梁雪蓮 廖潔 蔣文艷 陳偉 王海軍 莫磊興 肖燕艷妮 王天順

摘 要：甘蔗在運輸和貯存期間極易受病原菌侵染，發(fā)生變質(zhì)并產(chǎn)生毒素，其中甘蔗受梨孢假殼感染及產(chǎn)生3-硝基丙酸（3-NPA）毒素是引起食用變質(zhì)甘蔗中毒的主要原因。文章通過綜述甘蔗霉變病原菌梨孢假殼的鑒定、產(chǎn)毒條件、環(huán)境影響因素及其3-NPA毒素合成機理、檢測方法等研究進展，發(fā)現(xiàn)目前尚缺乏對甘蔗霉變病原菌梨孢假殼的全面、系統(tǒng)認識，也未對其產(chǎn)毒能力、產(chǎn)毒機理及毒性快速監(jiān)測方法等提出明確要求和出臺相關(guān)規(guī)定，關(guān)于甘蔗采后霉變的防控技術(shù)也鮮見報道。因此，今后應(yīng)在以下幾方面開展相關(guān)研究：（1）系統(tǒng)開展甘蔗梨孢假殼產(chǎn)毒能力評價、菌株分類及快速鑒定方法等研究，對高毒菌株所屬區(qū)域的甘蔗消費市場進行重點監(jiān)控，為疑似感染高毒菌株的甘蔗預(yù)警提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支撐；（2）在侵染甘蔗條件下，深入研究環(huán)境因素對梨孢假殼毒素3-NPA產(chǎn)生和積累規(guī)律的影響；（3）探究毒素合成途徑及分子調(diào)控機理，闡明梨孢假殼毒素3-NPA的代謝過程，解析生物合成3-NPA的系統(tǒng)理論知識；（4）利用分子生物學(xué)手段開展3-NPA檢測研究，提高檢測方法的準(zhǔn)確性、靈敏度等；（5）通過生物防控方法高效防控甘蔗中梨孢假殼感染及其毒素3-NPA的合成，研制篩選出高效、安全、適用的甘蔗防霉變藥劑。

關(guān)鍵詞：甘蔗；霉變；梨孢假殼（節(jié)菱孢）；3-硝基丙酸（3-NPA）

中圖分類號：S566.1 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標(biāo)識碼：A ?文章編號：2095-820X（2023）02-0028-04

0 引言

鮮食甘蔗具有豐富的營養(yǎng)，且富含葡萄糖、蔗糖和果糖等易吸收的糖類（含糖量約12%），以及人體必需的多種維生素、氨基酸和微量元素，尤其是鐵含量高達9 mg/kg，因此又被稱為補血果［1］。中醫(yī)認為甘蔗入肺、胃二經(jīng)，具有潤燥、補肺益胃、清熱、生津、下氣等功效。甘蔗因其口感甜蜜、營養(yǎng)豐富，且具有補益身體之功效，而深受消費者喜愛［2］。目前，我國甘蔗種植區(qū)域已由過去的江南8?。▍^(qū)）擴延到22?。ㄊ小^(qū)）（不包括臺、港、澳），全國蔗地總面積約27.0萬ha，年總產(chǎn)量超過2000萬t，產(chǎn)值超過200億元人民幣。我國的甘蔗種植主要集中在廣西、廣東、福建、云南、海南、四川、江西等南方地區(qū)，僅廣西甘蔗種植面積就超過2.7萬ha，約占全國種植面積的10%，居全國首位。每年元旦前后至春節(jié)前后為甘蔗的集中采收季節(jié)，大量甘蔗運往我國北方地區(qū)的消費市場，但甘蔗在運輸和貯存期間極易受病原菌侵染，發(fā)生變質(zhì)，并產(chǎn)生微生物毒素。自1972年我國首次發(fā)生變質(zhì)甘蔗引起中毒病例以來［3］，幾乎每年都有因食用變質(zhì)甘蔗而引起中毒的病例發(fā)生。為此，文章通過綜述甘蔗霉變病原菌梨孢假殼的鑒定、產(chǎn)毒條件、環(huán)境影響因素及其毒素3-硝基丙酸（3-nitropropionic acid，3-NPA）合成機理、檢測方法等研究進展，以期為甘蔗生產(chǎn)、儲運保鮮、食用安全預(yù)防及相關(guān)科學(xué)研究提供參考。

