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微液滴高通量篩選方法的研究與應(yīng)用進展

2023-11-21 03:22:54秦偉彤楊廣宇
合成生物學(xué) 2023年5期
關(guān)鍵詞:微流液滴通量

秦偉彤,楊廣宇

(上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,微生物代謝國家重點實驗室,上海 200240)

高通量篩選(high-throughput screening,HTS)是藥物發(fā)現(xiàn)過程中的重要環(huán)節(jié),也是闡明基因和蛋白質(zhì)功能的重要工具,它已被廣泛應(yīng)用于生物技術(shù)和制藥領(lǐng)域[1-5]。通常認為HTS樣本篩選通量大于103個/天及小于105個/天[6]。但是就以蛋白質(zhì)進化為例,通過易錯PCR的手段很容易就構(gòu)建出庫容量為1010的突變體文庫[7],盡管自動移液工作站的出現(xiàn)減少了部分人工操作,但是所需的成本仍然較高,且樣本的篩選通量小于106個/天,因此對大量生物樣本庫進行特定代謝物、酶、核酸、表型或突變的篩選逐漸成為一項重大挑戰(zhàn)[8-9]。如何實現(xiàn)低成本、高速度、高特異性以及高靈敏度的篩選是HTS所面臨的主要問題。

微流體系統(tǒng)最早出現(xiàn)于20世紀80年代,是一種精確操作微尺度流體(10-6~10-18L)的技術(shù),可以將多個操作單元,比如液滴的生成、信號檢測和分選等集成到一個芯片上,并自動完成整個分析過程,因此也被稱為“芯片實驗室”[10-11]。它的優(yōu)點是樣品消耗低、反應(yīng)快速且具有并行處理的能力,這也使得樣本的篩選通量提高到了108個/天,試劑的消耗量也降低為傳統(tǒng)的微孔板篩選的百萬分之一,為HTS領(lǐng)域帶來了革命性的改變[12-14]。

傳統(tǒng)的微液滴篩選系統(tǒng)(以酶進化為例)主要是通過將表達有不同酶突變體的菌株以及反應(yīng)底物進行單細胞包裹,將液滴在芯片上或芯片外孵育特定時間,最后根據(jù)設(shè)定的篩選電壓閾值,陽性液滴在介電泳(dielectrophoresis,DEP)作用力下進入收集通道,從而實現(xiàn)分選[15-16](圖1)。液滴的生成方式已經(jīng)有很多種,包括油包水(water in oil,W/O)、水包油包水(water/oil in water, W/O/W)、水凝膠珠的形式,液滴的體積也從納升到皮升不等[14,17-19]。每個液滴均為一個獨立的微反應(yīng)器,從而能夠分析從細胞內(nèi)表達或由細胞分泌的酶功能,克服了傳統(tǒng)流式細胞術(shù)和熒光激活細胞分選只能用于檢測與細胞直接關(guān)聯(lián)的熒光信號的限制。液滴信號檢測與分選的方式也根據(jù)不同實驗的需求,發(fā)展出了更多種類的液滴分選器[20]。

圖1 傳統(tǒng)的微流控分選流程示意圖Fig. 1 The scheme of traditional microdroplets sorting devices

傳統(tǒng)的基于微流體的液滴分選主要依賴于激光誘導(dǎo)熒光檢測,以及熒光激活的微液滴分選系統(tǒng),但是特別針對一些小分子藥物及大部分酶分子,缺乏適用的熒光探針,而極大地限制了該系統(tǒng)的應(yīng)用[21]。自Link等[22]于2006年開發(fā)了首套利用靜電力實現(xiàn)液滴分選的設(shè)備以來,相繼有不同原理的微液滴超高通量篩選系統(tǒng)被開發(fā)出來。按信號識別方式區(qū)分,包括結(jié)合熒光光譜[12]、吸收光譜[21]、分析質(zhì)譜[23]、拉曼光譜[24]、電化學(xué)技術(shù)[25]、核磁共振[26]、圖像識別[27]等技術(shù);按控制液滴的偏轉(zhuǎn)驅(qū)動力不同,又可以分為電[28]、聲[29]、磁[30]、氣動[31]或者熱學(xué)[32]等系統(tǒng)。本文主要針對目前已開發(fā)出的不同的微流控篩選設(shè)備,根據(jù)檢測信號的不同將其分為標記與無標記液滴分選技術(shù),對其發(fā)展情況和使用情況進行了總結(jié),并討論了目前微液滴分選設(shè)備所存在的局限性及未來的發(fā)展方向。

