胡哲輝，徐娟，卞光凱

（1 中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院合成生物學(xué)研究所，廣東 深圳 518055； 2 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院，果蔬園藝作物種質(zhì)創(chuàng)新與利用全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430071）

天然產(chǎn)物通常是指來源于動(dòng)物、植物或微生物的次生代謝物。具有多種生物學(xué)功能及活性，廣泛應(yīng)用于藥物、食品、營養(yǎng)添加劑和化妝品等領(lǐng)域［1］。特別是在癌癥治療和傳染病防治方面，天然產(chǎn)物藥物發(fā)揮著重要作用［2-3］。相較于傳統(tǒng)的有機(jī)合成分子，天然產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)更加復(fù)雜多樣，通常具有良好的生物活性和多種生物學(xué)功能。目前，新穎天然產(chǎn)物挖掘以及高附加值天然產(chǎn)物高效合成仍是該領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。

迄今為止，研究人員已通過產(chǎn)物直接分離、同源激活和異源表達(dá)等策略挖掘了大量天然產(chǎn)物［4-5］。然而，這些經(jīng)典的研究策略存在挖掘通量低和產(chǎn)物合成效率低等共性問題，難以滿足天然產(chǎn)物研究高速發(fā)展的需求［6-7］。為了解決這些問題，一方面，可利用基因組、代謝組和轉(zhuǎn)錄組等多組學(xué)方法挖掘新穎的天然產(chǎn)物生物合成元件；另一方面，可利用數(shù)據(jù)庫現(xiàn)有功能元件，對(duì)代謝通路和生物合成途徑進(jìn)行理性設(shè)計(jì)和優(yōu)化，以構(gòu)建高效底物供給的微生物底盤，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物的高效合成［8-9］。在過去的二十年中，研究人員已利用高效底物供給的微生物底盤實(shí)現(xiàn)了多種天然產(chǎn)物的高效合成，如生物燃料法尼烯［10］，抗瘧疾藥物青蒿素前體青蒿酸［11-12］，抗癌藥物紫杉醇前體紫杉二烯［13-14］，以及檸檬烯、瓦倫烯等香精原料［15-17］。

然而，在取得一系列研究進(jìn)展的同時(shí)，天然產(chǎn)物生物合成研究仍面臨諸多挑戰(zhàn)。首先，在產(chǎn)物挖掘方面，隨著基因組數(shù)據(jù)的快速增長，功能未知的天然產(chǎn)物生物合成基因（簇）數(shù)量已遠(yuǎn)超已知功能的基因簇。因此，如何有效利用海量基因組信息高效挖掘天然產(chǎn)物“暗物質(zhì)”成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)［18］。其次，在產(chǎn)物高效合成方面，研究人員需要投入大量時(shí)間來對(duì)菌株和發(fā)酵生產(chǎn)工藝進(jìn)行代謝工程、酶工程和發(fā)酵工程等多個(gè)方面的系統(tǒng)改造和優(yōu)化，以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物的高效合成［19-21］。此外，在產(chǎn)物篩選和檢測方面，快速、靈敏、高通量的目標(biāo)產(chǎn)物篩選和檢測方法的匱乏仍然是限制其生物合成研究高效開展的瓶頸之一。因此，研究人員亟需開發(fā)更快速、靈敏且高通量的篩選和檢測方法，以推動(dòng)天然產(chǎn)物的挖掘和高效合成改造過程。

針對(duì)上述問題，自動(dòng)化高通量（automated high-throughput， Auto-HTP）技術(shù)在天然產(chǎn)物的挖掘、高效合成和快速篩選等研究領(lǐng)域逐漸得到廣泛應(yīng)用，并取得了顯著的成果［22-23］。利用自動(dòng)化高通量設(shè)備進(jìn)行海量的工程化試錯(cuò)，取代傳統(tǒng)的勞動(dòng)密集型研究范式，能夠更快速、低成本、多循環(huán)地完成“設(shè)計(jì)-構(gòu)建-測試-學(xué)習(xí)”這一閉環(huán)，實(shí)現(xiàn)天然產(chǎn)物的高效自動(dòng)化挖掘，并為構(gòu)建高附加值化合物細(xì)胞工廠提供可行方案［24-26］。本文聚焦于Auto-HTP技術(shù)在天然產(chǎn)物生物合成領(lǐng)域的應(yīng)用。首先，介紹了相對(duì)于傳統(tǒng)篩選方法，高通量篩選的優(yōu)缺點(diǎn)，以及Auto-HTP工作站的組成部分和運(yùn)行流程，并概述了目前國內(nèi)外Auto-HTP基礎(chǔ)設(shè)施平臺(tái)的發(fā)展現(xiàn)狀。隨后，重點(diǎn)介紹了當(dāng)前Auto-HTP技術(shù)在天然產(chǎn)物挖掘、高效合成和快速檢測方面的研究進(jìn)展。最后，總結(jié)了目前Auto-HTP技術(shù)在天然產(chǎn)物生物合成領(lǐng)域面臨的挑戰(zhàn)，并展望了未來的發(fā)展趨勢。Auto-HTP技術(shù)的應(yīng)用將為天然產(chǎn)物的深入挖掘和高效生物合成提供強(qiáng)大的支撐。