1 甘蔗霉變病原菌梨孢假殼（節(jié)菱孢）

1.1 梨孢假殼（節(jié)菱孢）鑒定研究進展

節(jié)菱孢（Arthrinium）在自然界廣泛分布，常寄生或腐生于長有植被的土壤和一些經(jīng)濟作物的根部、莖部及葉片上［4］。節(jié)菱孢系Kunze于1817年命名［5］，根據(jù)菌株的生長特性、分生孢子形態(tài)，將其歸類于半知菌亞門（Deuteromycotina）絲孢綱（Hyphomycetes）暗色孢科（Sematiaceae）［6］。劉興玠等［7］從中毒甘蔗和變質(zhì)甘蔗樣品中分離獲得產(chǎn)毒的節(jié)菱孢，根據(jù)菌落形態(tài)特征、生長速度、分生孢子著生狀態(tài)、孢子形態(tài)等形態(tài)學(xué)進行分類鑒定，最終分為甘蔗節(jié)菱孢（A. sacchari M. B. Ellis）、蔗生節(jié)菱孢（A. saccharicolz Stevenson）和暗孢節(jié)菱孢［A. phacospermum （Corda） M. B. Ellis］。Pintos和Alvardo［8］將從變質(zhì)甘蔗中分離獲得的甘蔗節(jié)菱孢、蔗生節(jié)菱孢、暗孢節(jié)菱孢等55種節(jié)菱孢重新劃分為梨孢假殼屬（Apiospora）。廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與檢測技術(shù)研究所農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估課題組從霉變甘蔗中分離出能產(chǎn)生3-NPA的另一種梨孢假殼，經(jīng)形態(tài)及內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）標(biāo)記技術(shù)鑒定，確定為蘆竹梨孢假殼（A. arundinis）［9］。這是首次采用分子鑒定梨孢假殼，且對篩選出來的蘆竹梨孢假殼進行產(chǎn)毒能力鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同菌株間存在明顯差異。

劉興玠等［10］從引起中毒重癥的甘蔗中分離獲得的優(yōu)勢菌均為節(jié)菱孢，其占比為58.7%～65.6%，而中毒甘蔗樣品中的節(jié)菱孢檢出率達32.0%。甄應(yīng)中等［11］從變質(zhì)甘蔗中分離獲得的串珠鐮刀菌均不產(chǎn)毒，而產(chǎn)毒的節(jié)菱孢比例高達48.8%。胡文娟等［12］證實節(jié)菱孢產(chǎn)生的毒素為耐熱的3-NPA，主要損害神經(jīng)中樞，對人類及動物均有強烈的毒性作用。侯正宗等［13］對中毒死亡患者食用剩下的同節(jié)甘蔗及同批庫存、市售甘蔗進行真菌分離，結(jié)果顯示節(jié)菱孢的檢出率分別為70.0%、57.1%和43.5%。劉興玠等［14］通過采集自然環(huán)境中的樹皮、秸稈、草類及土壤等樣品進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)只在長期貯存過甘蔗的倉庫土壤中分離出節(jié)菱孢，說明節(jié)菱孢極少腐生于一般土壤及其他植物；此外，測定發(fā)現(xiàn)米曲霉（Aspergillus oryzae）、黃曲霉（A. flavus）和醬油曲霉（A. sojae）等57株霉菌均不產(chǎn)生3-NPA，故推測節(jié)菱孢是變質(zhì)甘蔗中毒的唯一病原菌。已有研究證實，誤食含高濃度3-NPA的變質(zhì)甘蔗可導(dǎo)致嚴(yán)重的食物中毒，臨床上一般在食用變質(zhì)甘蔗后2～5 h出現(xiàn)中毒癥狀，輕者伴有惡心、嘔吐、腹痛、瀉肚等消化道癥狀，部分患者出現(xiàn)暈厥、視物不清晰、不能站立；重癥者則手腳顫抖，陣發(fā)性強直抽搐，甚至出現(xiàn)昏迷［15］。

