周 群，高思琦，張霖璋，張 華，劉 偉，劉 平*，陳佳美*

（1.上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院，上海市中醫(yī)藥研究院肝病研究所，肝腎疾病病證教育部重點實驗室，上海市中醫(yī)臨床重點實驗室，上海 201203； 2.上海中醫(yī)藥大學交叉科學研究院，上海市中醫(yī)藥化學生物學前沿基地，上海 201203）

肝纖維化是多種慢性肝臟疾病的共同病理過程，慢性肝炎病毒感染、酒精和膽汁淤積等長期損害均可導致肝纖維化的進展，最終發(fā)展為肝硬化和肝癌［1］。膽汁淤積性肝纖維化是由于肝細胞或毛細膽管中膽汁流合成、分泌和排泄異常，肝內(nèi)或肝外膽管阻塞，誘發(fā)持續(xù)性膽汁淤積所致［2］。目前用于治療膽汁淤積性肝纖維化的藥物為熊去氧膽酸和奧貝膽酸，但均面臨部分患者療效不佳和較高的不良事件發(fā)生率等問題［3-4］。因此，探求膽汁淤積性肝纖維化的有效治療手段，阻止疾病的進程，是當前研究需攻克的主要目標和方向。

中醫(yī)藥以其多靶點、多途徑、多層次的藥理作用，在肝纖維化治療領(lǐng)域展現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，黃芪湯及其有效組分黃芪總苷具有良好的抗肝纖維化作用，可通過抑制肝星狀細胞（hepatic stellate cell，HSC） 活化［5］、抑制轉(zhuǎn)化生長因子β （transforming growth factor β，TGF-β） 和Notch 信號通路的活化［6-7］，改善膽管結(jié)扎和二甲基亞硝胺誘導的肝纖維化大鼠血清肝功能異常變化和肝纖維化程度［8-10］。本研究通過建立外源性和內(nèi)源性的膽汁淤積性肝纖維化小鼠模型——化合物3，5-二乙氧基羰基-1，4-二氫-2，4，6-三甲基吡啶 （3，5-diethoxycarbonyl-1，4-dihydro-2，4，6-collidine，DDC） 喂養(yǎng)和多藥耐藥蛋白2 （multidrug resistance protein 2，Mdr2） 基因敲除，觀察黃芪總苷對膽汁淤積性肝纖維化的干預(yù)作用，并探索其部分作用機制。

1 材料

1.1 動物 SPF 級雄性C57BL/6 小鼠，體質(zhì)量（22±2） g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司［實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK （滬） 2017-0011］； SPF 級雄性Mdr2-/-小鼠，體質(zhì)量（22±2）g，購自賽業(yè)模式生物研究中心（太倉） 有限公司［實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK （蘇） 2018-0003］。所有小鼠均飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學動物實驗中心，恒溫恒濕，晝夜節(jié)律，環(huán)境溫度22 ～24 ℃，相對濕度30% ～60%，自由進食飲水。動物實驗經(jīng)上海中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會批準 （倫理號PZSHUTCM200731007）。

