曹 瑞, 姜看文, 趙懿琛,2, 陸瑩霞, 彭 磊, 董 旋,2

(1.貴州大學(xué)茶學(xué)院, 貴陽 550025;2.山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新省部共建教育部重點實驗室, 貴陽 550025)

茶樹(Camelliasinensis)起源于中國西南部,是一種全球廣泛種植的經(jīng)濟(jì)作物。茶與咖啡、可可并稱為三大無酒精飲料,具有極高的經(jīng)濟(jì)價值[1]。因為茶樹主要生長于熱帶、亞熱帶和溫帶,且生性喜濕熱,所以在生長過程中不可避免地遭受外來因素的影響。而茶樹病害是對茶樹生產(chǎn)造成不良影響的重要因素之一,特別是我國作為全球最大的茶葉生產(chǎn)國[2],因為高密度種植和農(nóng)藥的濫用,已導(dǎo)致茶樹病害頻繁發(fā)生,每年導(dǎo)致茶葉產(chǎn)量損失達(dá)10%～20%[3]。當(dāng)前茶樹的病害主要采用化學(xué)藥劑進(jìn)行防治,但這種方法容易影響茶葉的品質(zhì),并且一些殘留的化學(xué)藥劑很容易造成食品安全隱患,同時也不利于茶葉進(jìn)出口貿(mào)易的發(fā)展,為解決這些問題,開發(fā)植物免疫激活劑、殺菌劑和殺蟲劑等高效低毒及環(huán)境友好的綠色農(nóng)藥,以推動茶產(chǎn)業(yè)向綠色健康發(fā)展。

幾丁質(zhì)酶是一種重要的植物病程相關(guān)蛋白。幾丁質(zhì)酶在植物中的抗真菌作用已在許多研究中得到證實[4-7],過表達(dá)幾丁質(zhì)酶編碼基因的轉(zhuǎn)基因植物對真菌和細(xì)菌病原體的抗性增強(qiáng)[8-11]。一些植物幾丁質(zhì)酶分別通過對幾丁質(zhì)和肽聚糖的裂解作用(溶菌酶作用)參與植物防御真菌和細(xì)菌病原體的機(jī)制[12-13],并顯示出對幾種植物病原真菌的體外抗真菌特性,單獨或與其他病程相關(guān)蛋白協(xié)同抑制孢子萌發(fā)和菌絲生長[14-16]。幾丁質(zhì)酶在生物技術(shù)應(yīng)用中具有巨大的潛力,例如在制備具有藥學(xué)重要性的甲殼低聚糖和N-乙?；鵇-葡萄糖胺方面,是有前途的抗菌劑、溶菌酶誘導(dǎo)劑和免疫增強(qiáng)劑;開發(fā)害蟲和病原體以及抗病轉(zhuǎn)基因植物的生物控制劑[17-18]。

迄今為止,來自不同物種的幾丁質(zhì)酶已經(jīng)在大腸桿菌BL21[19]和畢赤酵母[20]中表達(dá)。研究人員正在努力使用畢赤酵母等異源表達(dá)系統(tǒng)來增加幾丁質(zhì)酶的表達(dá)水平[21]。畢赤酵母是第二大蛋白表達(dá)系統(tǒng),由于巴斯德畢赤酵母AOX1啟動子強(qiáng)且受嚴(yán)格調(diào)控,因此適合高水平表達(dá)目的蛋白。此外,目的蛋白將被有效地分泌到細(xì)胞外,簡化了后續(xù)的純化過程。最后,巴斯德畢赤酵母可用于大規(guī)模高密度發(fā)酵。數(shù)千種蛋白質(zhì)已在畢赤酵母中成功表達(dá),它是生產(chǎn)重組蛋白的常用表達(dá)系統(tǒng),在畢赤酵母中表達(dá)為重組酶的幾丁質(zhì)酶可以作為糖基化或糖基化變體生產(chǎn)[22-23]。

基于本實驗室前期研究,不同抗性的茶樹品種在接種茶餅病病原菌(壞損外擔(dān)菌)后,茶樹幾丁質(zhì)酶編碼基因(CsC7)相對表達(dá)量顯著提高。因此,本研究擬通過畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)茶樹CsC7蛋白,同時對該蛋白做抑菌活性分析,以期獲得有效的CsC7蛋白抑制劑,為研發(fā)防治茶樹真菌病害的綠色農(nóng)藥提供理論依據(jù),同時為抗真菌病害茶樹品種的選育提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 植物材料、菌株、質(zhì)粒和試劑