1.2 環(huán)境因素對梨孢假殼（節(jié)菱孢）的影響

劉江等［16］分別從菌株、培養(yǎng)基、pH、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間等方面探討環(huán)境因素對節(jié)菱孢產(chǎn)毒的影響，結(jié)果表明影響節(jié)菱孢產(chǎn)毒的因素排序為菌株>溫度>時間>培養(yǎng)基>pH；其中，以麥芽汁—酵母膏為培養(yǎng)基、20 ℃下培養(yǎng)21 d、pH 4.5時的3-NPA產(chǎn)量最高，是節(jié)菱孢在實驗條件下的最佳產(chǎn)毒因子。目前，尚缺乏在侵染甘蔗條件下環(huán)境因素對梨孢假殼毒素產(chǎn)生和積累規(guī)律等方面的相關(guān)研究。劉江等［16］對甘蔗霉變過程中各環(huán)節(jié)進行調(diào)查研究，發(fā)現(xiàn)影響甘蔗霉變的關(guān)鍵因素是貯存條件和貯存時間，因此今后應(yīng)重點關(guān)注對影響節(jié)菱孢繁殖及產(chǎn)毒因素的研究，為預(yù)防食用甘蔗中毒提供參考依據(jù) 。劉興玠等［14］研究證實，節(jié)菱孢在適宜的基質(zhì)中、15～28 ℃下能產(chǎn)生大量的3-NPA毒素，且毒素含量隨貯存時間的延長而增加?？梢?，貯存期控制甘蔗霉變是預(yù)防果蔗中毒的關(guān)鍵所在，但目前關(guān)于甘蔗采霉變防控技術(shù)及防霉變殺菌藥劑的研究鮮見報道。

2 3-NPA毒素的研究進展

2.1 3-NPA合成機理研究

3-NPA為結(jié)構(gòu)簡單的小分子生物毒素，其不僅來源于霉變甘蔗，一些真菌和高等植物也具有合成3-NPA毒素的能力。目前，已知能合成3-NPA的真菌有黃曲霉、米曲霉、深酒色青霉（Penicillium atrovenetum）、鏈絲菌（Streptomyces sp.）、節(jié)菱孢、放線菌（Actinomycete）和絲狀菌（Filamentousfungus）等；此外，金虎尾科（Malpighiaceae）、堇菜科（Violaceae）、豆科（Leguminosae）等高等植物同樣具有合成3-NPA毒素的能力［17］。產(chǎn)毒素真菌只能合成游離態(tài)的3-NPA毒素，無法合成3-NPA的葡萄糖酯類衍生物，而高等植物能合成3-NPA的葡萄糖酯類衍生物［17］。能合成3-NPA毒素的真菌大部分能使3-NPA毒素降解成硝酸鹽或亞硝酸鹽，故推測3-NPA毒素可能是天門冬氨酸降解生成硝酸鹽途徑的一個關(guān)鍵中間物質(zhì)：天門冬氨酸→β-氨基丙酸→3-NPA→亞硝酸鹽→硝酸鹽［17］。Birch等［18］、Birkingshaw和Dryland［19］采用同位素14C標(biāo)記研究深酒色青霉的3-NPA毒素合成機理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)β-氨基丙酸并不參與3-NPA的合成，是由天門冬氨酸通過氨基氧化及失去C1而形成。Shaw［20］研究表明，深酒色青霉粗提液可催化β-硝基丙烯酸還原成3-NPA，催化這一反應(yīng)的酶即為β-硝基丙烯酸還原酶。但至今關(guān)于梨孢假殼產(chǎn)毒能力穩(wěn)定性及3-NPA毒素的合成、降解途徑和分子調(diào)控機理尚無文獻報道。