1 自動(dòng)化高通量技術(shù)

1.1 自動(dòng)化高通量技術(shù)的優(yōu)勢

Auto-HTP技術(shù)的發(fā)展始于20世紀(jì)90年代初，并隨著對(duì)高通量處理的需求不斷增加，進(jìn)一步推動(dòng)了小型化和自動(dòng)化技術(shù)的發(fā)展［27］。自動(dòng)化步驟包括取樣、稀釋樣品、混合樣品轉(zhuǎn)移、目標(biāo)產(chǎn)物檢測以及數(shù)據(jù)分析等［28-29］。隨著新設(shè)備、新技術(shù)的推出，如菌落拾取器［30］、液體處理系統(tǒng)［31］、熒光激活細(xì)胞分選［32］和液體微流體技術(shù)［33］，Auto-HTP的應(yīng)用范圍得到極大的擴(kuò)展?，F(xiàn)如今，Auto-HTP已成為常規(guī)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)，在合成生物學(xué)的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究中得到廣泛應(yīng)用。表1對(duì)比了傳統(tǒng)方法和Auto-HTP技術(shù)在天然產(chǎn)物挖掘、高效合成和快速檢測三個(gè)方面的特點(diǎn)，展示了Auto-HTP在天然產(chǎn)物生物合成領(lǐng)域廣闊的應(yīng)用前景。

表1 傳統(tǒng)方法與自動(dòng)化高通量方法在天然產(chǎn)物生物合成中的比較Table 1 A comparison of automated high-throughput and traditional methods in natural product biosynthesis

在利用“突變-篩選”策略獲取高產(chǎn)菌株的過程中，傳統(tǒng)方法通常使用瓊脂平板活性篩選，如基于透明圈或顏色圈的篩選，或是基于抗性瓊脂平板的選擇性篩選［34］［圖1（a）］。然而，這些方法對(duì)突變體間的微小差異的分辨率低，僅適用于對(duì)突變體庫進(jìn)行初步篩選，并需要結(jié)合其他方法進(jìn)行精確定量分析［35］。為了解決上述問題，基于熒光或吸光度精確檢測目標(biāo)產(chǎn)物的微孔板篩選法應(yīng)運(yùn)而生，并已廣泛應(yīng)用于酶和細(xì)胞工廠的定向改造［36-37］。通過引入自動(dòng)單克隆采集系統(tǒng)、液體自動(dòng)處理系統(tǒng)等自動(dòng)化設(shè)備，研究通量得以提升，同時(shí)也顯著減少了人力和時(shí)間成本［38］。目前這些自動(dòng)化設(shè)備可以代替研究人員完成一些耗時(shí)的實(shí)驗(yàn)操作，包括分子克隆、質(zhì)粒構(gòu)建以及對(duì)應(yīng)底盤系統(tǒng)中目標(biāo)基因功能的測試等［圖1（b）］。目前已有研究人員將自動(dòng)化高通量設(shè)備引入天然產(chǎn)物的挖掘領(lǐng)域，結(jié)合高產(chǎn)微生物底盤，有效解決了傳統(tǒng)天然產(chǎn)物挖掘過程中效率低和通量低的瓶頸，具體內(nèi)容在將后文詳細(xì)介紹。

圖1 不同通量篩選方法的比較［41-42］Fig. 1 A comparison of different screening methods[41-42]

