刁志鈿，王喜先，孫晴，徐健，馬波

（中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過程研究所，單細(xì)胞中心，山東 青島 266101）

合成生物學(xué)在過去二十年中表現(xiàn)出巨大發(fā)展?jié)摿?，合成生物學(xué)研究在全世界范圍內(nèi)引起了廣泛關(guān)注，被多個(gè)國(guó)家和國(guó)際組織機(jī)構(gòu)評(píng)為能夠引起人類生活以及全球經(jīng)濟(jì)發(fā)生革命性進(jìn)展的顛覆性科技［1-3］。我國(guó)《“十三五”國(guó)家科技創(chuàng)新規(guī)劃》《“十三五”生物技術(shù)創(chuàng)新專項(xiàng)規(guī)劃》都將合成生物技術(shù)列為“構(gòu)建具有國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)力的現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系”所需的“發(fā)展引領(lǐng)產(chǎn)業(yè)變革的顛覆性技術(shù)”之一。合成生物學(xué)的跨越式發(fā)展，取決于“設(shè)計(jì)-構(gòu)建-測(cè)試-學(xué)習(xí)”（design-build-test-learn）這四大環(huán)節(jié)的突破。近年來，合成生物學(xué)發(fā)展又進(jìn)入了新的快速發(fā)展階段，基因編輯與合成技術(shù)以及人工智能的迅速發(fā)展極大地增強(qiáng)了“設(shè)計(jì)”和“合成”兩大環(huán)節(jié)［4-9］，而細(xì)胞表型測(cè)試速度與通量的發(fā)展卻緩慢得多，難以滿足“細(xì)胞表型測(cè)試”環(huán)節(jié)對(duì)高通量的需求，因此細(xì)胞表型測(cè)試成為限制合成生物技術(shù)快速發(fā)展的主要因素之一。

單個(gè)細(xì)胞是地球上生命的基本單元和進(jìn)化的基本單位，因此單細(xì)胞表型測(cè)試技術(shù)原理和儀器設(shè)備體系的突破，將帶來合成生物學(xué)技術(shù)的重大突破。目前單細(xì)胞表型測(cè)試常用技術(shù)中，熒光流式具有超靈敏、高特異性、高可靠性和高通量等優(yōu)勢(shì)，是目前應(yīng)用最為廣泛的單細(xì)胞表型檢測(cè)技術(shù)之一［10-12］，但其需外加熒光標(biāo)記的前提限制了應(yīng)用的普適性。質(zhì)譜流式是一種強(qiáng)大的功能表型識(shí)別技術(shù)［13-15］，但其在單細(xì)胞水平的檢測(cè)分辨率還很低，且對(duì)細(xì)胞具有破壞性。拉曼光譜是一種散射光譜，是化合物中分子鍵被激發(fā)到虛能態(tài)卻尚未恢復(fù)到原始態(tài)所引起的入射光被散射后頻率發(fā)生變化的現(xiàn)象［16］。光譜信號(hào)對(duì)應(yīng)于化學(xué)鍵的振動(dòng)，其依靠激發(fā)光的非彈性散射和分子共振可以對(duì)單個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生獨(dú)特的“指紋圖譜”［17］。單細(xì)胞拉曼光譜（single-cell Raman spectrum， SCRS）技術(shù)能夠提供豐富的代謝表型信息，可以實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞精度測(cè)量，且可以進(jìn)行非標(biāo)記的原位檢測(cè)進(jìn)而形成普適性應(yīng)用，因此是實(shí)現(xiàn)高精度單細(xì)胞代謝功能探測(cè)的重要手段［18-20］。

基于SCRS技術(shù)強(qiáng)大的表型識(shí)別能力，國(guó)內(nèi)外已搭建了針對(duì)不同應(yīng)用場(chǎng)景的拉曼激活細(xì)胞分選平臺(tái)（RACS）。根據(jù)拉曼采集時(shí)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)，大體上分為靜止模式和流動(dòng)模式兩大類，前者主要包括拉曼彈射分選（Raman-activated cell ejection，RACE）［21］、靜態(tài)拉曼光鑷（static-Raman tweezer， Static-RT）［22-23］、重力驅(qū)動(dòng)拉曼光鉗液滴分選（Raman-activated gravity-driven encapsulation， RAGE）［24］，后者主要包括流式拉曼光鑷（flow-Raman tweezer， Flow-RT）［25］、拉曼微流分選（Raman-activated microfluidic sorting，RAMS）［26］、拉曼微液滴分選（Raman-activated droplet sorting， RADS）［27］、介電單細(xì)胞捕獲/釋放拉曼激活液滴分選（positive dielectrophoresisbased RADS， pDEP-RADS）［28］以及相干拉曼微流分選（Coherent-RAMS）［29-30］。這些平臺(tái)有效耦合了單細(xì)胞拉曼表型識(shí)別、分選、基因型分析或培養(yǎng)，展示了其助力合成生物學(xué)細(xì)胞表型測(cè)試與分選的巨大潛力。本文選取自主研制的單細(xì)胞拉曼光鑷分選儀（RACS-Seq）、單細(xì)胞微液滴分選系統(tǒng)（EasySort）和高通量流式拉曼分選儀（FlowRACS）為典型儀器裝備，分別概述其技術(shù)原理、技術(shù)迭代以及特色應(yīng)用案例，為國(guó)產(chǎn)化儀器裝備提供特色研制方案。

1 單細(xì)胞拉曼光鑷分選儀（RACS-Seq）

RACS-Seq以RAGE技術(shù)為核心，可以在水環(huán)境中對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行低損傷的拉曼成像，并依據(jù)特征SCRS將目標(biāo)單細(xì)胞用重力驅(qū)動(dòng)液滴包裹的形式精準(zhǔn)包裹，進(jìn)而將液滴從微流控芯片轉(zhuǎn)移至離心管中，以單個(gè)細(xì)胞-單個(gè)液滴-存放于單個(gè)試管的形式完成細(xì)胞分選和單細(xì)胞樣本制備，以支撐下游單細(xì)胞擴(kuò)增或測(cè)序。RACS-Seq可對(duì)各類細(xì)胞樣品進(jìn)行一站式單細(xì)胞代謝表型測(cè)量、單細(xì)胞拉曼分選、單細(xì)胞基因組解析和單細(xì)胞培養(yǎng)?；诜€(wěn)定同位素標(biāo)記底物飼喂SCRS技術(shù)，RACS-Seq無須分離培養(yǎng)，在單細(xì)胞精度直接鑒定微生物種類，并測(cè)量各種代謝相關(guān)表型（及其細(xì)胞間異質(zhì)性）。通過單細(xì)胞微液滴光鑷?yán)诌x與低偏好性核酸擴(kuò)增技術(shù)，以獲取高覆蓋度、與代謝表型相關(guān)聯(lián)的單細(xì)胞基因組。RACS-Seq為復(fù)雜細(xì)胞樣品的代謝活性快檢、種質(zhì)資源挖掘和功能機(jī)制研究提供了新一代、原創(chuàng)的裝備解決方案［圖1（a）］。

圖1 基于RACS-Seq的單細(xì)胞拉曼表型檢測(cè)分選裝備及分選流程Fig. 1 Equipment and process for Raman-activated single-cell phenotype detection and sorting based on RACS-Seq