2.2 3-NPA檢測方法

甘蔗3-NPA毒素含量檢測對其食用安全保障具有重要的現(xiàn)實意義。早期檢測3-NPA毒素主要采用薄層色譜法［21，22］，國家標(biāo)準(zhǔn)檢測法BJS 202205《甘蔗及甘蔗汁中3-NPA的測定》規(guī)定采用高效液相色譜檢測3-NPA［23］，且要求樣品的檢出限和定量限分別為0.3和1.0 mg/kg。隨著儀器設(shè)備的發(fā)展革新，汪儆等［24］利用氣質(zhì)色譜—質(zhì)譜法對豆科中的3-NPA毒素進行定性和定量檢測；劉勇等［25］利用熱能檢定器—氣相色譜對大鼠血清中的3-NPA毒素含量進行檢測，其靈敏度可達4 ng/mL；邵國健等［26，27］利用固相萃取—離子色譜法、免試劑離子色譜法檢測甘蔗中的3-NPA毒素，發(fā)現(xiàn)在0.1～50.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，加標(biāo)回收率為89.2%～102.0%，檢出限為0.03 mg/kg；解娜等［28］采用二極管陣列與毛細管電泳結(jié)合檢測甘蔗中的3-NPA毒素，發(fā)現(xiàn)在1.0～100.0 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，加標(biāo)回收率為95.2%～103.9%，檢出限為0.3 mg/L。Jiang等 ［29］采用乙酰膽堿酯酶電化學(xué)生物傳感器檢測3-NPA，其抑制率和3-NPA含量的對數(shù)在0.10～30.00 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，方法穩(wěn)定、靈敏，檢測限為0.05 μg/L，甘蔗樣品中3-NPA加標(biāo)回收率達88.8%～98.2%，其靈敏度遠高于國家標(biāo)準(zhǔn)檢測法BJS 202205。目前，3-NPA毒素檢測最常用的方法是液相色譜法和液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用，其準(zhǔn)確度和靈敏度均較高，但也存在成本高、專業(yè)要求高、耗時長等弊端；熒光法和電化學(xué)法在成本、檢測速度等上具有優(yōu)勢，但其靈敏度、選擇性等需進一步優(yōu)化。

3 展望

盡管國內(nèi)外已開展了大量關(guān)于甘蔗霉變病原菌梨孢假殼及其毒素的研究工作，但主要集中在梨孢假殼及3-NPA毒素的分離鑒定方面，尚缺乏對甘蔗霉變病原菌梨孢假殼的全面、系統(tǒng)認識，也未對甘蔗霉變病原菌的產(chǎn)毒能力、產(chǎn)毒機理及毒性快速監(jiān)測方法等提出明確要求和出臺相關(guān)規(guī)定，關(guān)于甘蔗采后霉變的防控技術(shù)也鮮見報道，以至于難以對甘蔗采后儲運過程的食用安全性進行全面系統(tǒng)地風(fēng)險評估，更無法針對性提出有效的甘蔗霉變病原菌防控措施。因此，今后應(yīng)在以下幾方面開展相關(guān)研究：（1）系統(tǒng)開展甘蔗梨孢假殼產(chǎn)毒能力評價、菌株分類及快速鑒定方法等研究，對高毒菌株所屬區(qū)域的甘蔗消費市場進行重點監(jiān)控，為疑似感染高毒菌株的甘蔗預(yù)警提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支撐；（2）在侵染甘蔗條件下，深入研究環(huán)境因素對梨孢假殼毒素3-NPA產(chǎn)生和積累規(guī)律的影響；（3）探究毒素合成途徑及分子調(diào)控機理，闡明梨孢假殼毒素3-NPA的代謝過程，解析生物合成3-NPA的系統(tǒng)理論知識；（4）利用分子生物學(xué)手段開展3-NPA檢測研究，提高檢測方法的準(zhǔn)確性、靈敏度等；（5）通過生物防控方法高效防控甘蔗中梨孢假殼感染及其毒素3-NPA的合成，研制篩選出高效、安全、適用的甘蔗防霉變藥劑。

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