1.2 藥物與試劑 DDC （美國Sigma-Aldrich 公司，貨號137030）； 黃芪總苷（本課題組采用大孔樹脂柱層析法制備，乙醇回流提取2 次，濃縮干燥所得）； 奧貝膽酸（大連美侖生物技術(shù)有限公司，貨號 MB6084）。丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 （alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、總膽紅素 （total bilirubin，TBIL）、直接膽紅素 （direct bilirubin，DBIL）、間接膽紅素（indirect bilirubin，IBIL） 生化檢測試劑盒（美國貝克曼庫爾特公司，批號AUZ7214、AUZ7031、AUZ7121、AUZ7101、AUZ7103、AUZ7105）； 總膽汁酸生化檢測試劑盒（上海執(zhí)誠生物科技有限公司，批號ZCFEBT009）； 蘇木素-伊紅染色試劑盒（南京建成生物工程研究所，貨號D006-1-4）； 免疫組化試劑盒［基因科技（上海） 有限公司，貨號GK500705］； 總RNA 提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green Real Time PCR Master Mix （日本TOYOBO 公司，貨號NPK-201、FSQ-301、QPK-201）； RIPA 裂解液、蛋白蛋白酶磷酸酶抑制劑混合物、BCA 蛋白濃度測定試劑盒、30% 丙烯酰胺溶液、Tris-HCl 溶液 （pH 6.8）、Tris-HCl 溶液（pH 8.8）、BSA、一抗稀釋液、10%SDS、過硫酸銨（APS）、5×蛋白上樣緩沖液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號P0013B、P1045、P0010、ST003、ST768、ST789、ST023、P0256、ST628、ST005、P0015）； 預(yù)染蛋白Marker（美國Thermo Fisher Scientific 公司，貨號26616）；GAPDH 抗體（美國Proteintech 公司，貨號60004-1-Ig）； α-平滑肌肌動蛋白 （alpha smooth muscle actin，α-SMA）、沉默信息調(diào)節(jié)因子1 （silent information regulator 1，SIRT1） 抗體（英國Abcam公司，貨號 Ab124964、Ab110304）； I 型膠原（collagen type I alpha 1，Col1a1） 抗體（武漢愛博泰克生物科技有限公司，貨號A1352）。聚合酶鏈式反應(yīng)引物由生工生物工程（上海） 股份有限公司合成，引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.3 儀器 Synchron DXC800 型全自動生化分析儀（美國貝克曼庫爾特公司）； JXFSTPRP-24 型全自動快速研磨儀（上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司）；F200 PRO 型酶標儀（瑞士Tecan 公司）； Vii7 型PCR 儀（美國ABI 公司）； 041BR127719 型電泳儀及轉(zhuǎn)膜儀、Thermal Cyxler 型cDNA 逆轉(zhuǎn)錄儀（美國Bio-Rad 公司）； Odyssey CLX 型雙色紅外熒光成像系統(tǒng)（美國LI-COR 公司）； ASP300 型封閉式組織脫水機、EG1160 型組織包埋機、RM2035 型石蠟切片機、HI1220 型組織病理學用烘片儀、SCN400 型數(shù)據(jù)切片掃描機（德國Leica 公司）。

2 方法

2.1 分組、造模及給藥 8 周齡雄性C57BL/6 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)后，按體質(zhì)量隨機分成對照組、模型組、黃芪總苷112 mg/kg 組、黃芪總苷56 mg/kg 組和奧貝膽酸（10 mg/kg） 組，每組8 只。對照組給予常規(guī)飼料喂養(yǎng)，其余組給予0.1% DDC 喂養(yǎng)8 周，第5周起各組按相應(yīng)給藥劑量每天灌胃給藥1 次，連續(xù)4周，對照組和模型組灌胃給予等體積蒸餾水。

8 周齡雄性Mdr2-/-小鼠按體質(zhì)量隨機分成模型組、黃芪總苷56 mg/kg 組、黃芪總苷28 mg/kg組和奧貝膽酸（10 mg/kg） 組，以同窩雄性野生型為對照組，每組8 只。各組按相應(yīng)給藥劑量每天灌胃給藥1 次，連續(xù)3 周，對照組和模型組灌胃給予等體積蒸餾水。

取材前12 h 小鼠禁食不禁水，取材當日以3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，經(jīng)腹主動脈采集血液，靜置3 h，3 000 r/min 離心15 min （離心半徑10 cm） 獲取血清，并收集肝組織樣本用于后續(xù)檢測。

2.2 血清生化指標檢測 血清生化指標由上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院檢驗科協(xié)助檢測，檢測ALT、AST、ALP 活性及TBA、TBIL、DBIL、IBIL水平。

2.3 肝組織病理學染色及觀察 取材當日留取肝臟大葉同一部位，于10%中性甲醛緩沖液中固定，封閉式組織脫水機自動脫水，組織包埋機石蠟包埋，切片，分別行蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE） 染色和天狼猩紅（sirus red，SR） 染色，封片后用數(shù)字切片掃描機自動掃描，觀察肝細胞損傷、纖維化程度等。

2.4 免疫組化染色觀察肝組織α-SMA 和Col1a1表達 肝組織石蠟切片充分脫蠟至水，微波抗原修復(fù)，滴加3%過氧化氫溶液室溫避光孵育15 min 以消除內(nèi)源性過氧化物酶，滴加10% 山羊血清封閉30 min 以清除非特異性背景染色，滴加一抗（α-SMA、Col1a1，稀釋比例1 ∶1 000、1 ∶200） 4 ℃過夜，次日PBS 洗滌3 次，滴加二抗37 ℃孵育30 min，辣根過氧化物酶顯色，蘇木素染核，梯度乙醇脫水，二甲苯透明后用中性樹膠封片，數(shù)字切片掃描機自動掃描，觀察肝組織α-SMA 和Col1a1表達。