1.1 儀器原理

Xu等［24］開發(fā)了一種重力驅(qū)動(dòng)拉曼光鉗液滴分選技術(shù)，通過耦合液滴微流控技術(shù)，完成了目標(biāo)單細(xì)胞的精準(zhǔn)分選和快速導(dǎo)出，實(shí)現(xiàn)所測(cè)即所得。RAGE技術(shù)的發(fā)展為RACS-Seq的研制與發(fā)展提供了技術(shù)支撐。RAGE分選所采用的水相拉曼單細(xì)胞信號(hào)檢測(cè)可以降低激光照射帶來的損傷，加之液滴生成過程有油相的引入可以提高M(jìn)DA擴(kuò)增效率［29］，所以RAGE分選后，目標(biāo)大腸桿菌單細(xì)胞的全基因組測(cè)序覆蓋度達(dá)到了約95%［24］。

RACS-Seq主要由拉曼光鑷與RAGE微流控分選芯片兩部分組成，拉曼光鑷用于單細(xì)胞拉曼成像和單細(xì)胞操控，微流控分選芯片用于構(gòu)建單細(xì)胞拉曼成像環(huán)境，以及支撐后續(xù)的單細(xì)胞液滴包裹和分離。在芯片內(nèi)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行捕獲操控需要高精度的流路控制，而傳統(tǒng)基于注射泵、蠕動(dòng)泵的進(jìn)樣方式由于導(dǎo)管、注射器始終處于壓縮受力的狀態(tài)，難以實(shí)現(xiàn)pL/min級(jí)別的流路調(diào)控。RAGE技術(shù)創(chuàng)新性地采用了重力進(jìn)樣的方式，以類似打吊瓶的方法將裝有樣本細(xì)胞的注射器懸掛于高度可控的進(jìn)樣架上，通過注射器與芯片內(nèi)的液面差，讓樣本自動(dòng)可控地進(jìn)入芯片，并通過調(diào)節(jié)進(jìn)樣架上注射器的高度控制其進(jìn)樣流速。此外，在微流控芯片的儲(chǔ)油池一端加入油相時(shí)，油相在微通道內(nèi)浸潤(rùn)產(chǎn)生與進(jìn)樣重力方向相反的毛細(xì)作用力，通過調(diào)節(jié)液面差高度可在芯片內(nèi)形成流速為0的靜止?fàn)顟B(tài)。

和傳統(tǒng)流式分選不同，RAGE采用半靜態(tài)分選。細(xì)胞分選前，調(diào)節(jié)進(jìn)樣架高度，使芯片內(nèi)水相與儲(chǔ)油池內(nèi)油相的兩相界面停留于微通道出口處，此時(shí)通道流速為0，細(xì)胞在通道內(nèi)保持準(zhǔn)靜止?fàn)顟B(tài)（具有鞭毛結(jié)構(gòu)的細(xì)胞會(huì)自發(fā)游動(dòng)），收集檢測(cè)窗口處細(xì)胞的拉曼光譜（532 nm激光照射）。由于拉曼信號(hào)的強(qiáng)度與激發(fā)光波長(zhǎng)的四次方成反比，這里用532 nm激光進(jìn)行拉曼成像。檢測(cè)時(shí)，532 nm激光具有一定的光鑷捕獲力，可輕易在準(zhǔn)靜態(tài)環(huán)境下捕獲細(xì)小細(xì)胞，由于準(zhǔn)靜態(tài)環(huán)境下沒有拉曼曝光時(shí)間的限制，因此可采集到微弱的細(xì)胞原位拉曼信號(hào)。篩選出具有特征拉曼光譜的目標(biāo)細(xì)胞后，將532 nm激光切換為1064 nm激光，并利用1064 nm激光所產(chǎn)生的光鑷力將目標(biāo)細(xì)胞拖拽到通道末端的油水界面處。此時(shí)，升高進(jìn)樣架的高度即能將油水界面處的水相擠入油池進(jìn)而形成單個(gè)液滴，目標(biāo)細(xì)胞隨即被包裹進(jìn)入形成的單個(gè)液滴。由于所選油相與水相的密度差異，生成液滴會(huì)停留于儲(chǔ)油池最底部靠近通道出口處，之后可方便地通過毛細(xì)管或移液槍完成轉(zhuǎn)移，最終以單個(gè)細(xì)胞-單個(gè)液滴-存放于單個(gè)試管的形式完成篩選［圖1（b）］。該分選模式還可方便與熒光成像耦合進(jìn)行單細(xì)胞熒光分選。

1.2 應(yīng)用

微生物組是地球上能量與元素循環(huán)的主要載體，與人體、動(dòng)植物以及環(huán)境的健康也息息相關(guān)。因此，微生物組的探測(cè)、理解和利用，將跨越“尚難培養(yǎng)微生物屏障”，帶來生命科學(xué)及其應(yīng)用的共性突破。SCRS能夠無需培養(yǎng)而快速識(shí)別菌群中細(xì)胞的各種代謝功能，但是一直以來，針對(duì)菌群的單細(xì)胞拉曼分選和測(cè)序都面臨著兩個(gè)瓶頸：首先，如何無損快速地獲取特定拉曼表型的單個(gè)細(xì)胞；其次，如何高覆蓋度地獲得精確到一個(gè)細(xì)胞的基因組。

針對(duì)上述問題，單細(xì)胞拉曼光鑷分選儀RACE-Seq給出了有效的解決方案，通過耦合光鑷及微流控液滴技術(shù)，將特定拉曼表型的細(xì)菌單細(xì)胞從群體中精準(zhǔn)分離，并包裹到皮升級(jí)液滴中，然后采用宏觀移液的方式便可將包裹有目標(biāo)細(xì)胞的液滴導(dǎo)出并轉(zhuǎn)移到試管中，從而快速、精確、簡(jiǎn)便地實(shí)現(xiàn)“單個(gè)細(xì)胞-單個(gè)液滴-單個(gè)試管”的拉曼分選流程，可直接耦合下游細(xì)胞培養(yǎng)或基因組分析。在這里選取了部分案例展示RACE-Seq的廣闊應(yīng)用潛力（圖2）。

圖2 基于RACS-Seq的單細(xì)胞拉曼分選應(yīng)用Fig. 2 Applications of Raman-activated single-cell sorting based on RACS-Seq