隨著生物技術(shù)快速進(jìn)步和儀器設(shè)備的革新，熒光激活細(xì)胞分選（fluorescence-activated cell sorting，F(xiàn)ACS）和液滴微流控分選（droplet-based microfluidic sorting，DMFS）技術(shù)在天然產(chǎn)物的快速檢測中得到了廣泛應(yīng)用［31-32］。其中，F(xiàn)ACS是一種基于流式細(xì)胞儀的高效熒光激活細(xì)胞分選技術(shù)，可根據(jù)單個(gè)細(xì)胞的熒光信號(hào)差異進(jìn)行精確分選，其通量高達(dá)每秒106個(gè)細(xì)胞［39-40］。該技術(shù)已較為成熟，并適用于細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞膜上的目標(biāo)產(chǎn)物的篩選［圖1（c）］。對(duì)于胞外游離產(chǎn)物，則需要結(jié)合液滴微流控技術(shù)對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行封裝，并對(duì)其周邊微環(huán)境進(jìn)行分析［圖1（d）］［41］。此外，F(xiàn)ACS和DMFS與生物傳感器、拉曼光譜等先進(jìn)技術(shù)結(jié)合，可以進(jìn)一步提高天然產(chǎn)物高產(chǎn)菌株的篩選通量和效率。

1.2 自動(dòng)化高通量設(shè)施平臺(tái)的建立

在當(dāng)前天然產(chǎn)物研究中，Auto-HTP的有效利用對(duì)于加快天然產(chǎn)物研究具有重要意義。通過自動(dòng)化替代傳統(tǒng)的費(fèi)時(shí)費(fèi)力的常規(guī)操作，例如分子克隆和菌株構(gòu)建，可以實(shí)現(xiàn)快速、大規(guī)模的工程試錯(cuò)閉環(huán)運(yùn)行，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)自然界豐富天然產(chǎn)物資源的快速挖掘［43］。自動(dòng)化高通量設(shè)施平臺(tái)在國內(nèi)外得到積極發(fā)展，為自動(dòng)化合成生物技術(shù)的進(jìn)一步推動(dòng)提供了支持。例如，美國伊利諾伊大學(xué)的iBioFAB（Illinois Biological Foundry for Advanced Biomanufacturing）、英國愛丁堡大學(xué)的EGF（Edinburgh Genome Foundry）和帝國理工學(xué)院為核心組建的SynBICITE（Synthetic Biology Innovation， Commercial and Industrial Translation Engine）等機(jī)構(gòu)［24］。此外，全球合成生物設(shè)施聯(lián)盟（Global Biofoundry Alliance， GBA）的成立進(jìn)一步促進(jìn)了全球范圍內(nèi)的合作和交流［44］。其中，中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院牽頭建設(shè)的“深圳合成生物研究重大科技基礎(chǔ)設(shè)施”與天津大學(xué)合成生物學(xué)前沿科學(xué)中心成為GBA中來自中國的發(fā)起單位［45］，展示了中國在該領(lǐng)域的重要地位和貢獻(xiàn)。

在合成生物學(xué)的研發(fā)過程中，快速試錯(cuò)具有巨大優(yōu)勢。因此，除國家科研機(jī)構(gòu)，自動(dòng)化高通量篩選技術(shù)也成為企業(yè)的關(guān)鍵技能。包括Amyris、Ginkgo Bioworks、凱賽生物等國內(nèi)外合成生物學(xué)領(lǐng)域重要企業(yè)，都已建立了高通量、自動(dòng)化、數(shù)據(jù)化的篩選平臺(tái)，以縮短從菌株改造到實(shí)現(xiàn)量產(chǎn)的研發(fā)周期。Ginkgo Bioworks公司作為自動(dòng)化平臺(tái)的先驅(qū)之一，其第一代自動(dòng)化鑄造廠每月可完成多達(dá)1.5萬個(gè)自動(dòng)化實(shí)驗(yàn)，隨后推出的Biowork2進(jìn)一步提高了設(shè)備集成度和小型化程度，使效率提升了6倍［46］。這些設(shè)施平臺(tái)在硬件方面采用微孔板作為載具，并配備自動(dòng)化儀器，例如自動(dòng)化移液工作站、自動(dòng)冷凍離心機(jī)、恒溫培養(yǎng)箱、連續(xù)分液儀、封膜儀、撕膜儀、自動(dòng)化PCR儀和自動(dòng)挑克隆機(jī)器人等。這些儀器之間通過軌道機(jī)械臂對(duì)接，實(shí)現(xiàn)樣品、試劑和耗材在不同設(shè)備之間的自動(dòng)化傳輸［圖2（a）］。同時(shí)，還需要一個(gè)集成軟件系統(tǒng)自動(dòng)化控制儀器設(shè)備的正常運(yùn)行［47］。以釀酒酵母為例，Auto-HTP工作站可自動(dòng)化完成分子克隆、酵母轉(zhuǎn)化、菌株篩選等實(shí)驗(yàn)室常規(guī)操作［圖2（b）］，極大地提高工作效率并節(jié)省了人力和物力成本。