2.5 RT-qPCR 法檢測肝組織α-SMA、Col1a1、Col4a1、TGF-β1 mRNA 表達 稱取約30 mg 肝組織，提取總RNA 后測定其濃度，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后進行擴增反應(yīng)。反應(yīng)體系為5 μL SYBR PCR Master Mix、3.6 μL DEPC、0.2 μL 正向引物、0.2 μL 反向引物； 反應(yīng)條件為50 ℃2 min，95 ℃1 min、95 ℃變性15 s、60 ℃延伸退火1 min，擴增45 個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計算目的基因mRNA 相對表達量。

2.6 Western blot 法檢測肝組織α-SMA、SIRT1 蛋白表達 稱取約30 mg 肝組織，加入600 μL 含蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA 裂解液，勻漿后離心取上清液，即得總蛋白，根據(jù)BCA 蛋白濃度測定試劑盒說明書測定總蛋白濃度，制備上樣緩沖液。蛋白樣本經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至膜，5% BSA 封閉后孵育一抗α-SMA （1 ∶1 000）、SIRT1 （1 ∶ 1 000）、GAPDH （1 ∶5 000），洗膜后孵育二抗，ECL 法顯影，使用Odyssey 紅外熒光成像系統(tǒng)掃膜，獲取蛋白條帶圖片，通過Image J 軟件分析條帶的灰度值。

2.7 統(tǒng)計學分析 通過SPSS 26.0 軟件進行處理，計量資料以（±s） 表示，若數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布且方差齊性，組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用最小顯著差數(shù)法LSD-t檢驗； 若數(shù)據(jù)呈非正態(tài)分布或方差不齊，則采用非參數(shù)檢驗。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 黃芪總苷對膽汁淤積性肝纖維化小鼠肝質(zhì)量和肝臟系數(shù)的影響 與同期對照組比較，DDC 模型組小鼠肝質(zhì)量與肝臟系數(shù)均升高（P＜0.01）； 與DDC 模型組比較，黃芪總苷56 mg/kg 和奧貝膽酸組小鼠肝質(zhì)量與肝臟系數(shù)均降低（P＜0.05），見表2。

表2 黃芪總苷對DDC 模型小鼠肝質(zhì)量和肝臟系數(shù)的影響（±s，n＝8）Tab.2 Effects of astragalosides on liver weight and liver index level in DDC-treated mouse models （±s，n＝8）

表2 黃芪總苷對DDC 模型小鼠肝質(zhì)量和肝臟系數(shù)的影響（±s，n＝8）Tab.2 Effects of astragalosides on liver weight and liver index level in DDC-treated mouse models （±s，n＝8）

注： 與同期對照組比較，**P＜0.01； 與模型組比較，＃P＜0.05。

組別劑量/（mg·kg-1）肝質(zhì)量/g肝臟系數(shù)/%對照組—1.10±0.044.38±0.28模型組—3.08±0.23** 12.90±0.62**黃芪總苷組1122.90±0.1612.07±0.29 562.72±0.54＃11.52±1.28＃奧貝膽酸組102.75±0.19＃11.77±0.45＃

與同期對照組比較，Mdr2-/-模型組小鼠肝質(zhì)量與肝臟系數(shù)均升高（P＜0.01）； 與Mdr2-/-模型組比較，黃芪總苷56 mg/kg 組小鼠肝質(zhì)量與肝臟系數(shù)均降低（P＜0.01），黃芪總苷28 mg/kg 組小鼠肝質(zhì)量降低（P＜0.05），見表3。

表3 黃芪總苷對Mdr2-/-模型小鼠肝質(zhì)量和肝臟系數(shù)的影響（±s，n＝8）Tab.3 Effects of astragalosides on liver weight and liver index level in Mdr2-/- mouse models （±s，n＝8）

表3 黃芪總苷對Mdr2-/-模型小鼠肝質(zhì)量和肝臟系數(shù)的影響（±s，n＝8）Tab.3 Effects of astragalosides on liver weight and liver index level in Mdr2-/- mouse models （±s，n＝8）