1.2.1 尿液中抗生素抗性大腸桿菌單細(xì)胞拉曼分選及測(cè)序

Xu等［24］使用RACS-Seq從臨床尿液樣本中直接識(shí)別和分選出耐受特定抗生素的臨床大腸桿菌，并精確到一個(gè)細(xì)胞的全基因組測(cè)序，覆蓋度可達(dá)99.5%。拉曼彈射分選（RACE）［21］在干片條件進(jìn)行拉曼檢測(cè)，且激光彈射分選會(huì)對(duì)細(xì)胞造成一定的損傷，因此RACE的單細(xì)胞測(cè)序覆蓋度一般不高，RACS-Seq分選細(xì)胞時(shí)由于目標(biāo)細(xì)胞在分選過程中始終處于水相環(huán)境中，有效降低了拉曼分選中激光引入造成的細(xì)胞損傷，其導(dǎo)出的單細(xì)胞液滴體系經(jīng)過簡(jiǎn)單振蕩后可轉(zhuǎn)變成乳化擴(kuò)增體系，大幅度降低了傳統(tǒng)單細(xì)胞基因擴(kuò)增（如單細(xì)胞MDA）中存在的偏好性，從而可從一個(gè)細(xì)胞得到近乎完整的全基因組信息。這一高覆蓋度保證了基因組上所有耐藥基因突變均得以全面、精確地揭示。此外，其獨(dú)特的單液滴分選轉(zhuǎn)移形式有效解決了單細(xì)胞分析中常見的污染問題。從菌群中直接、精準(zhǔn)地獲取一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞的藥敏性表型及其完整基因組，以往還未有先例。因此，RACSSeq的這一獨(dú)特能力，預(yù)計(jì)將帶來臨床感染診斷和用藥、耐藥性傳播監(jiān)控與機(jī)制、海洋生態(tài)監(jiān)控與資源挖掘等領(lǐng)域的一系列突破［圖2（a）］。

1.2.2 土壤微生物功能單細(xì)胞拉曼分選及測(cè)序

土壤菌群是地球上最多樣與最復(fù)雜的微生物組之一，其中大部分微生物尚難以培養(yǎng)，而單個(gè)細(xì)胞精度的拉曼分析-分選-測(cè)序策略是剖析土壤等環(huán)境菌群之代謝機(jī)制的重要手段。Jing等［31］依托RACS-Seq，從穩(wěn)定同位素底物飼喂的土壤菌群出發(fā)，將特定拉曼表型的細(xì)菌單細(xì)胞精準(zhǔn)分離并包裹到皮升級(jí)液滴中，進(jìn)而耦合下游基因組測(cè)序。結(jié)果表明：①土壤菌群中細(xì)胞代謝活躍的低豐度物種（如Corynebacteriumspp.、Clostridiumspp.、Moraxellaspp.、Pantoeaspp.和Pseudomonasspp.等）經(jīng)重水飼喂與標(biāo)記后，可利用RACS-Seq精準(zhǔn)地識(shí)別和分選，其單細(xì)胞基因組覆蓋率可高達(dá)近93%；②基于RACS-Seq，含類胡蘿卜素的土壤微生物細(xì)胞（如Pantoeaspp.、Legionellaspp.、Massiliaspp.、Pseudomonasspp.、和Pedobacterspp.等）能實(shí)現(xiàn)單個(gè)細(xì)胞分辨率、高基因組覆蓋度的代謝重建，從而完整、深入地挖掘其類胡蘿卜素合成途徑；③這些“原位”合成類胡蘿卜素的土壤微生物細(xì)胞中，既有代謝活躍的，也有相當(dāng)部分是惰性的，表明基于純培養(yǎng)的策略勢(shì)必錯(cuò)失這些代謝惰性的功能微生物，因此“原位”、單細(xì)胞精度的功能細(xì)胞識(shí)別和分離，對(duì)于全面、客觀的菌群功能剖析和資源挖掘具有重要意義［圖2（b）］。RACE-Seq可以從土壤中精確地以單細(xì)胞分辨率建立代謝-基因組鏈接，可以幫助精確查明復(fù)雜生態(tài)系統(tǒng)中“誰(shuí)在做什么”。

1.2.3 海洋固碳微生物單細(xì)胞拉曼分選及測(cè)序

為了挖掘海洋微生物組中具有原位固定CO2功能的細(xì)胞，Jing等［32］依托RACS-Seq，利用穩(wěn)定同位素13C標(biāo)記的無機(jī)碳底物飼喂新鮮海水樣品，通過SCRS中類胡蘿卜素等色素特征峰的“紅移”現(xiàn)象，建立了在免培養(yǎng)前提下原位固定CO2之單細(xì)胞的識(shí)別和測(cè)量流程。研究人員在中國(guó)山東省青島嶗山灣真光層海水中，識(shí)別和分選到一系列進(jìn)行海洋原位固碳代謝的Pelagibacter屬單細(xì)胞，來自于SAR11等類群?；谶@些SAR11單細(xì)胞全基因組序列（覆蓋度最高達(dá)到100%）的進(jìn)化分析、基因功能預(yù)測(cè)與代謝途徑重建，表明：①它們具有完整的類胡蘿卜素合成途徑，這印證了上述SCRS基于色素峰紅移來識(shí)別和表征CO2固定活性的原理；②發(fā)現(xiàn)了一個(gè)基于視紫紅質(zhì)的光激活質(zhì)子泵系統(tǒng)，其中包括雙加氧酶（dioxygenase）、視紫質(zhì)光敏感蛋白（proteorhodopsin）、F-型ATP合成酶（F-type ATPase）等關(guān)鍵蛋白；③它們擁有大部分進(jìn)行CO2固定的Calvin-Benson循環(huán)途徑的基因。這些發(fā)現(xiàn)提示這些SAR11細(xì)胞可能通過基于視紫紅質(zhì)的光激活質(zhì)子泵系統(tǒng)來驅(qū)動(dòng)基于Calvin-Benson循環(huán)的海水原位固碳。經(jīng)過假設(shè)驗(yàn)證得知它們能夠合成視紫質(zhì)，且其中的兩個(gè)基因與GenBank中的基因均無顯著同源性，屬于一類全新的視紫質(zhì)光敏感蛋白。因此，這些視紫紅質(zhì)介導(dǎo)的光激活質(zhì)子泵系統(tǒng)，很可能是SAR11在海水中原位進(jìn)行光合固碳的能量引擎［圖（2）］?；赗ACS-Seq系統(tǒng)，Jing等［32］建立了針對(duì)CO2固定活性等代謝表型的功能靶向性單細(xì)胞拉曼分選與測(cè)序方法。

1.2.4 污水解磷菌功能單細(xì)胞拉曼分選及培養(yǎng)

磷既是維持作物種植、養(yǎng)活全球人口的關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)元素，也是造成水體污染的重要原因。水體及土壤中的磷源包括可溶磷和不可溶磷（包括無機(jī)不可溶磷源和有機(jī)不可溶磷源），其中只有可溶態(tài)磷能夠被生物利用。而解磷菌能夠把不可溶磷轉(zhuǎn)化為可溶解態(tài)磷源，因此，挖掘在水體、土壤等環(huán)境中“原位”行使解磷功能的微生物，具有重要的研究意義和產(chǎn)業(yè)價(jià)值。基于元拉曼組原理和RACS-Seq，Jing等［33］發(fā)明了菌群中功能單細(xì)胞“先篩后養(yǎng)”的scRACS-Culture新策略。為了識(shí)別污水微生物組中的原位解磷菌，研究人員利用以Ca3（PO4）2為唯一無機(jī)磷源或以卵磷脂為唯一有機(jī)磷源的污水樣本（預(yù)先去除可溶性磷源），結(jié)合D2O孵育，從而通過SCRS中C—D特征峰的強(qiáng)弱，在單細(xì)胞精度定量表征污水中微生物的解磷活性，進(jìn)而建立了原位解磷菌的單細(xì)胞識(shí)別-分選-培養(yǎng)流程［圖2（d）］。