“梅占”(編號GS13004—1985)采自安順市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院;質(zhì)粒pPICZαA、畢赤酵母X-33菌株、大腸桿菌(Escherichiacolistrain)DH5α購于北京擎科生物科技有限公司。尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)、厚孢鐮刀菌(Fusariumchlamydosporum)、灰霉菌(Botrytiscinerea)、白樺茸擔(dān)子菌(Inonotusobliquus)、脆弱毛霉菌(Mucorfragilis)、枯葉格孢腔菌(Pleosporaherbarum)、赤星菌(Alternariaalternata)均來自貴州大學(xué)茶學(xué)院茶生物技術(shù)實驗室分離保存的菌種。

1.2 基因克隆

稱取“梅占”健康頂芽100 mg,加入液氮充分研磨至無成塊的植物組織。使用植物RNA提取試劑盒(DNase I) (ComWin Biotech,Jiangsu) 根據(jù)說明書提取總RNA,RNA 的質(zhì)量用Nano Drop儀進(jìn)行檢測,使用GoldenstarTMRT6 cDNA Synthesis Kit (Tsingke Biotechnology, Beijing) 從5 μg總RNA中獲得第一鏈cDNA?；谠瓶?0號茶樹的基因組數(shù)據(jù)的CsC7序列(登錄號:TEA002526.1),使用DNAMAN-8軟件設(shè)計CsC7基因的特異性引物F1:ATGTCTCCAAAACAACCTCATTC和R1:TCAAACATTG CTCTTAATGCTAG,用于以cDNA為模板進(jìn)行目的基因的克隆。使用ExTaqTM聚合酶混合物(Takara Biomedical Technology,Beijing)在含有21.5 μL ddH2O、1.5 μL第一鏈cDNA、基因特異性引物 (CsC7-F1、CsC7-R1)各1 μL (20 μmol/L)和25 μL ExTaq聚合酶混合物的反應(yīng)混合物中進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。PCR程序設(shè)置為98 ℃下持續(xù)10 s,55 ℃持續(xù)30 s 和72 ℃ 3 min。PCR產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖/GelRed凝膠上檢測,并使用EZNA凝膠提取試劑盒(Omega Bio-Tek,Norcross,USA)純化相應(yīng)的DNA條帶。該產(chǎn)物與pGEM-T Easy Vector((Promega Corporation,Madison,USA)連接,在大腸桿菌DH5α中擴(kuò)增并進(jìn)行測序。使用Serial Cloner 1-3進(jìn)行序列分析,以確定CsC7序列。所有引物均由擎科生物科技公司重慶分公司合成。

1.3 CsC7蛋白生物信息學(xué)分析

使用SignalP (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測信號肽、NetNGlyc (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)預(yù)測糖基化位點、TMHMM(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0)預(yù)測跨膜結(jié)構(gòu)域,使用在線網(wǎng)站ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測蛋白質(zhì)理化性質(zhì),使用ProtScale(http://web.expasy.org/ProScale)預(yù)測蛋白質(zhì)的疏水性。

1.4 密碼子優(yōu)化及pPICZαA-CsC7質(zhì)粒的構(gòu)建

通過對CsC7進(jìn)行生物信息學(xué)分析,需將CsC7蛋白所含信號肽切除,即去掉前27個氨基酸,根據(jù)巴斯德畢赤酵母的密碼子偏好性(http://www.kazusa.or.jp/codon)對重組蛋白基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化,避開SacI酶切位點,用巴斯德畢赤酵母中的高頻密碼子替換CsC7中的相應(yīng)密碼子;基因合成至 pPICZαA,目的基因緊挨著載體α-factor,C端帶上6個氨基酸His標(biāo)簽(CTCGAGAAAAGACACATCATCATCATCAT)。將所得重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZαA-CsC7最終轉(zhuǎn)化為大腸桿菌E.coliDH5α,并在含有25 μg/mL博萊霉素的LB瓊脂平板上37 ℃培養(yǎng)16 h。首先使用設(shè)計的引物pPICZα-F:GACTGGTTCCAATTGACAAGC和pPICZα-R:GCAAATGGCATTCTGACATCC通過PCR鑒定陽性pPICZαA-CsC7質(zhì)粒克隆,并測序確認(rèn)陽性質(zhì)粒,然后進(jìn)一步轉(zhuǎn)化畢赤酵母X-33。