注： 與同期對照組比較，**P＜0.01； 與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

組別劑量/（mg·kg-1）肝質(zhì)量/g肝臟系數(shù)/%對照組—1.01±0.084.19±0.24模型組—1.61±0.07**6.46±0.35**黃芪總苷組561.44±0.06＃＃5.69±0.31＃＃281.52±0.06＃6.13±0.25奧貝膽酸組101.65±0.076.46±0.30

3.2 黃芪總苷對膽汁淤積性肝纖維化小鼠血清肝功能的影響 與同期對照組比較，DDC 模型組小鼠血清 ALT、AST、ALP 活性和 TBA、TBIL、DBIL、IBIL 水平均升高（P＜0.01）； 與DDC 模型組比較，黃芪總苷56 mg/kg 組和奧貝膽酸組小鼠血清ALT、AST、ALP 活性和TBA、TBIL、DBIL、IBIL 水平均降低（P＜0.05，P＜0.01），黃芪總苷112 mg/kg 組小鼠血清ALP 活性和TBA、TBIL、DBIL、IBIL 水平降低（P＜0.05），見表4～5。

表4 黃芪總苷對DDC 模型小鼠血清ALT、AST、ALP 活性的影響（U/L，±s，n＝8）Tab.4 Effects of astragalosides on serum ALT，AST and ALP activities in DDC-treated mouse models （U/L，±s，n＝8）

表4 黃芪總苷對DDC 模型小鼠血清ALT、AST、ALP 活性的影響（U/L，±s，n＝8）Tab.4 Effects of astragalosides on serum ALT，AST and ALP activities in DDC-treated mouse models （U/L，±s，n＝8）

注： 與同期對照組比較，**P＜0.01； 與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

組別劑量/（mg·kg-1）ALTASTALP對照組—31.57±6.50136.57±24.4935.43±6.37模型組—966.33±89.48**541.83±50.21**246.17±65.99**黃芪總苷組112870.00±104.21484.67±68.47178.00±19.05＃56807.67±74.30＃＃440.17±78.92＃162.17±9.20＃奧貝膽酸組10685.67±76.97＃＃371.83±40.08＃＃153.00±18.12＃＃

表5 黃芪總苷對DDC 模型小鼠血清TBA、TBIL、DBIL 和IBIL 水平的影響（μmol/L，±s，n＝8）Tab.5 Effects of astragalosides on serum TBA，TBIL，DBIL and IBIL levels in DDC-treated mouse models （μmol/L，±s，n＝8）

表5 黃芪總苷對DDC 模型小鼠血清TBA、TBIL、DBIL 和IBIL 水平的影響（μmol/L，±s，n＝8）Tab.5 Effects of astragalosides on serum TBA，TBIL，DBIL and IBIL levels in DDC-treated mouse models （μmol/L，±s，n＝8）

注： 與同期對照組比較，**P＜0.01； 與模型組比較，＃＃P＜0.01。

組別劑量/（mg·kg-1）TBATBILDBILIBIL對照組—1.08±0.151.05±0.170.23±0.050.83±0.21模型組—119.58±51.19**50.03±37.05**32.77±24.71**17.30±12.37**黃芪總苷組11218.28±3.92＃＃3.26±3.43＃＃1.29±1.80＃＃1.71±1.49＃＃5616.18±2.71＃＃1.98±0.74＃＃0.85±0.35＃＃1.13±0.42＃＃奧貝膽酸組1012.82±9.21＃＃1.84±0.73＃＃0.81±0.84＃＃1.15±0.33＃＃

與同期對照組比較，Mdr2-/-模型組小鼠血清ALT、AST、ALP 活性和TBA、TBIL、DBIL 和IBIL水平均升高（P＜0.01）； 與Mdr2-/-模型組比較，黃芪總苷56 mg/kg 組小鼠血清ALT、AST、ALP活性和IBIL 水平降低（P＜0.05，P＜0.01），黃芪總苷28 mg/kg 組小鼠血清ALP 活性降低 （P＜0.05），奧貝膽酸組小鼠血清ALP 活性和TBA 水平降低（P＜0.05），見表6～7。