運(yùn)用這一scRACS-Culture體系，研究人員在青島張村河水務(wù)有限公司的污水處理池中，原位識(shí)別、分選和培養(yǎng)出了Comamonasspp.、Acinetobacterspp.、Enterobacterspp.和Citrobacterspp.等高效原位有機(jī)解磷菌。重要的是，其原位解磷活性均比實(shí)驗(yàn)室純培養(yǎng)條件下高出1～2，凸顯了“先篩后養(yǎng)”策略對(duì)菌株“原位”功能認(rèn)知與評(píng)價(jià)的重要意義。同時(shí)，研究人員運(yùn)用scRACS-Seq，還發(fā)現(xiàn)了一類在污水中原位高效溶解不可溶有機(jī)磷源、在實(shí)驗(yàn)室條件下尚難以純培養(yǎng)的解磷菌新類群Cutibacteriumspp.。精確到一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞的高覆蓋度基因組重建表明，它們通過分泌金屬磷酸酯酶（MPP）、細(xì)胞壁錨定5′-核苷酸酶（ushA編碼）和質(zhì)膜定位的PstSCAB-PhoU轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，來高效溶解和清除污水中的胞外磷酸鹽。由于scRACS-Culture的功能篩選不依賴于細(xì)胞純培養(yǎng)，因此能基于“原位”功能、針對(duì)菌群中所有的生物多樣性進(jìn)行挖掘，并精準(zhǔn)聚焦于目標(biāo)功能細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)條件優(yōu)化。這些特色克服了功能篩選片面性、功能評(píng)價(jià)失真性、菌株培養(yǎng)盲目性這三個(gè)傳統(tǒng)“先養(yǎng)后篩”策略的潛在缺陷。

1.3 小結(jié)

微生物組，也稱菌群，是微生物在自然界的主要存在形式，也是地球上能量與元素循環(huán)的重要載體。這一由成百上千個(gè)物種組成的共生體，有著復(fù)雜且獨(dú)特的內(nèi)部代謝網(wǎng)絡(luò)，成為精妙的功能實(shí)體，維護(hù)著人體內(nèi)外乃至室內(nèi)環(huán)境、土壤、海洋、大氣等生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定。因此，微生物組的探測(cè)、理解和利用，將跨越“尚難培養(yǎng)微生物屏障”，帶來生命科學(xué)及其應(yīng)用的共性突破，而阻礙此跨越的技術(shù)瓶頸之一便是“在特定的環(huán)境條件下，菌群中哪些/哪個(gè)細(xì)胞代謝了哪種底物？為什么？”。

RACS-Seq可以實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞表型與高質(zhì)量基因型的對(duì)接，將有助于解答上述難題；同時(shí)，RACSSeq可以從底物代謝追蹤的角度闡明菌群內(nèi)代謝分工，揭示菌群-環(huán)境相互作用和菌群功能理性調(diào)控的機(jī)制。然而由于分選通量和測(cè)序通量的限制，現(xiàn)階段只能處理分析<100個(gè)單細(xì)胞樣本。而微生物組的細(xì)胞組成較為復(fù)雜，細(xì)胞數(shù)量大，細(xì)胞種類繁多，少量單細(xì)胞信息根本無法反映整個(gè)菌群的真實(shí)情況，因此需要在現(xiàn)有技術(shù)基礎(chǔ)上進(jìn)一步發(fā)展自動(dòng)化高通量單細(xì)胞檢測(cè)和分選的技術(shù)，并與下游高通量單細(xì)胞測(cè)序平臺(tái)耦合。現(xiàn)階段，憑借人工智能技術(shù)的發(fā)展，單細(xì)胞分辨率的圖像識(shí)別、鑒定、分類已成為可能。借助于該技術(shù)，有望實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化的單細(xì)胞高通量分選。

2 單細(xì)胞微液滴分選系統(tǒng)（EasySort）

EasySort Lego/Compact通過光鑷輕松控制單細(xì)胞的移動(dòng)軌跡，并通過獨(dú)有的重力驅(qū)動(dòng)專利技術(shù)，可將直徑0.5～30 μm的單細(xì)胞迅速包裹成單液滴并對(duì)接下游實(shí)驗(yàn)。EasySort Lego/Compact可廣泛應(yīng)用于各類單細(xì)胞的分離、分選、培養(yǎng)及測(cè)序?qū)嶒?yàn)中，可以實(shí)現(xiàn)復(fù)雜樣品中單個(gè)細(xì)胞精度的可靠分選與微液滴包裹，保證細(xì)胞活性和DNA/RNA質(zhì)量。另外，在EasySort Lego的基礎(chǔ)上，研究人員開發(fā)了新一代人工智能輔助的微生物單細(xì)胞自動(dòng)化分選系統(tǒng)EasySort AUTO，可將常規(guī)顯微鏡升級(jí)為微生物單細(xì)胞的智能化、自動(dòng)化分選裝置，并利用酵母和大腸桿菌細(xì)胞示范了單細(xì)胞分選-測(cè)序/培養(yǎng)的全流程。EasySort系列儀器為細(xì)胞資源的探測(cè)和挖掘提供了有力手段［圖3（a）］。

圖3 基于EasySort的單細(xì)胞拉曼表型檢測(cè)分選裝備及分選流程Fig. 3 Equipment and process for Raman-activated single-cell phenotype detection and sorting based on EasySort

2.1 儀器原理

2.1.1 EasySort Lego/Compact儀器原理

EasySort Lego/Compact在RAGE分選的基礎(chǔ)上，在微流控芯片中構(gòu)建出不受流動(dòng)支路影響的準(zhǔn)靜態(tài)細(xì)胞池，創(chuàng)新性地提出了一種光鑷輔助靜態(tài)池成像分選技術(shù)（OPSI），實(shí)現(xiàn)了分選通量的顯著提升［34］。利用靜態(tài)池成像分選的思路，即在微流控芯片中構(gòu)建流速為0的穩(wěn)定靜態(tài)流場(chǎng)，對(duì)樣本細(xì)胞進(jìn)行限域，并在該流場(chǎng)內(nèi)進(jìn)行平面明場(chǎng)、熒光成像或拉曼掃描從而選取目標(biāo)細(xì)胞。之后通過低細(xì)胞損傷的1064 nm光鑷將目標(biāo)單細(xì)胞移出靜態(tài)流場(chǎng)，并進(jìn)行單細(xì)胞液滴包裹和導(dǎo)出完成分選。相比RAGE，由于靜態(tài)細(xì)胞池與分選支路互相獨(dú)立，無須對(duì)支路干擾細(xì)胞進(jìn)行清理，并且細(xì)胞池與分選通道的間距縮小至約150 μm，縮短了光鑷操控距離，最終分選通量由1～2細(xì)胞/min提高至約10細(xì)胞/min，并且分選體積仍為皮升級(jí)，因此有助于下游單細(xì)胞擴(kuò)增和測(cè)序。

該系統(tǒng)流體驅(qū)動(dòng)液滴生成與RAGE類似，同為重力進(jìn)樣法。通過調(diào)節(jié)進(jìn)樣架與芯片內(nèi)流體的液面差，進(jìn)行液滴生成的調(diào)控。當(dāng)液面差在一定范圍內(nèi)穩(wěn)定時(shí)，可保證油水界面穩(wěn)定存在于油池位置，當(dāng)抬升進(jìn)樣架將液面差增加時(shí)，水相被擠入油池觸發(fā)液滴生成。