1 標記液滴分選技術(shù)

標記液滴分選技術(shù)通常不是基于所測定的細胞或者酶分子本身的特征進行分選,而是需要引入化學(xué)分子或者熒光探針來間接實現(xiàn)分選。主要包括依賴于熒光信號的熒光激活液滴分選(fluorescence-activated droplets sorting, FADS)和基于紫外/可見光吸收變化的吸光度激活液滴分選(absorbanceactivated droplets sorting, AADS)技術(shù)(圖2)。

圖2 標記液滴分選技術(shù)分選原理Fig. 2 The principle of labeled droplet sorting technology

1.1 熒光激活的液滴分選技術(shù)

熒光激活的液滴分選是目前主流的微流控篩選技術(shù),其主要是通過設(shè)計不同的熒光探針或者酶級聯(lián)反應(yīng)來直接或間接實現(xiàn)目標酶基因型與熒光的耦聯(lián),因此具有更高的靈敏度[19,33-35]。與熒光激活細胞分選(fluorescence-activated cell sorting,F(xiàn)ACS)原理相似,但是FADS與FACS相比最大的優(yōu)勢是其可對細胞內(nèi)、細胞上、分泌到細胞外的信號以及無細胞體系進行分選,同時由于其配置了高速相機,能夠?qū)崿F(xiàn)分選的可視化[36]。FADS與其他液滴分選技術(shù)相比,另外一個優(yōu)勢是處理微液滴的分選通量高達5000個/s。目前已被成功應(yīng)用于脂肪酶[33]、酯酶、纖維素酶[13]、淀粉酶[37]、聚合酶[38]等酶分子的改造。

經(jīng)過十余年的發(fā)展,研究者們也對傳統(tǒng)的FADS系統(tǒng)進行了升級改造。比如Ma等[17]開發(fā)了一套雙色熒光分選體系,可以同時處理來自相同液滴的兩個熒光信號,篩選出了具有高酶活性和高對映選擇性的黃古珠酯酶突變體。Hasan等[39]開發(fā)了一種熒光壽命激活的液滴分選系統(tǒng)(fluorescence lifetime-activated droplet sorting,F(xiàn)LADS),但該系統(tǒng)的分選通量只有50個/s。Blaha和Hasan等[40]進一步通過對活細胞與死細胞進行精確的液滴分選證明了FLADS的可行性。此外,Hung等[41]優(yōu)化了信號處理的硬件,并將分選通量提高到了2500個/s。

目前FADS技術(shù)也存在一些缺點,比如需要根據(jù)不同的酶分子及催化反應(yīng)開發(fā)合適的熒光探針,而對于某些酶分子、不常見的細胞以及靶向分析物為小分子藥物的實驗,則缺乏適用的生物標記物和熒光探針,導(dǎo)致無法構(gòu)建熒光耦聯(lián)策略。同時選用的熒光探針還需保留在液滴中,不能發(fā)生擴散等問題。這些也極大地限制了FADS的廣泛應(yīng)用。為了克服FADS的局限性,其他種類的液滴分選技術(shù)比如吸光度、質(zhì)量和拉曼等激活的液滴分選技術(shù)也相繼被開發(fā)出來(表1)。