表6 黃芪總苷對Mdr2-/-模型小鼠血清ALT、AST 和ALP 活性的影響（U/L，±s，n＝8）Tab.6 Effects of astragalosides on serum ALT，AST and ALP activities in Mdr2-/- mouse models （U/L，±s，n＝8）

表6 黃芪總苷對Mdr2-/-模型小鼠血清ALT、AST 和ALP 活性的影響（U/L，±s，n＝8）Tab.6 Effects of astragalosides on serum ALT，AST and ALP activities in Mdr2-/- mouse models （U/L，±s，n＝8）

注： 與同期對照組比較，**P＜0.01； 與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

組別劑量/（mg·kg-1）ALTASTALP對照組—40.71±10.37127.86±21.21104.57±11.01模型組—279.17±125.75**429.00±242.21**171.00±21.14**黃芪總苷組56165.43±58.06＃217.57±83.37＃126.86±16.48＃＃28193.14±30.81271.00±24.72141.00±18.08＃奧貝膽酸組10212.33±94.93293.50±62.44139.67±43.33＃

表7 黃芪總苷對Mdr2-/-模型小鼠血清TBA、TBIL、DBIL 和IBIL 水平的影響（μmol/L，±s，n＝8）Tab.7 Effects of astragalosides on serum TBA，TBIL，DBIL and IBIL levels in Mdr2-/- mouse models （μmol/L，±s，n＝8）

表7 黃芪總苷對Mdr2-/-模型小鼠血清TBA、TBIL、DBIL 和IBIL 水平的影響（μmol/L，±s，n＝8）Tab.7 Effects of astragalosides on serum TBA，TBIL，DBIL and IBIL levels in Mdr2-/- mouse models （μmol/L，±s，n＝8）

注： 與同期對照組比較，**P＜0.01； 與模型組比較，＃P＜0.05。

組別劑量/（mg·kg-1）TBATBILDBILIBIL對照組—0.87±0.422.30±0.180.29±0.072.01±0.13模型組—19.37±13.27**4.50±1.63**1.05±0.81**3.47±0.82**黃芪總苷組569.85±4.043.40±0.770.79±0.272.51±0.62＃2813.08±3.273.93±0.510.96±0.353.09±0.36奧貝膽酸組105.11±2.45＃3.44±1.140.72±0.272.66±0.81

3.3 黃芪總苷對膽汁淤積性肝纖維化小鼠肝組織病理學變化及膠原沉積的影響 肝組織HE 染色可見同期對照組小鼠肝組織小葉結(jié)構(gòu)清晰，匯管區(qū)及中央靜脈無擴大，未見炎性細胞浸潤； DDC 模型組可見肝組織結(jié)構(gòu)紊亂，含有廣泛的卟啉沉積物，大量膽管上皮細胞異常增生，節(jié)段性膽管堵塞，炎性細胞浸潤； 黃芪總苷各劑量組和奧貝膽酸組病理變化均有不同程度減輕，肝臟損傷明顯改善。SR染色結(jié)果顯示，與同期對照組比較，DDC 模型組可見匯管區(qū)膠原纖維大量沉積，纖維間隔明顯，陽性著色較深，肝組織膠原陽性面積和HYP 水平均增加（P＜0.01）； 與DDC 模型組比較，黃芪總苷各劑量組和奧貝膽酸組陽性染色均有不同程度減少，膠原纖維變細，肝組織膠原陽性面積和HYP水平均降低（P＜0.05，P＜0.01），見圖1。

圖1 黃芪總苷對DDC 模型小鼠肝組織病理學變化及膠原沉積的影響（±s，n＝8）Fig.1 Effects of astragalosides on hepatic pathological changes and collagen deposition in DDC-treated mouse models （±s，n＝8）

肝組織HE 染色可見同期對照組小鼠肝組織小葉結(jié)構(gòu)清晰，匯管區(qū)及中央靜脈無擴大，未見炎性細胞浸潤； Mdr2-/-模型組肝組織可見大量炎性細胞浸潤，膽管上皮細胞異常增生，膽管周圍呈纖維化改變； 黃芪總苷各劑量組和奧貝膽酸組病理變化均有不同程度減輕，肝臟損傷明顯改善。SR 染色結(jié)果顯示，與同期對照組比較，Mdr2-/-模型組可見匯管區(qū)膠原纖維大量沉積，纖維間隔明顯，形成假小葉，肝組織膠原陽性面積和HYP 水平均增加（P＜0.01）； 與Mdr2-/-模型組比較，黃芪總苷各劑量組和奧貝膽酸組陽性染色均有不同程度減少，膠原纖維變細，黃芪總苷56 mg/kg 組膠原陽性面積和肝組織HYP 水平均降低（P＜0.05，P＜0.01），奧貝膽酸組肝組織HYP 水平降低（P＜0.05）。見圖2。