EasySort Lego/Compact的單細(xì)胞分選準(zhǔn)確率大于99.7%，保證10～20細(xì)胞/min的分選通量，并高度保持了細(xì)胞活性。此外，EasySort Lego/Compact繼承了RAGE小尺寸分離反應(yīng)的特點(diǎn)，顯著降低了傳統(tǒng)單細(xì)胞基因擴(kuò)增中存在的歧化現(xiàn)象。例如，使用該系統(tǒng)分選人體MCF-7單細(xì)胞進(jìn)行RNA-seq，可獲得高質(zhì)量和高可重復(fù)性的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組譜。EasySort Lego/Compact的通用性、方便性、靈活性和低成本等優(yōu)勢(shì)為其在單細(xì)胞多組學(xué)研究中的應(yīng)用提供了廣闊的前景。雖然EasySort Lego/Compact在RAGE單細(xì)胞分選技術(shù)原理的基礎(chǔ)上進(jìn)一步提高了分選通量與便利性，但是單細(xì)胞的分選及收集導(dǎo)出仍需要復(fù)雜的人工操作。

2.1.2 EasySort AUTO儀器原理

EasySort AUTO在EasySort Lego/Compact的基礎(chǔ)上進(jìn)一步提高了自動(dòng)化與便利性，實(shí)現(xiàn)了單細(xì)胞自動(dòng)化的分選及收集導(dǎo)出［35］。系統(tǒng)搭載的AI輔助圖像識(shí)別算法可以智能化、自動(dòng)化地識(shí)別目標(biāo)細(xì)胞；系統(tǒng)嵌入的光鑷技術(shù)可以捕捉并精準(zhǔn)操控目標(biāo)細(xì)胞；最后，利用了基于界面接觸的微量液體分離專利技術(shù)，目標(biāo)細(xì)胞能夠以單管單細(xì)胞（one-cell-one-tube）的形式自動(dòng)收集于PCR管中。

該系統(tǒng)由四個(gè)主要模塊組成：用于真空輔助樣品加載的真空進(jìn)樣模塊；用于圖像觀察細(xì)胞的顯微成像模塊；用于操控單細(xì)胞的光鑷模塊；用于自動(dòng)單細(xì)胞打印的單細(xì)胞收集模塊。研究人員采用模塊化的設(shè)計(jì)理念，通過光鑷模塊、自動(dòng)采集模塊、正置顯微鏡的耦合，可以很容易地將各種主要商業(yè)品牌的顯微鏡改裝成具有自動(dòng)化單細(xì)胞分選收集的EasySort AUTO。該系統(tǒng)的AI圖像識(shí)別的準(zhǔn)確率達(dá)80%，分選通量約為120細(xì)胞/h，單管單細(xì)胞的概率高于93%，同時(shí)分選的目標(biāo)單細(xì)胞可以直接開展單細(xì)胞測(cè)序、培養(yǎng)等工作，單細(xì)胞測(cè)序成功率高于84.2%；酵母細(xì)胞和大腸桿菌單細(xì)胞培養(yǎng)的成功率分別約為85%和80%。

EasySort AUTO的設(shè)計(jì)具備三個(gè)顯著特點(diǎn)：①?gòu)V譜適用性，由于光鑷可以操控不同尺寸的細(xì)胞，該系統(tǒng)廣泛適用于各類單細(xì)胞的分離、分選、培養(yǎng)及測(cè)序?qū)嶒?yàn)；②靈活性，該系統(tǒng)采用模塊化的設(shè)計(jì)，可通過安裝“巧手”——光鑷模塊和自動(dòng)收集模塊，將生物實(shí)驗(yàn)室常見的正置顯微鏡升級(jí)為單細(xì)胞分選裝置；③高活性保持，分選后的目標(biāo)細(xì)胞具備較高的活性和DNA/RNA質(zhì)量。

2.2 應(yīng)用

EasySort系列儀器可依據(jù)細(xì)胞形態(tài)和SCRS分選色素酵母細(xì)胞［圖3（b）］。由于分選過程中，可以對(duì)細(xì)胞池內(nèi)所有細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞精度的拉曼成像鑒別，且拉曼成像時(shí)間不受限制，因此即使細(xì)胞池中僅存在1個(gè)目標(biāo)細(xì)胞，也可被EasySort識(shí)別并分選獲得，證明了其在低豐度目標(biāo)細(xì)胞體系的適用性。

將色素酵母與非色素酵母混合（1∶100），以色素酵母細(xì)胞為目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞分選。利用EasySort對(duì)視野中的所有酵母細(xì)胞進(jìn)行拉曼判別，結(jié)果顯示視野中約80個(gè)細(xì)胞里存在1個(gè)色素酵母細(xì)胞［圖3（b）中圈出的細(xì)胞為色素酵母細(xì)胞］，該細(xì)胞的明場(chǎng)形態(tài)與非色素酵母細(xì)胞無明顯差異，并且已進(jìn)入出芽狀態(tài)，具有強(qiáng)色素峰。將該細(xì)胞導(dǎo)出到離心管中，加入培養(yǎng)基在30 ℃條件下孵育培養(yǎng)48 h，離心所得細(xì)胞沉淀，呈明顯橘黃色，即類胡蘿卜素顏色，與原始混合樣本的沉淀存在顯著區(qū)別，證明了EasySort可對(duì)低豐度樣本進(jìn)行單細(xì)胞拉曼篩選，分選細(xì)胞可再次培養(yǎng)，分選結(jié)果具有高準(zhǔn)確度。考慮到每個(gè)細(xì)胞池中可裝載小于10 000個(gè)細(xì)胞，因此理論上單塊芯片上可分選豐度大于0.01%的目標(biāo)細(xì)胞。

2.3 小結(jié)

明場(chǎng)圖像、熒光圖像、拉曼光譜均可反映細(xì)胞豐富的表型信息，是匯集上述信息并具備單細(xì)胞精度索引、所見即所得特點(diǎn)的單細(xì)胞分選技術(shù)，在單細(xì)胞分析工作中具有廣泛的適用性。EasySort Lego/Compact使細(xì)胞能夠以精確索引的方式進(jìn)行分類，“所見即所得”，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明其單細(xì)胞率大于99.7%，近乎百分之百，并高度保持了細(xì)胞活性［34］。EasySort AUTO在EasySort Lego/Compact基礎(chǔ)上進(jìn)一步發(fā)展了自動(dòng)化單細(xì)胞檢測(cè)、目標(biāo)細(xì)胞識(shí)別、目標(biāo)細(xì)胞導(dǎo)出的功能，并與下游高通量單細(xì)胞測(cè)序平臺(tái)耦合，實(shí)現(xiàn)了單細(xì)胞自動(dòng)化的分選及收集導(dǎo)出［35］。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明其單細(xì)胞率在93%以上，也說明了自動(dòng)化的收集方式損失了一定的準(zhǔn)確率。EasySort系列儀器集成的光鑷模塊，適用于各類單細(xì)胞的精準(zhǔn)操控，因此EasySort廣泛適用于從細(xì)菌、古菌到人體細(xì)胞等不同尺寸大小的單細(xì)胞。另外，EasySort系列儀器分選的單細(xì)胞可以直接支撐高質(zhì)量的單細(xì)胞基因組/轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，為該系列儀器在單細(xì)胞多組學(xué)研究中的應(yīng)用提供了廣闊的前景。