表1 不同微流控分選設(shè)備比較Table 1 Comparison of different microfluidic sorting equipment

1.2 吸光度激活的液滴分選技術(shù)

吸收光譜法被廣泛應(yīng)用于比色測定、蛋白質(zhì)定量和酶動力學(xué)等方面[51-52],近年來科研人員也將其與微流控技術(shù)進行耦聯(lián),開發(fā)出了吸光度激活液滴分選技術(shù)AADS,實現(xiàn)了與FADS技術(shù)的互補[21]。與FADS相比, AADS檢測的挑戰(zhàn)是吸光率與路徑長度成正比,這意味著液滴的小體積(pL)以及由此產(chǎn)生的短光路長度(μm)會影響檢測的靈敏度[21,53]。Gielen等[21]首次介紹了一種使用介電泳和光纖的AADS系統(tǒng),在液滴的吸光度被讀出后再對液滴進行分選,分選通量約為300 個/s。但是他們聲稱在液滴中染料的濃度低于100 μmol/L時則無法完成分選,因為油相和水相的不同折射率會產(chǎn)生信號偽影,只能通過添加偏移染料來降低信號偽影。隨后,Duncombe等[53]開發(fā)了一種基于全紫外可見光譜激活的液滴分選系統(tǒng)(UV-vis spectra-activated droplet Sorter,UVADS),將光路路徑長度從50 μm增加到300 μm,但由于是全光譜,液滴的分選通量低于100 個/s。最近,Medcalf等[44]報道了一種集成雙凹透鏡聚焦、聲表面波(surface acoustic wave,SAW)分選和吸光度激活的液滴分選系統(tǒng),使其分選通量提高到了103個/s水平,同時使用折射率匹配油,通過去除側(cè)面散射來提高信號質(zhì)量,可對濃度差為50 μmol/L的液滴進行分類。理論上來講,AADS可能會有更高的應(yīng)用價值,相較于FADS更加具有普適性,因為大多數(shù)小分子在電磁光譜的紫外線和可見光區(qū)域均可表現(xiàn)出吸收。

2 無標記的液滴分選技術(shù)

無標記的液滴分選技術(shù)不需要添加額外的化學(xué)分子,而是利用檢測的反應(yīng)、化合物或細胞本身的物理或化學(xué)變化,來實現(xiàn)信號的檢測與分選。目前已開發(fā)出了與質(zhì)譜技術(shù)、拉曼光譜、核磁共振、電化學(xué)及圖像分析等技術(shù)相結(jié)合的無標記分選技術(shù)(圖3)。但是該類方法通常需要耦聯(lián)不同的技術(shù)與特殊的設(shè)備。

圖3 無標記液滴分選技術(shù)分選原理Fig. 3 The principle of unlabeled droplet sorting technology

2.1 質(zhì)量激活的液滴分選技術(shù)

質(zhì)譜(mass spectrometry,MS)是一種無標記的檢測技術(shù),并已成為通用的分析技術(shù)[55]。然而,傳統(tǒng)的液相色譜-質(zhì)譜法(liquid chromatographymass spectrometry,LC/MS)由于色譜分離而耗時,并且需要相對較大的樣品體積,這對于HTS來說成本過高[56]。而質(zhì)量激活液滴分選技術(shù)(mass activated droplet sorting, MADS)則是將微流控技術(shù)與MS的優(yōu)勢相結(jié)合,兼具高靈敏性、高選擇性、低成本、可同時分析多種產(chǎn)物等優(yōu)點[23]。Sun等[57-58]引入了第一種高通量液滴質(zhì)譜法,證明了該系統(tǒng)樣本篩選通量為1.7個/s,分析速度比傳統(tǒng)的LC-MS快300倍左右。隨后,Steyer等[59]開發(fā)了一種通過納米-電噴霧電離(electrospray ionization,ESI)分析液滴的平臺,它可抵抗基質(zhì)效應(yīng)從而實現(xiàn)樣本的快速分析。盡管基于MS的液滴分選方法已經(jīng)被證明了具有可行性,且相繼有更多的改進方法逐漸被開發(fā)出來,但是在處理過程中液滴的損失限制了其在液滴分選中的應(yīng)用。