1.5 畢赤酵母轉(zhuǎn)化及蛋白表達(dá)純化

構(gòu)建的pPICZαA-CsC7質(zhì)粒通過SacI線性化,并通過電穿孔法 (GenePulser,Bio-Rad,USA)轉(zhuǎn)入畢赤酵母 X-33細(xì)胞[24]。在含有100 mg/L 博萊霉素的YPD(1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖、2%瓊脂)平板上選擇轉(zhuǎn)化的單菌落進(jìn)行菌落PCR并測序鑒定后挑選7個陽性轉(zhuǎn)化子表達(dá)小試,將最優(yōu)表達(dá)轉(zhuǎn)化子命名為CsC7-6。

250 mL 錐形瓶中加入 50 mL YPG 培養(yǎng)基(1%酵母提取物、2%蛋白胨、3%乙醇和3%甘油),接入最優(yōu)表達(dá)轉(zhuǎn)化子CsC7-6,30 ℃ 220 r/min培養(yǎng)至菌液飽和; 轉(zhuǎn)移到50 mL 離心管中,4 000 r/min離心5 min,棄上清; 用50 mL BMMY 培養(yǎng)基(1%酵母提取物,2%蛋白胨,100 mmol/L磷酸鉀,pH=6.0,1.34% YNB(不含氨基酸的酵母氮堿),0.005%生物素和0.5%甲醇)重懸菌體,轉(zhuǎn)移至新的250 mL無菌錐形瓶中,加入甲醇至終濃度0.5%(V/V),28 ℃ 220 r/min培養(yǎng)6 d;為了誘導(dǎo)目標(biāo)蛋白的表達(dá),每24 h加入100%甲醇至終濃度為0.75%; 第6天上午收集菌液,4 000 r/min離心5 min,收集上清。

30 mL 的重力柱中填裝 5 mL Ni-NTA beads;用5 mL Lysis buffer(50 mmol/L NaH2PO4,300 mmol/L NaCl,10 mmol/L imidazole,pH=8.0,過濾除菌) 平衡柱子,重復(fù) 3 次; 50 mL 蛋白溶液分兩次過柱;加入10 mL Wash buffer (50 mmol/L NaH2PO4,300 mmol/L NaCl,20 mmol/L imidazole,pH=8.0,過濾除菌)進(jìn)行洗雜,重復(fù)5次;加入5 mL Elution buffer (50 mmol/L NaH2PO4,300 mmol/L NaCl,250 mmol/L imidazole,pH=8.0,過濾除菌)洗脫,即得到純化后蛋白并儲存在-80 ℃進(jìn)行進(jìn)一步分析。用 Western Blot 檢測,蛋白質(zhì)濃度用BCA蛋白質(zhì)試劑盒(中國南京建成生物工程研究所有限公司)測定。

1.6 抗真菌活性測定

酵母純化蛋白按照體積比1∶1與PDA培養(yǎng)基混勻后倒入培養(yǎng)皿(直徑9 cm)中,以不加入外源試劑PDA培養(yǎng)基為對照。

將尖孢鐮刀菌、厚孢鐮刀菌、灰霉菌、白樺茸擔(dān)子菌、脆弱毛霉菌、枯葉格孢腔菌、赤星菌接種在PDA培養(yǎng)基上,25 ℃恒溫倒置暗培養(yǎng)7 d。用無菌打孔器取菌斑邊緣6 mm菌餅,接種于混有目的蛋白的PDA培養(yǎng)基中心位置,25 ℃恒溫倒置暗培養(yǎng),每組試驗重復(fù)3次。

采用“十字交叉法”測量菌落直徑并拍照記錄,根據(jù)生長抑制率公式[25]計算生長抑菌率。

抑菌率/%=[(對照組病原菌的直徑-處理組病原菌直徑)/對照組病原菌直徑]×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 CsC7生物信息學(xué)分析

對CsC7編碼的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)預(yù)測,結(jié)果顯示,該蛋白的分子式為C1463H2226N386O436S9,分子量為32 486.63 kD,等電點為8.42,不穩(wěn)定指數(shù)為41.41,總平均疏水指數(shù)為-0.140,脂肪族指數(shù)為80.86;用TMHMM Server v2.0軟件預(yù)測目標(biāo)蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域,如圖1所示,目標(biāo)蛋白N端和C端都在細(xì)胞膜外部,因此CsC7蛋白不含跨膜結(jié)構(gòu)。