圖2 自動(dòng)化高通量工作站Fig. 2 Automated high-throughput workstation

隨著合成生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，自動(dòng)化、智能化、信息化的研究平臺(tái)已成為工、農(nóng)、醫(yī)等各大領(lǐng)域應(yīng)用的科研利器。例如，伊利諾伊大學(xué)趙惠民教授團(tuán)隊(duì)［48］開發(fā)了一種自動(dòng)化組裝類轉(zhuǎn)錄激活因子感受器核酸酶（transcription activator-like effector nucleases， TALEN）蛋白的方法。該方法利用iBioFAB平臺(tái)實(shí)現(xiàn)DNA自動(dòng)化組裝，每天可以構(gòu)建多達(dá)1000個(gè)編碼TALEN蛋白的DNA，且每對(duì)TALEN表達(dá)載體的成本僅為商業(yè)售價(jià)的0.3%。此外，iBioFAB平臺(tái)可全自動(dòng)對(duì)釀酒酵母基因組進(jìn)行定向進(jìn)化，快速獲得最具乙酸耐受能力的酵母菌株［49］?；贏uto-HTP平臺(tái)在其他領(lǐng)域展現(xiàn)的強(qiáng)大功能，我們有理由相信該策略將為天然產(chǎn)物研究提供強(qiáng)有力的支持。

2 自動(dòng)化高通量技術(shù)在天然產(chǎn)物生物合成中的應(yīng)用

2.1 天然產(chǎn)物的挖掘

傳統(tǒng)的天然產(chǎn)物挖掘策略通常是基于單一生物樣本，對(duì)其天然產(chǎn)物直接分離、同源激活、異源表達(dá)。這些經(jīng)典策略一定程度上實(shí)現(xiàn)了天然產(chǎn)物的有效挖掘［4，50］。然而，在面對(duì)低豐度的產(chǎn)物挖掘時(shí)仍顯得捉襟見肘，且大部分研究仍局限于單個(gè)基因（簇）的異源表達(dá)，存在通量低、耗時(shí)長和效率低等問題［51］，使得天然產(chǎn)物的挖掘進(jìn)入了瓶頸期。為應(yīng)對(duì)這一挑戰(zhàn)，武漢大學(xué)劉天罡教授［5］提出“一類鑰匙一類鎖”的研究理念，并開發(fā)了一系列微生物萜類高產(chǎn)底盤，以充分釋放酶的產(chǎn)物合成潛力。這種方法顯著提高了產(chǎn)物產(chǎn)量，將研究效率提升了3～5倍，加速了萜類合酶的挖掘進(jìn)程。

近年來，隨著基因組測序技術(shù)和生物信息學(xué)計(jì)算工具興起和蓬勃發(fā)展，使得大量微生物基因組信息得以擴(kuò)展并存儲(chǔ)在數(shù)據(jù)庫中［52-55］。這為研究人員提供了大量功能未知的天然產(chǎn)物生物合成基因（簇），然而傳統(tǒng)的個(gè)性化挖掘策略難以滿足海量基因（簇）挖掘的需求。因此，劉天罡教授團(tuán)隊(duì)［56］將自動(dòng)化高通量平臺(tái)引入天然產(chǎn)物生物合成領(lǐng)域，并結(jié)合釀酒酵母高產(chǎn)底盤，對(duì)公共數(shù)據(jù)庫所有真菌來源稀有嵌合萜類合酶進(jìn)行挖掘，成功地從34個(gè)新的嵌合萜類合酶中鑒定了24個(gè)二萜和二倍半萜產(chǎn)物［圖3（a）］，數(shù)量超過了已報(bào)道該類酶總數(shù)的一倍。該策略為萜類化合物的挖掘提供了一個(gè)強(qiáng)大而高效的方法，擺脫了對(duì)生物樣本的依賴，充分挖掘并利用數(shù)據(jù)庫現(xiàn)有資源。同時(shí)，實(shí)現(xiàn)了萜類合酶的跨物種批量研究和實(shí)驗(yàn)過程的自動(dòng)化，推動(dòng)了萜類天然產(chǎn)物挖掘進(jìn)入規(guī)?；妥詣?dòng)化研究階段［57-58］。