為了克服這些限制,Holland-Moritz等[54]開發(fā)了一套真正意義上的基于ESI-MS激活的液滴分選系統(tǒng),該系統(tǒng)整合了液滴分隔模塊,由連接到質(zhì)譜儀的微流控芯片和進行液滴計數(shù)的相機監(jiān)控的分選區(qū)域兩部分組成,注入到芯片中的液滴被分割成兩個大小不等的液滴,較大的液滴進入質(zhì)譜儀通道用于信號檢測,較小的液滴則進入分選通道,兩個通道之間具有一條延遲線,以保證液滴在經(jīng)過質(zhì)譜儀的檢測后,另外一個同級液滴才進入分選通道[圖3(a)]。該系統(tǒng)的樣品分選通量可達0.7個/s,分選準確率約98%。盡管該系統(tǒng)處理樣本的速度約為FADS的1/1000,但得益于質(zhì)譜所固有的無標記特性,MADS幾乎可以測定任何產(chǎn)物,且可以同時分析多種物質(zhì),證明了基于任何類型的測定信號進行微液滴篩選的可能性。

2.2 拉曼激活的液滴分選技術(shù)

拉曼光譜的原理是通過激光與樣品相互作用時產(chǎn)生的化學(xué)鍵的振動和旋轉(zhuǎn)來獲取分子的信息,已廣泛應(yīng)用于物理、生物、化學(xué)、工業(yè)和醫(yī)藥等領(lǐng)域[60]。而拉曼激活的液滴分選技術(shù)(Ramanactivated droplet sorting,RADS)是一種無標記、無損傷的單細胞識別與分析技術(shù),其整合了單細胞拉曼光譜(single-cell Raman spectra,SCRS)與液滴微流控技術(shù),通過利用介電的單細胞捕獲釋放和電磁閥吸吮技術(shù),在高速流動的狀態(tài)下捕獲單細胞,并實現(xiàn)拉曼采集、釋放和分選[24]。該技術(shù)最大的缺陷是容易受油相和液滴中光學(xué)畸變的影響,在不使用表面增強技術(shù)的情況下靈敏度較低,使得這項技術(shù)很難應(yīng)用于一些復(fù)雜的基質(zhì)中。為了克服這些缺陷,Wang等[48]采用了液滴“先選再養(yǎng)”的方式,即先捕獲單細胞的拉曼信號,再進行液滴包裹,并采用基于介電力驅(qū)動的方式,克服了制約通量提高的電磁閥作為分選驅(qū)動力的瓶頸問題,同時將芯片的材料PDMS替換成石英,使得該系統(tǒng)的細胞分選速率和靈敏度得到了較大的提升,分別達到了260個/min及98.3%[圖3(b)]。Safir等[61]開發(fā)了一套基于人工智能輔助拉曼光譜與生物打印相結(jié)合的系統(tǒng),用于血液中細菌的高通量檢測。理論上來講,RADS適用于所有類型的細胞,具有更廣闊的應(yīng)用前景。但目前,基于拉曼光譜的應(yīng)用仍需要高拉曼強度和大的細胞散射截面。當將基于拉曼光譜的微液滴分選系統(tǒng)(droplet microfluidic screening systems,DMFS)應(yīng)用于小型細胞如大腸桿菌時,則需要額外的優(yōu)化。

2.3 核磁共振激活的液滴分選技術(shù)