3 高通量流式拉曼分選儀（FlowRACS）

SCRS具有非標(biāo)記、無損、快速測(cè)量細(xì)胞代謝表型組、可與單細(xì)胞測(cè)序?qū)拥葍?yōu)勢(shì)。每個(gè)SCRS均是一個(gè)信息豐富的生化指紋圖譜，可指示細(xì)胞的代謝狀態(tài)，因此可以基于單峰、多峰乃至全譜的組合模式進(jìn)行建模從而解析不同細(xì)胞表型?；诶庾V強(qiáng)大的表型識(shí)別能力發(fā)展的FlowRACS，無須分離培養(yǎng)、在單細(xì)胞精度直接鑒定單細(xì)胞種類，可并行測(cè)量底物代謝、物質(zhì)合成、代謝物互作網(wǎng)絡(luò)、環(huán)境應(yīng)激、物種間互作等代謝表型組及其細(xì)胞間異質(zhì)性。FlowRACS實(shí)現(xiàn)了活體單細(xì)胞超高通量拉曼分選的高度自動(dòng)化，為單細(xì)胞層面的代謝表型快檢、種質(zhì)資源挖掘和功能機(jī)制研究提供了新一代裝備解決方案［圖4（a）］。

3.1 儀器原理

RACS-Seq可以實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞表型與高質(zhì)量基因型對(duì)接，但其通量依然相對(duì)較低，難以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化操作，這也極大地限制了RACS-Seq在大體系突變體庫(kù)中的應(yīng)用。概言之，通量低是限制當(dāng)前RACS技術(shù)在單細(xì)胞表型檢測(cè)與分選中廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵瓶頸之一，急需發(fā)展高通量RACS技術(shù)。將拉曼光譜細(xì)胞識(shí)別技術(shù)與流式分選技術(shù)耦聯(lián)是建立高通量RACS技術(shù)的重要思路，即流式拉曼分選技術(shù)。

研究人員以RAMS［26］、RADS［27］、pDEPRADS［28］等流式分選技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)了FlowRACS，其自動(dòng)化程度及通量相比RACS-Seq更高，因此更適合于合成生物表型檢測(cè)和分選，已成功示范微藻、酵母等細(xì)胞的色素、油脂等表型的篩選。Zhang等［26］構(gòu)建了RAMS平臺(tái)，其通過集成電極施加介電場(chǎng)捕獲單細(xì)胞進(jìn)行拉曼精確檢測(cè)，利用電磁閥吸吮分離獲取目標(biāo)細(xì)胞，最終實(shí)現(xiàn)了色素酵母細(xì)胞的拉曼流式篩選（約60個(gè)/min）。這一技術(shù)被The Scientist專文推介，被認(rèn)為是通往高通量拉曼細(xì)胞分選的關(guān)鍵技術(shù)突破?；诮殡妼⒏咚倭鲃?dòng)單細(xì)胞捕獲在拉曼激光位點(diǎn)從而高效完成拉曼檢測(cè)的策略，為解決由于大多數(shù)細(xì)胞自發(fā)拉曼信號(hào)弱導(dǎo)致無法檢測(cè)高速流動(dòng)細(xì)胞的拉曼信號(hào)的瓶頸問題提供了新思路。為進(jìn)一步提高分選通量和分選準(zhǔn)確率，Wang等［27］通過先拉曼檢測(cè)后液滴包裹的策略搭建了RADS平臺(tái)，引入液滴微流控技術(shù)，使得系統(tǒng)的分選通量可達(dá)約260個(gè)細(xì)胞/min，針對(duì)雨生紅球藻中蝦青素含量的分選準(zhǔn)確率達(dá)到95%以上，分選后細(xì)胞存活率達(dá)93%，是當(dāng)時(shí)已報(bào)道工作中全譜分選通量最高的拉曼流式分選系統(tǒng)。但是，由于自然界中絕大多數(shù)細(xì)胞的自發(fā)拉曼信號(hào)較弱，RADS非捕獲的檢測(cè)策略使其同RAMS一樣局限于強(qiáng)拉曼信號(hào)（如共振拉曼信號(hào)）的檢測(cè)篩選。實(shí)現(xiàn)弱拉曼表型的檢測(cè)及高通量分選一直是拉曼分選的終極目標(biāo)之一。Wang等［28］在RADS平臺(tái)基礎(chǔ)上進(jìn)一步集成了介電捕獲細(xì)胞策略，開發(fā)了首套兼具普適性和通量的pDEP-RADS平臺(tái)，示范了油脂酵母甘油三酯含量和不飽和度的篩選，經(jīng)過一輪篩選成功從二酰基甘油?；D(zhuǎn)移酶（DGAT）基因庫(kù)中篩選出3個(gè)已報(bào)道的強(qiáng)功能基因和2個(gè)未報(bào)道的弱功能基因［28］。基于pDEP-RADS和已研制的介電聚焦技術(shù)，中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過程研究所（青島能源所）和青島星賽生物聯(lián)手推出國(guó)內(nèi)外首臺(tái)高通量拉曼流式分選儀FlowRACS，真正將拉曼分選推向市場(chǎng)應(yīng)用。然而，pDEP-RADS雖然解決了弱拉曼信號(hào)表型檢測(cè)的瓶頸問題，但其穩(wěn)定運(yùn)行時(shí)間僅有30 min，無法普適于大體系細(xì)胞篩選。為了提高系統(tǒng)的運(yùn)行時(shí)間以及系統(tǒng)的普適性，Wang等［9］近期開發(fā)了“介電誘導(dǎo)確定性側(cè)向位移實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞聚焦、捕獲/釋放的拉曼流式檢測(cè)技術(shù)”（positive dielectrophoresis induced deterministic lateral displacement-based Raman flow cytometry； pDEPDLD-RFC），通過寬流場(chǎng)高流量的進(jìn)樣策略，有效防止細(xì)胞沉降，從而實(shí)現(xiàn)了長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定運(yùn)行（＞5 h），并證明其針對(duì)人體細(xì)胞（腫瘤）、植物（微藻）、酵母和細(xì)菌等多種細(xì)胞類型的廣譜適用性?；谏鲜鲫P(guān)鍵技術(shù)突破，青島能源所和青島星賽生物聯(lián)手推出了兼具廣譜通用性、高通量、運(yùn)行穩(wěn)定性等性能的新一代FlowRACS，為活體單細(xì)胞代謝表型組的高通量檢測(cè)提供了全新工具。