圖3 基于生物鑄造平臺(tái)對(duì)新功能萜類基因（簇）的高效挖掘及抗炎新分子mangicol J的高效合成［51，56］Fig. 3 The application of biocasting in efficient mining of new functional terpenoid genes (gene clusters) and the biosynthesis of mangicol J, a new anti-inflammatory molecule[51,56]

隨后該團(tuán)隊(duì)采用組合生物合成策略，對(duì)絲狀真菌萜類合酶基因簇進(jìn)行系統(tǒng)挖掘。開發(fā)了以米曲霉（Aspergillus oryzae）作為底盤的Auto-HTP生物鑄造體系，在自動(dòng)化平臺(tái)上實(shí)現(xiàn)了從質(zhì)粒構(gòu)建、基因簇重建到生物活性篩選等全流程的高通量自動(dòng)化操作。利用該方案，成功地重建了39個(gè)絲狀真菌萜類基因簇，構(gòu)建了208個(gè)突變株，并檢測到185個(gè)萜類產(chǎn)物［圖3（b）～（e）］，將實(shí)驗(yàn)周期縮短至29天，極大地提高了研究效率，并實(shí)現(xiàn)了研究方法的迭代升級(jí)。通過該方案，獲得具有顯著抗炎活性的二倍半萜產(chǎn)物mangicol J［圖3（c）］，并揭示了其生物合成機(jī)制［圖3（d）］。通過代謝途徑改造，將mangicol J產(chǎn)量提升了111倍［圖3（e）］［51］。這一“基于微生物高產(chǎn)底盤和生物鑄造平臺(tái)”的萜類產(chǎn)物創(chuàng)新挖掘策略，為萜類產(chǎn)物的挖掘和開發(fā)提供了包括“基因簇挖掘—活性篩選—生物合成機(jī)制解析—產(chǎn)物高效合成”等流程在內(nèi)的高效解決方案，克服了傳統(tǒng)挖掘方法中通量低的限制。相信該策略將在未來推動(dòng)其他類型天然產(chǎn)物的快速挖掘，并加速天然產(chǎn)物研究領(lǐng)域的發(fā)展。

2.2 天然產(chǎn)物的高效合成

微生物細(xì)胞工廠在生物制造中扮演著重要的角色，但通常需要經(jīng)過多輪迭代改造才能滿足實(shí)際的生產(chǎn)需求。這一過程中，高效獲得具有目標(biāo)特性的工程菌株至關(guān)重要［59］。然而，受通量低和檢測速度慢等多種因素限制，傳統(tǒng)方法在突變體大規(guī)模篩選時(shí)耗時(shí)較長［32，60］。通過Auto-HTP可以快速高效地對(duì)一系列底盤細(xì)胞進(jìn)行多維改造，從而獲得高效天然產(chǎn)物微生物細(xì)胞工廠。例如，Amyris公司的自動(dòng)化菌株改造平臺(tái)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)底盤細(xì)胞的持續(xù)改造，配置的高通量、自動(dòng)化、數(shù)據(jù)化的篩選系統(tǒng)每周平均可以篩選出350個(gè)高產(chǎn)法尼烯菌株，顯著縮短了從菌株改造到實(shí)現(xiàn)量產(chǎn)的研發(fā)周期。利用該平臺(tái)成功在人工酵母中合成角鯊烯，用于替代傳統(tǒng)的鯊魚肝油提取方法［44］。這種技術(shù)不僅為醫(yī)藥、食品等多個(gè)領(lǐng)域提供了優(yōu)良的細(xì)胞工廠，也是實(shí)現(xiàn)“造物致用”的重要手段之一。