核磁共振激活的液滴分選技術(shù)(nuclear magnetic resonance activated droplets sorting, NMRADS)相較于MADS,既是無標記分選技術(shù),也是一種無損傷分選技術(shù)。NMR能夠同時識別和量化數(shù)百種不同的復(fù)雜混合物中的化合物,提供了無與倫比的化學(xué)特異性。因此將其與微流控技術(shù)相結(jié)合,具有巨大的吸引力,但同時也是較大的挑戰(zhàn)[62-63]。從NMR的角度來看,一類特別具有挑戰(zhàn)性的集成功能元件是導(dǎo)電結(jié)構(gòu)[26]。金屬電極可用于電化學(xué)樣品相互作用,然而它們可能導(dǎo)致嚴重的NMR光譜和SNR(signal to noise ratio,信噪比)退化。在微觀尺度上這些問題更為復(fù)雜,因為畸變體積占據(jù)了樣品體積中的更高比例[26]。此外,NMR與其他檢測方法相比,檢測的質(zhì)量靈敏度較低(小于1 mmol/L)。核磁微線圈則是針對這些限制所開發(fā)的,但是將微線圈與小樣本進行對接挑戰(zhàn)較大[64]。

Swyer等[65]介紹了第一個NMR數(shù)字微流控系統(tǒng),能夠在高場NMR中實現(xiàn)微線圈中分析物與液滴的對接,可以觀察木糖-硼酸鹽絡(luò)合和葡萄糖氧化酶催化等過程,但并沒有實現(xiàn)分選。Davoudi等[26]通過將金屬軌道放置在微流體通道的側(cè)壁中,開發(fā)了一種NMR兼容的微流體平臺[圖3(c)],發(fā)現(xiàn)NMR射頻激發(fā)性能得到了增強,而不影響靜磁場的均勻性,從而能夠在進行沉積的電極表面或處理室中的電極下方進行直接光學(xué)觀察。這也為進一步實現(xiàn)NMR激活的液滴分選提供了技術(shù)基礎(chǔ)與研究思路。

2.4 電化學(xué)激活的液滴分選技術(shù)

電化學(xué)檢測同樣也是一種無標記、無損傷的檢測方法,可應(yīng)用于復(fù)雜樣品的檢測。但是由于檢測電極表面尺寸的限制(尺寸必須小于液滴),液滴的尺寸通常只能控制在納升級別。Goto等[25]開發(fā)了一套可針對NADP依賴性氧化還原酶定向進化的電化學(xué)激活液滴分選系統(tǒng)(electrochemical-based droplet sorting,ECDS),通過將NAD(P)H測定裝置與DEP分選設(shè)備相耦聯(lián)[圖3(d)],將酶促反應(yīng)產(chǎn)生的電化學(xué)信號轉(zhuǎn)化為交流信號,對約30 nL的液滴進行了分選,成功將酶的活性提高3倍左右。該方法檢測的靈敏度約為1 μmol/L,但是液滴篩選通量也較低,約為10個/s。

Abbyad組[66]提出了一種基于界面張力(sorting based on interfacial tension,SIFT)的分選方法,通過利用不同pH值會產(chǎn)生不同界面張力的液滴的原理,低pH導(dǎo)致液滴的高界面張力,并且具有較低pH的液滴會傾向于沿著芯片上的軌跡流動,因此不需要額外的電極來進行區(qū)分。該方法可區(qū)分pH差異為0.2的液滴,最大分選速率約為30 Hz。Dobson等[67]利用特定的表面活性劑會導(dǎo)致界面張力對液滴pH非常敏感的原理,成功將此分選方法用于凋亡細胞的分離研究中。Zielke等[68]也基于SIFT原理,成功對具有不同水平糖酵解的細胞(癌癥細胞亞群)進行了分離。

2.5 基于圖像分析的液滴分選技術(shù)

