孔8×103個(gè)的密度接種至96 孔板中，在5% CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)24 h 后取出，分別加入含供試藥物的培養(yǎng)液200 μL 繼續(xù)培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，加入預(yù)冷的10%TCA，4 ℃固定2 h，棄去TCA 固定液，用去離子水洗板5 次，甩盡多余的液體，室溫晾干，每孔加入100 μL 0.4% SRB 染料，室溫靜置20 min，用0.1%醋酸溶液洗去未與細(xì)胞蛋白結(jié)合的SRB 染料，共5 次，室溫晾干，每孔加入100 μL 10 mmol/L Tris 緩沖液，使其充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上檢測(cè)，計(jì)算IC50值，結(jié)果見(jiàn)表2。由此可知，化合物1～4 對(duì)HCT-116、HT-29 細(xì)胞具有增殖抑制作用（P＜0.05）。

表2 各化合物細(xì)胞毒活性比較（±s，n＝3）Tab.2 Comparison of cytotoxic effects of various compounds （±s，n＝3）

表2 各化合物細(xì)胞毒活性比較（±s，n＝3）Tab.2 Comparison of cytotoxic effects of various compounds （±s，n＝3）

注： 與5-FU 比較，＃P＜0.05。

化合物IC50/（μmol·L-1）HCT-116HT-29 1 2.67±2.14＃9.80±3.29＃2 0.08±0.03＃1.17±0.99＃3 0.36±0.07＃0.24±0.11＃4 2.11±0.10＃0.45±0.13＃5-FU32.23±26.1818.38±4.21

5 討論

本研究從中華大蟾蜍皮中分離鑒定了1 個(gè)新的蟾蜍甾烯類化合物（化合物1） 以及4 個(gè)已知類似物（化合物2～5）。由于樣品量所限，對(duì)化合物1～4 進(jìn)行了初步的藥效學(xué)評(píng)價(jià)，結(jié)果表明化合物1 ～4均對(duì)結(jié)腸癌HCT-116 和HT-29 細(xì)胞具有顯著的增殖抑制作用，且效應(yīng)強(qiáng)于5-FU。本研究結(jié)果進(jìn)一步豐富了蟾蜍類藥材化學(xué)成分的多樣性，為構(gòu)效關(guān)系的探討提供了證據(jù)。同時(shí)，蟾皮化學(xué)成分豐富，其中的微量化學(xué)成分有待進(jìn)一步研究。