圖1 跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測

應(yīng)用在線網(wǎng)站NetNGlyc預(yù)測目標(biāo)蛋白的糖基化位點數(shù)目,如圖2所示,目標(biāo)蛋白可能含有1個糖基化位點,推測畢赤酵母工程菌分泌表達(dá)的CsC7蛋白分子量可能與預(yù)測的蛋白分子量有偏差。

圖2 糖基化位點預(yù)測

圖3 信號肽預(yù)測

使用SignaIP信號肽預(yù)測工具預(yù)測目標(biāo)蛋白的信號肽。結(jié)果顯示,目標(biāo)蛋白含有1個信號肽,由于畢赤酵母表達(dá)載體自身含有1個α-分泌信號肽,因此要將目的蛋白的信號肽切除,即去掉前27個氨基酸。

2.2 CsC7基因密碼子優(yōu)化及載體構(gòu)建

本研究在去掉CsC7自身具有的信號肽后,不改變CsC7蛋白氨基酸序列的情況下,根據(jù)畢赤酵母密碼子偏好性優(yōu)化了CsC7基因核苷酸序列。具體優(yōu)化位點所在位置見圖4紅色部分, 由金斯瑞生物科技有限公司將基因合成至 pPICZαA,目的基因緊挨著載體α-factor,C端帶上6個氨基酸His標(biāo)簽,載體示意圖如圖5所示。

圖4 畢赤酵母系統(tǒng)優(yōu)化后的CsC7基因序列及編碼氨基酸序列

圖5 CsC7畢赤酵母表達(dá)載體

注:M為DNA Maker(5 000 bp);1為線性化前質(zhì)粒;2為線性化后質(zhì)粒。

2.3 酵母工程菌構(gòu)建及篩選

將構(gòu)建完成的質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶SacI進(jìn)行線性化,經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,結(jié)果如圖4所示,將含有CsC7基因的線性化重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入畢赤酵母X-33菌株,經(jīng)PCR篩選,圖7瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果說明,目的基因已整合到酵母染色體中。

注:M為DNA Maker(5 000 bp);1～8為不同克隆轉(zhuǎn)化子。

2.4 畢赤酵母重組蛋白的表達(dá)和純化

將PCR結(jié)果為陽性的單克隆菌落轉(zhuǎn)接后,待生長濃度合適時誘導(dǎo), Western blot檢測目的蛋白表達(dá)情況,圖8檢測結(jié)果顯示蛋白分泌表達(dá),其中6號酵母轉(zhuǎn)化克隆子的蛋白表達(dá)效果最好,為了獲得大量純化的目的蛋白,將酵母轉(zhuǎn)化克隆子CsC7-6擴(kuò)大表達(dá)并進(jìn)行Ni-NTA beads純化,純化后用WB檢測,結(jié)果(圖9)表明,蛋白樣品純化成功,未有其他雜帶。用BCA法測定其濃度(表1),在標(biāo)準(zhǔn)曲線上(圖10)計算出CsC7蛋白樣品經(jīng)過稀釋后的蛋白質(zhì)濃度為62 μg/mL,由稀釋倍數(shù)計算原CsC7純化蛋白質(zhì)濃度為150 μg/mL。

表1 蛋白濃度測定

注:M為Protein Marker;1～7為PCR檢測為陽性的菌落。其中用紅框標(biāo)注出的6號酵母轉(zhuǎn)化克隆子的蛋白表達(dá)效率最高,用于后續(xù)蛋白表達(dá)。

注: M為Protein Maker;1為流出液;2為純化蛋白;3為洗雜液;4為陽性對照牛血清蛋白。

圖10 蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線

注:A為脆弱毛霉菌;B為白樺茸擔(dān)子菌;C為尖孢鐮刀菌;D為赤星菌;E為灰霉菌;F為厚孢鐮刀菌;G為枯葉格孢腔菌。

2.5 CsC7蛋白異源表達(dá)及抗真菌活性測定

將脆弱毛霉菌、白樺茸擔(dān)子菌、尖孢鐮刀菌、赤星菌、灰霉菌、厚孢鐮刀菌、枯葉格孢腔菌等7種不同真菌分別接種在混有酵母異源表達(dá)CsC7純化蛋白和不加入外源試劑(對照)的PDA培養(yǎng)基中,不同真菌達(dá)到最高抑菌率的時間不同,結(jié)果顯示,培養(yǎng)2 d時對脆弱毛霉菌和灰霉菌的抑制率最高,分別為27.07%和32.23%;培養(yǎng)3 d時對尖孢鐮刀菌和厚孢鐮刀菌的抑制率最高,分別為39.21%和28.45%;培養(yǎng)4 d時對白樺茸擔(dān)子菌的抑制率最高,為21.90%;對赤星菌和枯葉格孢腔菌沒有顯著抑制作用。