基于圖像分析的液滴分選技術(shù)(image-based droplets sorting, IBDS)是一種基于液滴內(nèi)細胞形態(tài),通過圖像識別、處理與分析來實現(xiàn)分選的無標記分選技術(shù)[圖3(e)][27,69]。該方法在細胞生物學(xué)領(lǐng)域越來越受歡迎,部分原因是近年來通過多項研究提高了圖像處理算法、接口速度和處理硬件性能。Doan等[70]利用小波分析實現(xiàn)了液滴中細胞形態(tài)區(qū)分,該方法分選精度可達90%,液滴分選通量約為10個/s。Watterson等[69]也開發(fā)了一種基于小波的圖像分析方法來測量液滴的光密度,指示液滴中細菌的數(shù)量,該方法被成功應(yīng)用于分析患者樣本中的抗生素耐藥性,并揭示了21個細菌種群。Anagnostidis等[50]開發(fā)了在深度學(xué)習(xí)引導(dǎo)下的IBDS系統(tǒng),證明了深度神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)可以準確地對單個哺乳動物細胞和多細胞球體的存在和數(shù)量進行實時液滴成像分析。這種方法還能夠從含有不同類型和大小對象的混合物中識別出特定對象,可用于快速揭示細胞和多細胞結(jié)構(gòu)的異質(zhì)性。

3 應(yīng)用領(lǐng)域

3.1 酶的定向進化與新酶挖掘

酶是自然界存在的最重要的生物催化劑,經(jīng)過自然界數(shù)千年的自然進化已被應(yīng)用于各個領(lǐng)域[71-72]。但是天然酶往往無法滿足工業(yè)需求,所以人工選擇和篩選變得越來越重要[24,73]。定向進化是在實驗室條件下模擬“達爾文進化”的原理,快速進化出具有目標性能的突變酶,為酶進化提供了強大的工具[74-77]。但是定向進化面臨的最大問題是傳統(tǒng)的微孔板篩選方法無法滿足龐大的庫容量篩選的需求[78],同時工業(yè)和制藥領(lǐng)域?qū)σ恍┬滦偷?、性能更?yōu)的微生物催化劑的需求也持續(xù)快速增長[79]。所以酶的定向進化和新酶的挖掘直接受益于液滴微流控的發(fā)展,為酶反應(yīng)提供了單獨的反應(yīng)環(huán)境和更大的篩選容量。

我們對近五年利用液滴分選系統(tǒng)成功實現(xiàn)定向進化以及新酶挖掘的案例進行了簡單的總結(jié)(表2)。

表2 近五年微流控分選裝置成功應(yīng)用的案例Table 2 Cases of successful application of microfluidic sorting devices in the past five years

Ma等[17]利用雙色熒光的FADS系統(tǒng)將酯酶對S-布洛芬的對映選擇性提高700倍左右。Tan等[88]在紅海環(huán)境樣本中成功挖掘到了3種新的脂肪酶。Zurek等[83]開發(fā)的AADS液滴分選器已成功用于胺脫氫酶的定向進化,使其轉(zhuǎn)化率提高了3.28倍。隨后,Zachos等[87]開發(fā)的AADS液滴分選設(shè)備使葡萄糖脫氫酶的催化速度和效率提高至少10倍。但是統(tǒng)計的10個案例中有8個應(yīng)用了FADS系統(tǒng),說明盡管研究人員已經(jīng)開發(fā)出了多種微流控分選設(shè)備,目前針對酶進化和新酶挖掘的方法仍然以FADS分選系統(tǒng)為主。

除了酶工程領(lǐng)域外,微流控分選技術(shù)在微生物挖掘和定向進化方向也具有巨大的應(yīng)用空間[89],比如Qiao等[85]從環(huán)境樣本中利用FADS系統(tǒng)分選出了可降解塑料的Kineococcus endophyticusUn-5和Staphylococcus epidermidisUn-C2-8菌株。Xu等[86]開發(fā)出了一套新的轉(zhuǎn)錄相關(guān)的FADS系統(tǒng),并從原油中篩選出了10種產(chǎn)生更多鼠李糖脂的微生物,它們產(chǎn)生的鼠李糖脂比銅綠假單胞菌PAO1模型多54%~208%。Bowman等[90]利用FADS分選系統(tǒng)從溶脂雅羅菌轉(zhuǎn)座子突變體庫中,在菌株培養(yǎng)的早期鑒定出了衣康酸生產(chǎn)力提高的菌株。