近年來，研究人員通過不同的檢測原理和針對(duì)各種產(chǎn)物的策略，成功提高了多種天然產(chǎn)物工業(yè)菌株產(chǎn)量，為工業(yè)生產(chǎn)帶來了可觀的經(jīng)濟(jì)價(jià)值［61-63］。例如，Lauchli等［64］成功合成了一種含有異戊二烯二磷酸的乙烯基醚，其結(jié)構(gòu)類似于FPP，經(jīng)萜類合酶（terpene synthase，TPS）催化后該分子會(huì)釋放出甲醇。接著，在倍半萜合酶BcBOT2定向進(jìn)化過程中，研究人員使用甲醇偶聯(lián)酶測定法對(duì)萜類產(chǎn)物hemiacetal進(jìn)行測定，并利用高通量篩選技術(shù)對(duì)2800個(gè)突變株進(jìn)行篩選。在保證產(chǎn)物組成、酶活等其他特性不變的前提下，大幅提升了該酶的熱穩(wěn)定性。這一技術(shù)的應(yīng)用成功加速了hemiacetal的工業(yè)化生產(chǎn)研究進(jìn)程，同時(shí)也為其他具有工業(yè)應(yīng)用價(jià)值的萜類化合物研究提供了一種可行的方法。Furubayashi等［65］開發(fā)了一種基于底物競爭的TPS高通量比色測定方法，通過TPS與類胡蘿卜素合成途徑對(duì)底物的競爭導(dǎo)致最終溶液的顏色深淺差異，來評(píng)估紫杉二烯合酶、馬兜鈴烯合酶、香葉醇合酶的活性。Zhou等［66］通過易錯(cuò)PCR對(duì)酪氨酸解氨酶（tyrosine ammonia-lyase，TAL）進(jìn)行隨機(jī)誘變，并利用auto-HTP快速、高通量篩選高產(chǎn)突變株，通過檢測315 nm處的吸光度從眾多突變株中篩選出3種對(duì)香豆酸生產(chǎn)滴度最高的：MT-S9N，MT-A11T和MT-E518V。對(duì)三位點(diǎn)同時(shí)突變（MT-S9N/-A11T/-E518V）進(jìn)一步提高了酶活性，相較于野生型TAL提高了65.9%。

此外，研究人員通過改進(jìn)傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)方法，不僅提升了培養(yǎng)通量和培養(yǎng)能力，還進(jìn)一步降低了試劑耗材的消耗和勞動(dòng)力成本［67-68］。其中，由我國研究人員研發(fā)的微生物微液滴培養(yǎng)儀，能夠利用液滴微流控、光電傳感與控制和自動(dòng)化技術(shù)，實(shí)現(xiàn)微生物液滴的平行培養(yǎng)、生長曲線測定和適應(yīng)性進(jìn)化［69］。該系統(tǒng)在常見微生物如大腸桿菌、釀酒酵母和乳酸桿菌等方面表現(xiàn)出穩(wěn)定的傳代能力，使微生物能夠?qū)崿F(xiàn)自動(dòng)化、高通量自適應(yīng)性進(jìn)化，從而獲得在某些脅迫條件下耐受性增強(qiáng)的菌株［70-71］。鑒于該系統(tǒng)的高度綜合性和多功能性，未來可在微生物培養(yǎng)條件的多因素優(yōu)化［72］以及單細(xì)胞液滴的高通量培養(yǎng)［73-74］等方面得到廣泛應(yīng)用。

2.3 天然產(chǎn)物的檢測

在開發(fā)各類天然產(chǎn)物高效合成細(xì)胞工廠的過程中，準(zhǔn)確檢測和精準(zhǔn)定量目標(biāo)代謝至關(guān)重要。傳統(tǒng)的檢測方法，如氣相色譜、液相色譜、質(zhì)譜和核磁共振［75］，已廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物的檢測。然而這些方法存在一些限制，如耗時(shí)長、通量低以及對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)率和純度要求較高。為此，近年來涌現(xiàn)出一系列天然產(chǎn)物高通量的篩選方法，如基于紫外/可見光譜、熒光光譜和生物傳感器的熒光篩選方法。紫外/可見光譜適用于具有相對(duì)復(fù)雜分子結(jié)構(gòu)或帶有顏色的天然產(chǎn)物，如阿維菌素［32］、番茄紅素［76］、頭孢菌素C等［77］，可以通過直接測量吸光度進(jìn)行篩選。對(duì)于那些沒有明顯吸光度特性的產(chǎn)物，可以通過添加pH指示劑、與金屬離子螯合、與酶或化學(xué)反應(yīng)偶聯(lián)來檢測［30，78-79］［圖4（a）］。該方法已廣泛應(yīng)用于傳統(tǒng)天然產(chǎn)物檢測中，并且由于酶標(biāo)儀體積較小，更易與自動(dòng)化設(shè)備整合，進(jìn)一步提高了檢測通量和效率。例如，趙惠民團(tuán)隊(duì)［80］將iBioFAB自動(dòng)化平臺(tái)與機(jī)器學(xué)習(xí)算法相結(jié)合，通過吸光度對(duì)番茄紅素進(jìn)行精確定量，實(shí)現(xiàn)了番茄紅素生物合成途徑的快速迭代優(yōu)化。與紫外/可見光譜類似，基于熒光光譜的HTP可以根據(jù)目標(biāo)產(chǎn)品的特性分為直接和間接檢測方法［圖4（b）］。例如，Gao等［81］通過重組紅色熒光蛋白篩選纖維素酶，將內(nèi)切葡聚糖酶活性提高了1.6～2.3倍。使用熒光染料/探針進(jìn)行篩選也是常見方法，例如使用熒光染料標(biāo)記死細(xì)胞或活細(xì)胞［32］，用羅丹明定量甲萘鯤和聚蘋果酸［82-83］。另外，利用（2S）-柚皮素與金屬離子相互作用產(chǎn)生的紫外熒光光譜，可以實(shí)現(xiàn)（2S）-柚皮素的快速檢測［84］。此外，基于產(chǎn)生熒光信號(hào)的化學(xué)或酶偶聯(lián)反應(yīng)的方法也廣泛應(yīng)用于改良工業(yè)微生物菌種的篩選［85-86］。相較于傳統(tǒng)的氣相/液相色譜法，這些方法有著便捷、迅速、高通量的特點(diǎn)，并且易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，將成為未來助力天然產(chǎn)物快速檢測的重要工具。