3.4 黃芪總苷對膽汁淤積性肝纖維化小鼠肝組織纖維化相關(guān)指標的影響 免疫組化染色結(jié)果顯示，與同期對照組比較，DDC 模型組小鼠肝組織α-SMA 和Col1a1 免疫組化陽性表達減少，α-SMA 蛋白及mRNA 表達、Col1a1 和Col4a1 mRNA 表達均升高（P＜0.01）； 與DDC 模型組比較，黃芪總苷各劑量組和奧貝膽酸組小鼠肝組織α-SMA 和Col1a1 免疫組化陽性表達增加，α-SMA、Col1a1 和Col4a1 mRNA 表達均降低（P＜0.01），黃芪總苷56 mg/kg 組和奧貝膽酸組小鼠肝組織α-SMA 蛋白降低（P＜0.01），見圖3。

圖3 黃芪總苷對DDC 模型小鼠肝組織纖維化相關(guān)指標的影響（×200，±s，n＝8）Fig.3 Effects of astragalosides on hepatic fibrosis related indicators in DDC-treated mouse models （×200，±s，n＝8）

免疫組化染色結(jié)果顯示，與同期對照組比較，Mdr2-/-模型組小鼠肝組織α-SMA 和Col1a1 免疫組化陽性表達、α-SMA 蛋白及mRNA 表達、Col1a1和Col4a1 mRNA 表達均升高 （P＜0.01）； 與Mdr2-/-模型組比較，黃芪總苷各劑量組和奧貝膽酸組小鼠肝組織α-SMA 和Col1a1 免疫組化陽性表達均減少，α-SMA、Col4a1 mRNA 表達均降低（P＜0.05，P＜0.01），黃芪總苷56 mg/kg 組小鼠肝組織Col1a1 mRNA 表達降低（P＜0.05），黃芪總苷56 mg/kg 組和奧貝膽酸組小鼠肝組織α-SMA 蛋白表達降低（P＜0.01），見圖4。

圖4 黃芪總苷對Mdr2-/-模型小鼠肝組織纖維化相關(guān)指標的影響（×200，±s，n＝8）Fig.4 Effects of astragalosides on hepatic fibrosis related indicators in Mdr2-/- mouse models （×200，±s，n＝8）

3.5 黃芪總苷對膽汁淤積性肝纖維化小鼠肝組織SIRT1 蛋白和TGF-β1 mRNA 表達的影響 與同期對照組比較，DDC 模型組小鼠肝組織SIRT1 蛋白表達降低（P＜0.01），TGF-β1 mRNA 表達升高（P＜0.01）； 與DDC 模型組比較，黃芪總苷56 mg/kg 組和奧貝膽酸組小鼠肝組織SIRT1 蛋白表達升高（P＜0.01），TGF-β1 mRNA 表達降低（P＜0.01），黃芪總苷112 mg/kg 組小鼠肝組織TGF-β1 mRNA表達降低（P＜0.01），見圖5。

圖5 黃芪總苷對DDC 模型小鼠肝組織SIRT1 蛋白和TGF-β1 mRNA 表達的影響（±s，n＝8）Fig.5 Effects of astragalosides on hepatic expressions of SIRT1 protein and TGF-β1 mRNA in DDCtreated mouse models （±s，n＝8）

與同期對照組比較，Mdr2-/-模型組小鼠肝組織SIRT1 蛋白表達降低（P＜0.01），TGF-β1 mRNA表達升高（P＜0.01）； 與Mdr2-/-模型組比較，黃芪總苷56 mg/kg 組和奧貝膽酸組小鼠肝組織SIRT1 蛋白表達升高 （P＜0.01），TGF-β1 mRNA表達降低（P＜0.01），黃芪總苷28 mg/kg 組小鼠肝組織TGF-β1 mRNA 表達降低（P＜0.01），見圖6。