3.2 細胞的分選與分離

病原微生物的快速靈敏檢測在食品工業(yè)、醫(yī)學(xué)等眾多領(lǐng)域至關(guān)重要。例如在藥物實驗室中,醫(yī)療產(chǎn)品的污染可能會給患者帶來嚴重的健康風(fēng)險,如敗血癥[91-93]。微流控篩選設(shè)備可以極大地幫助研究人員從復(fù)雜環(huán)境中分離病原體,Li等[94]利用聲電泳分選方法,通過在微通道上施加強烈的聲波,流動的顆粒會根據(jù)它們的大小進行分類,成功地分選了大腸桿菌和人類血細胞的混合物,得到的含有細菌的溶液顯示出超過96%的細菌純度(低于4%的血細胞)。Ohlsson等[95]又優(yōu)化了聲電泳分選方法,使得細菌回收率高達99.7%,或血細胞去除率高可達99.99%。此外,Hyman等[96]基于環(huán)介導(dǎo)的等溫擴增技術(shù),開發(fā)了一種單細胞轉(zhuǎn)錄譜分析和分選的系統(tǒng)(single-cell nucleic acid profiling in droplet,SNAPD),可用于量化不同的細胞異質(zhì)種群中的類型,檢測到頻率低至0.1%的罕見細胞,并使用微流體分選富集特異性的細胞類型(圖4)。

圖4 SNAPD工作流程圖[96]Fig. 4 Schematic of the SNAPD workflow[96]

3.3 單細胞分析及藥物篩選

單細胞技術(shù)對免疫學(xué)領(lǐng)域有著重要的影響。它能夠闡明免疫信號傳導(dǎo)和免疫細胞遷移的動力學(xué)和邏輯,促進抗體篩選,并允許對B細胞和T細胞庫進行大規(guī)模并行分析?;谖⒘黧w的技術(shù)實現(xiàn)的高時空控制使得對免疫信號、細胞遷移和細胞間相互作用的理解增加了一個強大的手段[97]。Mazutis等[98]開發(fā)了首套可應(yīng)用于單細胞分析及抗體篩選的液滴微流控分選系統(tǒng)。他們將單個小鼠雜交瘤細胞、熒光探針和包被抗小鼠IgG抗體的單個微珠共包裹在50 pL液滴中,僅在15min后檢測分泌的抗體,分選速率約為200 Hz(圖5)。Shembekar等[97]研發(fā)了一套基于雙色熒光策略的微流控分選平臺,并引入了液滴捕捉與成像技術(shù),不僅可以定性地對表達的抗體進行分類,還可以定量地對特異性抗體結(jié)合以及與天然細胞表面受體的結(jié)合進行分類。除了抗體篩選之外,Baranova等[99]還基于單細胞共培養(yǎng)微生物組以及乳液中的報告熒光病原體,使用熒光激活的細胞分選來選擇無報告液滴,開發(fā)了一組革蘭氏陰性菌大腸桿菌的報告菌株,以提供用于精確監(jiān)測抗菌活性的活體生物傳感器,可以有效地用于抗生素/益生菌的發(fā)現(xiàn)、環(huán)境監(jiān)測和生物學(xué)合成。

圖5 應(yīng)用微流控分選設(shè)備進行抗體篩選的流程圖[98]Fig. 5 The scheme of antibody screening using microfluidic sorting device[98]