3.2 應(yīng)用

3.2.1 基于FlowRACS的DGATs酶活的篩選

目前，流式拉曼分選服務(wù)于合成生物學(xué)領(lǐng)域中最為成功的應(yīng)用案例是基于FlowRACS的DGATs酶活篩選［28］。在酶和微生物細(xì)胞工廠的設(shè)計(jì)中，篩選酶庫(kù)的胞內(nèi)活性通常是一個(gè)限速步驟。傳統(tǒng)的DGATs篩選方法通常包括候選酶基因在底盤細(xì)胞中的表達(dá)、細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)以積累足夠生物質(zhì)、從生物質(zhì)中提取并通過薄層色譜法分離甘油三酯（TAG）產(chǎn)物、用氣相和液相質(zhì)譜來分析和定量TAG中組分等繁雜步驟［36-37］，這一流程耗時(shí)耗力。Wang等［28］以產(chǎn)油酵母突變體庫(kù)的篩選進(jìn)行了應(yīng)用示范。將多個(gè)基因進(jìn)行同步轉(zhuǎn)化構(gòu)建突變體庫(kù)，經(jīng)誘導(dǎo)累積TAG后直接進(jìn)行基于FlowRACS的篩選，分選后的細(xì)胞一部分進(jìn)行高通量測(cè)序以檢測(cè)目標(biāo)細(xì)胞中的功能基因，另一部分平板培養(yǎng)后進(jìn)行單克隆測(cè)序以檢測(cè)每個(gè)克隆的細(xì)胞類型，從而獲取到目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)［圖4（b）］。

結(jié)果表明，基于FlowRACS篩選甘油三酯含量的酵母表現(xiàn)出接近理論極限的準(zhǔn)確性，約120個(gè)（細(xì)胞）/min的通量和充分的活力保存，而篩選脂肪酸不飽和程度（FA-DU）在約40個(gè)（細(xì)胞）/min的準(zhǔn)確率為82%。從表達(dá)DGATs的酵母文庫(kù)中成功獲得3個(gè)已報(bào)道的強(qiáng)效基因和2個(gè)從未報(bào)道過的弱效基因［28］。這是FlowRACS用于酶發(fā)現(xiàn)的首次演示，與基于培養(yǎng)的方法相比，它在時(shí)間、耗材和勞動(dòng)力方面節(jié)省了數(shù)百倍。

3.2.2 高通量高穩(wěn)定性的拉曼流式細(xì)胞術(shù)

基于新一代FlowRACS，研究人員開發(fā)了其在腫瘤細(xì)胞分類、微藻合成過程監(jiān)控、產(chǎn)油酵母多表型監(jiān)控、細(xì)菌藥敏性檢測(cè)等方面的應(yīng)用，展現(xiàn)了其在高通量拉曼流式檢測(cè)的廣闊應(yīng)用前景（圖5）［9］。

圖5 基于FlowRACS單細(xì)胞拉曼表型檢測(cè)分選的應(yīng)用Fig. 5 Applications of FlowRACS for Raman-activated single-cell phenotype detection and sorting

（1）植物生物制造過程的代謝監(jiān)控 基于共振拉曼信號(hào)，實(shí)現(xiàn)了雨生紅球藻中蝦青素含量的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，從而示范了單細(xì)胞精度的蝦青素累積過程細(xì)胞工廠代謝狀態(tài)的監(jiān)控，并考察了高光和缺氮等條件對(duì)細(xì)胞蝦青素累積速度及其同步性的影響。其蝦青素含量檢測(cè)速度達(dá)約2700 events/min，是目前最高的自發(fā)拉曼檢測(cè)/分選通量。

（2）酵母生物制造過程的代謝監(jiān)控 基于非共振拉曼信號(hào)，示范了油脂酵母中細(xì)胞代謝活力、甘油三酯含量、油脂不飽和度等多個(gè)關(guān)鍵代謝表型的同步動(dòng)態(tài)監(jiān)控，進(jìn)而通過拉曼組機(jī)器學(xué)習(xí)、拉曼組內(nèi)關(guān)聯(lián)分析（intra-Ramanome correlation analysis，IRCA）等算法，實(shí)現(xiàn)了單細(xì)胞代謝狀態(tài)（準(zhǔn)確率＞96%）的實(shí)時(shí)鑒定，以及細(xì)胞內(nèi)代謝物相互轉(zhuǎn)化網(wǎng)絡(luò)的實(shí)時(shí)重建。

（3）細(xì)菌藥敏性的流式快檢 基于單細(xì)胞中心前期提出的重水飼喂單細(xì)胞拉曼藥敏原理，以大腸桿菌和多種常見抗生素為例，開發(fā)了流式藥敏快檢技術(shù)，并通過與拉曼藥物應(yīng)激條形碼（Raman barcode for cellular stress-response，RBCS）、IRCA、拉曼組機(jī)器學(xué)習(xí)等算法結(jié)合，證明該流式藥敏快檢技術(shù)還能實(shí)時(shí)地判斷單菌體精度的藥物應(yīng)激狀態(tài)、構(gòu)建細(xì)胞內(nèi)代謝物相互轉(zhuǎn)化網(wǎng)絡(luò)等，從而揭示細(xì)菌-藥物互作機(jī)制。此外，流式檢測(cè)大大提高了藥敏檢測(cè)中SCRS取樣深度，對(duì)于識(shí)別群體中通常占比很低的耐藥細(xì)胞具有重要的意義。

（4）腫瘤細(xì)胞類型的快速區(qū)分 基于SCRS中信息豐富的指紋區(qū)，以膀胱癌、肺癌、腎細(xì)胞癌、乳腺癌等細(xì)胞株為例，證明流式拉曼技術(shù)耦合拉曼組機(jī)器學(xué)習(xí)算法，能以平均大于95%的準(zhǔn)確率完成腫瘤細(xì)胞類型的快速判別。該方法對(duì)于腫瘤細(xì)胞質(zhì)量檢測(cè)等應(yīng)用具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

3.3 小結(jié)

FlowRACS的研制與發(fā)展經(jīng)過了漫長(zhǎng)的技術(shù)迭代，結(jié)合了多種流式分選技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，發(fā)展為以pDEP-RADS技術(shù)為核心的儀器。FlowRACS的出現(xiàn)代表著拉曼流式分選儀真正走向市場(chǎng)應(yīng)用的開端，然而儀器的研制與發(fā)展需要經(jīng)受住市場(chǎng)的考驗(yàn)。FlowRACS在進(jìn)行實(shí)際樣品篩選時(shí)，由于樣品沉降導(dǎo)致的系統(tǒng)運(yùn)行時(shí)間較短。研究人員針對(duì)這一瓶頸問題，從原理創(chuàng)新開發(fā)了pDEP-DLD-RFC，通過寬流場(chǎng)高流量的進(jìn)樣策略有效防止細(xì)胞沉降，從而實(shí)現(xiàn)了長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定運(yùn)行（>5 h）。以pDEPDLD-RFC為技術(shù)核心的新一代FlowRACS目前僅具有拉曼流式檢測(cè)的功能，具有高通量拉曼流式分選功能的儀器版本已經(jīng)在研制中，將于近期發(fā)布。FlowRACS儀器以免培養(yǎng)和非標(biāo)記的方式有效地建立單細(xì)胞表型-基因型連接，可高通量、高穩(wěn)定性地分選功能單細(xì)胞，以滿足合成生物學(xué)等領(lǐng)域?qū)渭?xì)胞高通量表型篩選的需求。