圖6 黃芪總苷對Mdr2-/-模型小鼠肝組織SIRT1 蛋白和TGF-β1 mRNA 表達的影響（±s，n＝8）Fig.6 Effects of astragalosides on hepatic expressions of SIRT1 protein and TGF-β1 mRNA in Mdr2-/-mouse models （±s，n＝8）

4 討論

黃芪總苷是中藥黃芪的重要活性成分之一，具有抗炎、抗氧化、抗纖維化、免疫調(diào)節(jié)及多器官保護等多種藥理作用［11］。課題組前期研究表明，黃芪總苷可減輕膽管結(jié)扎、二甲基亞硝胺或四氯化碳誘導的肝纖維化，其作用機制與TGF-β1 和Notch信號通路有關(guān)［6-7，12］，其中160 mg/kg 黃芪總苷具有顯著療效?；诖?，通過實驗動物間的藥物等效劑量換算得到本研究DDC 模型小鼠給藥劑量為112 mg/kg，并設(shè)置56 mg/kg 的劑量以探索量效關(guān)系，結(jié)果提示56 mg/kg 黃芪總苷對DDC 模型小鼠的療效更佳。為了進一步證明56 mg/kg 黃芪總苷是否是抗膽汁淤積性肝纖維化的最佳劑量，在Mdr2-/-模型中設(shè)置了56、28 mg/kg 2 個劑量，結(jié)果顯示在Mdr2-/-模型小鼠中56 mg/kg 黃芪總苷同樣具有更顯著的藥效。以上結(jié)果提示56 mg/kg 黃芪總苷具有顯著的抗小鼠膽汁淤積性肝纖維化作用。

SIRT1 是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴的組蛋白去乙?；福哂懈叨缺Ｊ匦?，參與調(diào)節(jié)廣泛的生物學功能如轉(zhuǎn)錄、細胞周期、DNA 損傷修復(fù)、代謝、細胞凋亡和自噬［13］。近年來，SIRT1 在膽汁淤積性肝纖維化中的作用受到重視，認為其在HSC 活化和肝纖維化的過程中起著關(guān)鍵作用［14］。在肝纖維化動物模型、患者肝臟和活化的HSC 中均可觀察到SIRT1 表達的下調(diào)，而激活SIRT1 可阻斷HSC 活化，抑制肌成纖維細胞的轉(zhuǎn)分化［15］。SIRT1 可與TGF-β/Smad 信號通路上的Smad3 結(jié)合，使其去乙?；⒁种芓GF-β1 的轉(zhuǎn)錄活性，從而發(fā)揮抗纖維化作用［16］。體外研究也證實，用TGF-β1 刺激人肝星狀細胞系LX-2 細胞可導致SIRT1 蛋白表達下調(diào)，其過表達可降低α-SMA 和Col1a1 的表達，促進活化的LX-2 凋亡和向靜息態(tài)逆轉(zhuǎn)［17］。本研究結(jié)果顯示，與同期對照組比較，DDC 和Mdr2-/-模型小鼠肝組織中SIRT1 表達均被抑制，而黃芪總苷可改善這一異常表達，提示黃芪總苷可能通過上調(diào)SIRT1 表達發(fā)揮抗膽汁淤積性肝纖維化的作用。

小鼠喂養(yǎng)肝毒性化合物DDC 會導致膽管內(nèi)卟啉栓塞、膽道梗阻，從而造成慢性膽汁淤積，誘發(fā)肝纖維化［18-19］。Mdr2-/-小鼠由于體內(nèi)膽小管磷脂轉(zhuǎn)運體被靶向破壞，膽磷脂分泌障礙，膽汁中非膠束結(jié)合的游離膽汁酸濃度增加，高濃度膽汁酸滲漏到門脈中，誘發(fā)炎癥和膽管增生，最終導致膽管周圍纖維沉積［20-21］。本研究發(fā)現(xiàn)黃芪總苷可改善這2種膽汁淤積性肝纖維化模型小鼠肝組織病理變化，減少肝組織膠原陽性面積和HYP 水平，抑制肝組織α-SMA、Col1a1、Col4a1 和TGF-β1 的表達，以56 mg/kg 劑量效果更佳。

綜上所述，黃芪總苷可發(fā)揮抗膽汁淤積性肝纖維化的作用，其初步作用機制與促進SIRT1 表達，抑制下游TGF-β1 表達相關(guān)。