4 總結(jié)與展望

微流控技術(shù)的快速發(fā)展為細胞及液滴的分選提供了強大的技術(shù)支撐。該技術(shù)在提高分析率的同時顯著減少了樣本分析量,從而能夠在大容量突變庫或者微生物群體中快速識別出罕見的或者活性提升的靶標。而微流控分選裝置主要包括液滴的生成、孵育、操作與分選,經(jīng)過近些年的發(fā)展,前三個步驟已相對成熟且已有商業(yè)化的裝置,因此最主要的限速步驟是液滴的分選。

FADS具有更高的篩選速度(kHz水平)和最高的靈敏度(nmol/L級別),是目前發(fā)展最成熟以及應(yīng)用最廣泛的微流控分選系統(tǒng)。如果能夠找到合適的熒光探針或熒光耦聯(lián)反應(yīng)實現(xiàn)基因型與表型的耦聯(lián),F(xiàn)ADS依舊是所有分選方法的首要選擇。AADS的檢測靈敏度雖然低于FADS,但AADS系統(tǒng)不需要激光器和光電倍增管,因此其裝置比FADS更簡單、更便宜,在檢測靈敏度符合要求的情況下,AADS會是較不錯的選擇。當然也有將FADS與AADS進行結(jié)合,開發(fā)出的FAADS(fluorescence and AADS)系統(tǒng),既可以獲得熒光值,也可以獲得光密度值,可以為研究提供更多的信息[100]。

無標記的分選設(shè)備因其不需要特定的熒光探針、能夠保證細胞及反應(yīng)的完整度等優(yōu)勢而受到越來越多的關(guān)注,也為研究者提供了更多的選擇空間。但是該類分選設(shè)備所面臨的共性問題是分選效率與檢測靈敏度較低。MADS是探測化學(xué)物質(zhì)的一種很有價值的工具,檢測的范圍擴大到只要能夠利用ESI電離的分子,而利用FADS與AADS均是無法實現(xiàn)的。對于篩選化學(xué)反應(yīng),檢測質(zhì)量變化的能力比光譜變化更適用。RADS是無損傷的分析方法,有助于與細胞中DNA、RNA、蛋白質(zhì)和代謝產(chǎn)物的下游提取進行無縫整合,以進行進一步分析。NMR-ADS可以提供更全面的信息,但是目前還未實現(xiàn)分選。然而,RADS與NMR-ADS均需要特殊的技術(shù)來建立分選系統(tǒng)。對于基于電化學(xué)的分選方法,也沒有標準化的分選裝置,甚至可能需要根據(jù)各種電化學(xué)特性進行定制。

盡管目前已經(jīng)開發(fā)出了多種微流控分選裝置,但是真正商業(yè)化的設(shè)備卻很少。首先,不同的生物學(xué)應(yīng)用需要不同的檢測方法,很難開發(fā)出一個通用的微流控分選設(shè)備,同時市場有限,集成化的設(shè)備商業(yè)化也很難。其次,微流控分選設(shè)備需要高精細的元件,搭建平臺也需要實驗室有一定的基礎(chǔ)。此外,微流控分選設(shè)備的整個流程十分依賴人為操作且流程較復(fù)雜,也進一步限制了該類系統(tǒng)的通用性。未來還需要在這一方向進一步改進與努力,從而提高商業(yè)性的微流控分選設(shè)備的通用性。

總之,本文從信號的檢測方法方向綜述了微流控分選設(shè)備的發(fā)展情況與應(yīng)用情況。盡管FADS仍然是細胞分選的首要選擇,但是許多研究開發(fā)出了多種微流控分選設(shè)備,也進一步擴大了微流控分選設(shè)備的應(yīng)用范圍。其超高的篩選通量與獨立的反應(yīng)環(huán)境為不同領(lǐng)域(包括蛋白質(zhì)工程、抗體篩選、不同種類細胞的分選及臨床方向)的研究提供了新的技術(shù)平臺。隨著更多新技術(shù)的發(fā)展,比如人工智能、生物打印技術(shù)等的發(fā)展,也會為微流控分選設(shè)備賦予更多應(yīng)用。

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