4 總結(jié)展望

合成生物學(xué)的迅速發(fā)展為基于SCRS技術(shù)的合成表型測(cè)試分選裝備的發(fā)展提供了新的機(jī)遇。合成細(xì)胞表型的測(cè)試和分選是合成生物學(xué)的重要核心之一，也是當(dāng)前的限速步驟之一。發(fā)展高效的表型檢測(cè)和分選技術(shù)對(duì)于加速合成生物學(xué)的發(fā)展至關(guān)重要［38］。SCRS技術(shù)因其具有活體無損、非標(biāo)記式、提供全景式表型、能分辨復(fù)雜功能、快速且低成本、能與組學(xué)分析聯(lián)動(dòng)等優(yōu)勢(shì)，被認(rèn)為是一種理想的表型識(shí)別技術(shù)［18-20］?；赟CRS技術(shù)強(qiáng)大的表型識(shí)別能力，國(guó)內(nèi)外已搭建了針對(duì)不同應(yīng)用場(chǎng)景的RACS平臺(tái)?；赗ACS發(fā)展的多種技術(shù)在合成生物學(xué)領(lǐng)域的潛力挖掘與實(shí)現(xiàn)還需克服諸多挑戰(zhàn)，同時(shí)也存在巨大機(jī)遇。

在基于拉曼光譜的表型檢測(cè)方面，針對(duì)不同場(chǎng)景、不同細(xì)胞、不同表型的拉曼表型檢測(cè)表明，SCRS可以解析或預(yù)測(cè)不同細(xì)胞功能表型，如在一定程度上量化檢測(cè)細(xì)胞利用含氫［39］、含碳［40］等底物的代謝速率、測(cè)定各種拉曼敏感產(chǎn)物（色素［41］、甘油三酯［42］、淀粉［43］、蛋白［44］等）的多樣性及其含量、表征細(xì)胞的環(huán)境應(yīng)激性（如微生物藥敏［45］、微生物藥物應(yīng)激機(jī)制［46］、腫瘤藥敏性與藥物應(yīng)激機(jī)制［47］等）、檢測(cè)細(xì)胞之間的代謝互作［48］、重建細(xì)胞內(nèi)代謝物相互轉(zhuǎn)化網(wǎng)絡(luò)（拉曼組內(nèi)關(guān)聯(lián)分析；IRCA）［49］，也可區(qū)分不同的物種［50］等。盡管SCRS具有這些的優(yōu)點(diǎn)，但也在靈敏度和噪聲等方面存在一些劣勢(shì)。SCRS的信號(hào)強(qiáng)度通常較弱，因此，需要高功率的激光和高靈敏度的光譜儀才能夠獲取可靠的信號(hào)。對(duì)于一些化學(xué)成分含量較低的樣品可能會(huì)無法檢測(cè)到，或者誤判成噪聲信號(hào)。另外，在測(cè)量過程中會(huì)受到許多干擾。例如，來自儀器的背景噪聲、激光的強(qiáng)烈散射和熒光等。這些噪聲會(huì)干擾到拉曼信號(hào)的檢測(cè)和解析。因此。需要在實(shí)際應(yīng)用中加以考慮和解決。例如，基于無須預(yù)知靶點(diǎn)的標(biāo)記策略，如穩(wěn)定同位素標(biāo)記（13C、15N、2H等）策略［18］，可在一定程度上補(bǔ)償并提高檢測(cè)靈敏度、特異性等。

在原理創(chuàng)新方面，現(xiàn)有這些平臺(tái)中，靜態(tài)模式的RACS能精確將單個(gè)細(xì)胞分離到單管/孔中，從而和下游單細(xì)胞組學(xué)無縫銜接，以支撐功能單細(xì)胞的挖掘，但是目前的通量和自動(dòng)化程度較低；流動(dòng)模式的RACS自動(dòng)化程度更高，在分選通量上也有了數(shù)量級(jí)的提高，但是目前的基于流動(dòng)模式分選后的單細(xì)胞往往是以群體分類，丟失了索引信息。因此，根據(jù)實(shí)際的應(yīng)用需求選擇合適的模式，充分利用不同模式RACS的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，有望在一定程度上解決合成生物表型檢測(cè)和分選的瓶頸問題。另外，研制結(jié)合兩種模式優(yōu)勢(shì)的RACS有望帶給合成生物學(xué)領(lǐng)域更大的發(fā)展。

在儀器研制方面，目前的RACS平臺(tái)技術(shù)更多處于實(shí)驗(yàn)室搭建狀態(tài)，以RACS技術(shù)為核心的市場(chǎng)化儀器研制方面還比較空缺。以RACE為關(guān)鍵技術(shù)的PRECI SCS，可實(shí)現(xiàn)微生物單細(xì)胞的自動(dòng)化分離并耦合下游單細(xì)胞測(cè)序，但由于RACE對(duì)細(xì)胞的損傷，導(dǎo)致其存在單細(xì)胞全基因組覆蓋度低的問題。以RAGE為關(guān)鍵技術(shù)的RACS-Seq，同樣實(shí)現(xiàn)了微生物單細(xì)胞分離并耦合下游單細(xì)胞測(cè)序，其損傷更小，單細(xì)胞全基因組測(cè)序覆蓋度更高，但第一代機(jī)器自動(dòng)化程度較低。為了提高分選的便利性和通量，研究人員開發(fā)了EasySort系列儀器進(jìn)行了原理的創(chuàng)新和迭代，引入人工智能輔助的單細(xì)胞檢測(cè)、目標(biāo)細(xì)胞識(shí)別、目標(biāo)單細(xì)胞液滴導(dǎo)出技術(shù)，并與下游高通量單細(xì)胞測(cè)序平臺(tái)耦合，初步實(shí)現(xiàn)了單細(xì)胞分選的自動(dòng)化運(yùn)行。此外，以pDEP-RADS為技術(shù)核心的FlowRACS，其自動(dòng)化程度及通量更高，因此更適合于合成生物表型檢測(cè)和分選，F(xiàn)lowRACS的出現(xiàn)代表著拉曼流式分選儀真正走向市場(chǎng)應(yīng)用的開端。然而儀器的研制與發(fā)展需要經(jīng)受住市場(chǎng)的考驗(yàn)。以pDEP-DLD-RFC為技術(shù)核心進(jìn)行了系統(tǒng)的迭代升級(jí)，推出了新一代FlowRACS，將大大加速拉曼流式分選平臺(tái)的推廣應(yīng)用。目前已在研制高通量流式拉曼分選儀版本，有望近期發(fā)布。該儀器已成功示范微藻、酵母等細(xì)胞的色素、油脂等表型的篩選，腫瘤細(xì)胞分類、微藻合成過程監(jiān)控、產(chǎn)油酵母多表型監(jiān)控、細(xì)菌藥敏性檢測(cè)，其更多應(yīng)用場(chǎng)景有待市場(chǎng)的拓展。

最后，在儀器國(guó)產(chǎn)化方面，我國(guó)在拉曼分選儀研制方面處于國(guó)際領(lǐng)先地位，雖然已經(jīng)自主開發(fā)了智能化的光譜分析系統(tǒng)以及操作軟件，但儀器的一些核心部件，如光譜儀、CCD等仍依賴于進(jìn)口。儀器國(guó)產(chǎn)化的研制是接下來各行業(yè)共同的努力目標(biāo)。