針對(duì)無法通過直接或間接顏色或熒光反應(yīng)檢測的天然產(chǎn)物，生物傳感器的熒光篩選策略可作為一種替代方案［87-88］。細(xì)菌感知環(huán)境中特定分子并相應(yīng)地觸發(fā)代謝反應(yīng)的能力為生物傳感器的開發(fā)創(chuàng)造了許多機(jī)會(huì)［89］。生物傳感器由傳感器和報(bào)告器兩部分組成，其中傳感器能夠識(shí)別特定的細(xì)胞內(nèi)代謝物，而報(bào)告器則通過一系列與傳感器信號(hào)響應(yīng)的程序化遺傳回路產(chǎn)生定量信號(hào)。生物傳感器分為蛋白質(zhì)和核酸兩種類型。蛋白質(zhì)生物傳感器通常以轉(zhuǎn)錄因子和熒光蛋白為基礎(chǔ)［90］。例如，Sun等［91］鑒定到一種能夠與白藜蘆醇發(fā)生反應(yīng)的MarR轉(zhuǎn)錄因子，利用該轉(zhuǎn)錄因子開發(fā)的生物傳感器能夠有效區(qū)分白藜蘆醇與其前體物質(zhì)［原理如圖4（c）①、②所示］，在一輪FACS中，熒光響應(yīng)強(qiáng)度較對(duì)照組提高了667倍。另外，核酸生物傳感器則是以核糖開關(guān)為基礎(chǔ)，核糖開關(guān)是在細(xì)菌mRNA的5′-UTR中發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)元件，當(dāng)與特定代謝物結(jié)合后，會(huì)誘導(dǎo)構(gòu)象變化，并對(duì)下游基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和調(diào)控［92］。例如，Xiu等［93］設(shè)計(jì)了一種響應(yīng)柚皮素的RNA核糖開關(guān)生物傳感器，當(dāng)該生物傳感器與柚皮素結(jié)合后，基因表達(dá)激活熒光信號(hào)產(chǎn)生［原理如圖4（c）③所示］。經(jīng)過遺傳改造的生物傳感器，可實(shí)現(xiàn)對(duì)天然產(chǎn)物快速、實(shí)時(shí)的檢測和高效的篩查。此外，將生物傳感器與其他先進(jìn)高通量技術(shù)（如FACS和DMFS）相結(jié)合，可以進(jìn)一步提升自動(dòng)篩選的效率［94］。

除了上述方法外，基于拉曼光譜、傅里葉變換紅外光譜（FTIR）和傅里葉變換近紅外光譜（FTNIR）等先進(jìn)儀器平臺(tái)的光譜技術(shù)也正在逐步得到應(yīng)用。其中，拉曼光譜具有快速、靈敏、無損、實(shí)時(shí)檢測等優(yōu)點(diǎn)。例如，Wang等［96］開發(fā)了一種集成的拉曼激活液滴分選微流體系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了高產(chǎn)蝦青素雨生紅球藻的精確化、高通量、高活性保持的分選。與拉曼光譜類似，F(xiàn)TIR和FTNIR也是無損分析方法，具有高通量和快速自動(dòng)檢測的優(yōu)點(diǎn)。將這些光譜技術(shù)及其先進(jìn)的成像技術(shù)與Auto-HTP相結(jié)合，在天然產(chǎn)物的生物合成中具有巨大潛力。