3 討 論

植物生長發(fā)育中可能受到各種病原菌侵害,進(jìn)而影響農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量和產(chǎn)量。目前,主要使用化學(xué)農(nóng)藥進(jìn)行防治[26],但化學(xué)農(nóng)藥在土壤中殘留時間長,對生態(tài)造成破壞,危及人類健康[27]。因此,為了自然環(huán)境及人類健康,尋找更健康的替代品成為當(dāng)務(wù)之急。

幾丁質(zhì)酶存在于細(xì)菌、真菌、昆蟲和植物等不同形式的生物體中,是一種具有降解真菌細(xì)胞壁作用的病程相關(guān)蛋白,當(dāng)植物(宿主)細(xì)胞處于病原體脅迫下時,植物幾丁質(zhì)酶會強(qiáng)烈表達(dá),因此植物幾丁質(zhì)酶在對抗真菌病原體方面起著關(guān)鍵作用[28]。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn),不同抗性的茶樹品種在接種茶餅病病原菌(壞損外擔(dān)菌)后,茶樹幾丁質(zhì)酶CsC7相對表達(dá)量顯著提高,推測茶樹幾丁質(zhì)酶CsC7在茶樹抗真菌病害中扮演著重要角色。

在病原體攻擊期間,植物幾丁質(zhì)酶釋放出病原體反應(yīng)蛋白作為自我防御,在以往一些研究中已證實許多植物幾丁質(zhì)酶都具有潛在的抗真菌活性[29],如從烏頭葉豇豆(Vignaaconitifolia)中提取的幾丁質(zhì)酶可用于抑制真菌病原體[30],從尖葫蘆(Trichosanthesdioica)種子中提取的幾丁質(zhì)酶對黑曲霉和木霉均有抗真菌活性[31],使用純化的幾丁質(zhì)酶蛋白進(jìn)行微量滴定板測定中發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)酶對真菌孢子萌發(fā)和菌絲生長有抑制活性[32]。本研究通過使用酵母異源表達(dá)純化后的CsC7蛋白對脆弱毛霉菌、白樺茸擔(dān)子菌、尖孢鐮刀菌、赤星菌、灰霉菌、厚孢鐮刀菌、枯葉格孢腔菌7種真菌進(jìn)行抗菌活性分析,發(fā)現(xiàn)純化后的酵母異源表達(dá)蛋白CsC7對脆弱毛霉菌、白樺茸擔(dān)子菌、厚孢鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、灰霉菌有明顯抑制活性,這一研究結(jié)果表明,茶樹幾丁質(zhì)酶CsC7對多種茶樹真菌病害具有抑制作用,也為進(jìn)一步探究茶樹抗真菌病害分子機(jī)制提供一定的理論基礎(chǔ)。

葉片病原體對植物的侵染涉及病原體滲透到內(nèi)部組織中,在那里它們從內(nèi)部細(xì)胞中獲取水和養(yǎng)分。各種細(xì)菌、卵菌和真菌利用氣孔開口作為主要的入侵途徑。作為對策,植物可以在感知到病原體時迅速關(guān)閉氣孔以限制其進(jìn)入。這種對氣孔關(guān)閉的控制,也稱為氣孔免疫,是植物先天免疫反應(yīng)之一[33-34]。高靜等[35]研究表明,葉面噴施酵母后,酵母能誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉。本實驗通過在茶樹葉片表面噴施表達(dá)茶樹幾丁質(zhì)酶CsC7蛋白的畢赤酵母培養(yǎng)液,以酵母液體培養(yǎng)基為陰性對照,葉面噴施型的哈茨木霉可濕粉劑為陽性對照,蒸餾水為空白對照,在茶餅病發(fā)病期選取無肉眼可見病斑的茶樹為實驗對象測量茶園中茶餅病田間發(fā)病情況,田間實驗結(jié)果顯示,酵母表達(dá)CsC7處理組相對蒸餾水處理組的病斑數(shù)降低了34.04%。本研究結(jié)果為研發(fā)防治茶樹真菌病害的綠色農(nóng)藥提供理論依據(jù),同時為抗真菌病害茶樹品種的選育提供理論支撐。