3 總結(jié)與展望

當(dāng)前，人類正面臨日漸嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，包括疾病肆虐、環(huán)境破壞和能源枯竭等。在過去的一個(gè)多世紀(jì)中，天然產(chǎn)物作為“環(huán)境友好”型先導(dǎo)分子，在醫(yī)藥健康和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用，并得到廣泛應(yīng)用［97］。生物信息學(xué)分析表明，目前僅有3%的細(xì)菌來源天然產(chǎn)物被發(fā)現(xiàn)，即使是深入研究的類群如鏈霉菌，仍存在大量未知的天然產(chǎn)物有待挖掘［98］。合成生物學(xué)作為新興的科學(xué)領(lǐng)域，在生物醫(yī)藥與大健康、生物化工、食品與農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域已經(jīng)取得了多項(xiàng)標(biāo)志性成果［99-100］。在合成生物學(xué)理念指導(dǎo)下，天然產(chǎn)物的挖掘效率得到進(jìn)一步提升。例如，Yuan等［51］采用“bottom-up”策略將39個(gè)基因簇重構(gòu)為208個(gè)突變株，獲得185種產(chǎn)物，充分釋放了基因簇中各個(gè)酶的催化潛力。此外，合成生物學(xué)工具，如各種微生物高產(chǎn)底盤和經(jīng)遺傳改造的生物傳感器，在天然產(chǎn)物的高效合成和快速檢測方面起到了重要的支持作用。因此，在合成生物學(xué)理念指導(dǎo)下，配備Auto-HTP平臺(tái)，可以更高效、充分地挖掘自然界中的天然產(chǎn)物“暗物質(zhì)”。

雖然Auto-HTP在不同領(lǐng)域中取得了應(yīng)用并提高了通量，并實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化，但仍然面臨一些挑戰(zhàn)。首先是成本問題，建立一套完整的auto-HTP工作站需要多臺(tái)昂貴且維護(hù)成本高的機(jī)械自動(dòng)化設(shè)備，如菌落自動(dòng)拾取器和液體處理系統(tǒng)，這限制了其廣泛應(yīng)用。其次，一些HTP系統(tǒng)（如DMFS）操作過程復(fù)雜且技術(shù)性強(qiáng)，且現(xiàn)有裝置多由實(shí)驗(yàn)室研制，仍未得到大范圍推廣［101-102］。再次，目前主流的FACS和DMFS依賴熒光信號(hào)進(jìn)行檢測，雖然已有基于吸光度和拉曼光譜的DMFS報(bào)道［95，103］，但其靈敏度和篩選通量遠(yuǎn)低于標(biāo)準(zhǔn)要求，難以滿足實(shí)驗(yàn)需求。最后，目前仍缺乏高度集成的工程化研究平臺(tái)，以進(jìn)行系統(tǒng)化的天然產(chǎn)物資源研究和挖掘。

雖然仍面臨諸多挑戰(zhàn)，但自動(dòng)化合成生物技術(shù)在天然產(chǎn)物生物合成領(lǐng)域已取得廣泛應(yīng)用。我國已建成或正在建設(shè)多個(gè)大型合成生物學(xué)基礎(chǔ)設(shè)施平臺(tái)，并將依托這些平臺(tái)進(jìn)一步挖掘未知生物合成元件、代謝途徑和天然產(chǎn)物?；诤铣缮飳W(xué)策略，研究人員可以從改造催化途徑酶、整合生物途徑和化學(xué)途徑，以及改造底盤細(xì)胞等方面著手，以實(shí)現(xiàn)高價(jià)值天然產(chǎn)物的高效合成［104］。隨著人工智能的快速進(jìn)步和生物大數(shù)據(jù)的不斷發(fā)展，我們相信，當(dāng)前Auto-HTP運(yùn)行模式有望進(jìn)一步提升，并降低成本。

綜上所述，自動(dòng)化合成生物技術(shù)近年來在天然產(chǎn)物的生物合成領(lǐng)域取得了多項(xiàng)突破性進(jìn)展。但作為近十年來迅速發(fā)展的研究手段，其仍處于發(fā)展初期［27］，需要合成生物、信息技術(shù)、自動(dòng)化等多領(lǐng)域的研究人員共同協(xié)作，對(duì)設(shè)施平臺(tái)進(jìn)行不斷的更新和優(yōu)化。盡管還存在著諸多不成熟的地方以及有待進(jìn)一步解決的問題，但相信其具備的獨(dú)特優(yōu)勢將會(huì)為天然產(chǎn)物的深入挖掘和高效生物合成提供強(qiáng)大支撐，為新型天然產(chǎn)物功能產(chǎn)品的開發(fā)提供可持續(xù)來源。