閆瓊，邵繼海，陳杰鋒，馮燁

對(duì)苯二酚對(duì)類珠藻的生物毒性

閆瓊，邵繼海*，陳杰鋒，馮燁

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)環(huán)境生態(tài)學(xué)院，湖南 長沙 410128)

以從酸化稻田中分離的固氮藍(lán)藻類珠藻(sp. YYLX235)為研究對(duì)象，將類珠藻于脲酶抑制劑對(duì)苯二酚最終質(zhì)量濃度分別為0.0、2.5、5.0、10.0 mg/L的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，培養(yǎng)2、6 d時(shí)分別對(duì)該藻株的生長、光合作用、固氮酶活性、抗氧化酶活性和氧化損傷特征等進(jìn)行分析，探究對(duì)苯二酚對(duì)農(nóng)田類珠藻的生物毒性。結(jié)果表明：2.5 mg/L對(duì)苯二酚處理，短時(shí)間(2 d)內(nèi)對(duì)類珠藻的生長和藻膽蛋白具有刺激效應(yīng)，但隨著處理時(shí)間的延長，刺激效應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)橐种菩?yīng)；對(duì)苯二酚處理對(duì)藻細(xì)胞內(nèi)葉綠素a和類胡蘿卜素含量的影響不明顯；對(duì)苯二酚處理下類珠藻的光合系統(tǒng)Ⅱ電子傳遞效率表現(xiàn)敏感，造成光合系統(tǒng)Ⅱ反應(yīng)中心電子供體側(cè)受損，短時(shí)間(2 d)內(nèi)5.0 mg/L對(duì)苯二酚處理的光合系統(tǒng)Ⅱ最大光化學(xué)效率僅為對(duì)照的79.1%；對(duì)苯二酚處理?xiàng)l件下類珠藻細(xì)胞內(nèi)的過氧化氫酶(CAT)活性升高，6 d時(shí)10.0 mg/L對(duì)苯二酚處理的CAT活性是對(duì)照的9.96倍，但是藻細(xì)胞的脂質(zhì)氧化程度并未因?qū)Ρ蕉犹幚矶觿?；?duì)苯二酚對(duì)類珠藻固氮酶活性具有顯著的抑制效應(yīng)。

類珠藻；固氮藍(lán)藻；對(duì)苯二酚；光合作用；抗氧化酶；固氮酶

尿素是目前廣泛使用的化學(xué)氮肥之一。尿素使用面臨的問題是水解速度太快，導(dǎo)致氮肥流失、利用率不高[1]。此外，尿素快速水解會(huì)引起銨態(tài)氮在土壤中累積，過量的銨態(tài)氮在土壤中發(fā)生硝化反應(yīng)，引起農(nóng)田土壤酸化，耕地質(zhì)量降低[2–3]。對(duì)苯二酚(氫醌)是一種常見的脲酶抑制劑，可延緩尿素向銨態(tài)氮的水解轉(zhuǎn)化，進(jìn)而提高尿素利用效率[4–5]。此外，對(duì)苯二酚還常與硝化抑制劑聯(lián)合使用，減少氮肥流失和遏制氮肥對(duì)土壤的酸化效應(yīng)[6]。

從作用分子機(jī)理來看，對(duì)苯二酚可以和脲酶上的巰基結(jié)合，導(dǎo)致脲酶反應(yīng)中心失活[7]，進(jìn)而抑制脲酶活性，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生生物毒性。毒理學(xué)的研究顯示，對(duì)苯二酚對(duì)許多水生微生物，如枝角類、橈足類和微藻均具有較強(qiáng)的急性毒性[8]。對(duì)苯二酚對(duì)大型溞的48 h的EC50僅為0.15 mg/L[9]。除水生微生物外，對(duì)苯二酚對(duì)動(dòng)物也具有毒性，能引起動(dòng)物血腫，并具有較強(qiáng)的致癌性[10–11]?？梢?，作為脲酶抑制劑，對(duì)苯二酚的生態(tài)毒性和生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)亟待深入研究。

固氮藍(lán)藻是陸地生態(tài)系統(tǒng)氮素輸入的重要微生物類群[12]。在稻田生態(tài)系統(tǒng)中，每季水稻固氮藍(lán)藻向稻田輸入的氮素量最高可達(dá)60 kg/hm2，合理地使用固氮藍(lán)藻，能減少稻田50%左右的氮肥使用量[13]。接種固氮藍(lán)藻可以使水稻增產(chǎn)10%～30%[14]。HU等[15]研究發(fā)現(xiàn)，施加類珠藻能顯著降低水稻籽粒中鎘的含量，減少農(nóng)作物對(duì)重金屬的吸收和積累。對(duì)苯二酚和固氮藍(lán)藻分別在農(nóng)田氮肥保持和氮素輸入方面具有重要的作用。本研究中，以類珠藻為材料，從生長、光合作用、氧化損傷和抗氧化酶活性、固氮能力等方面探討類珠藻對(duì)脲酶抑制劑對(duì)苯二酚脅迫的生理響應(yīng)，探究對(duì)苯二酚的農(nóng)田生態(tài)毒性，旨在為合理利用對(duì)苯二酚提高尿素利用效率和農(nóng)田生物固氮提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　供試材料

供試類珠藻(sp. YYLX235)分離自湖南省岳陽市臨湘酸化稻田。藻株用BG–11培養(yǎng)基光照培養(yǎng)，光照度為2400 lx，光照與黑暗各12 h，培養(yǎng)溫度為(25±1) ℃。對(duì)苯二酚購自Macklin，純度≥98%。

1.2　對(duì)苯二酚抑藻試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將91 mL無菌BG–11培養(yǎng)基加入到250 mL錐形瓶中，分別加入4.00 mL用無菌蒸餾水現(xiàn)配制并經(jīng)過濾除菌的62.5、125.0、250.0 mg/L的對(duì)苯二酚母液(3種處理)，對(duì)照處理加入4.00 mL無菌蒸餾水，最后各加入5 mL對(duì)數(shù)培養(yǎng)期的類珠藻培養(yǎng)液，使其終體積為100 mL，對(duì)苯二酚的最終質(zhì)量濃度分別為0.0、2.5、5.0、10.0 mg/L，各處理類珠藻藻細(xì)胞起始密度約為1.36×106/mL。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。將各處理光照培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同1.1。培養(yǎng)2、6 d時(shí)取樣分析。

1.3　測定方法

1.3.1類珠藻的細(xì)胞密度和光合色素含量及抗氧化指標(biāo)的測定

采用浮游植物計(jì)數(shù)框在顯微鏡下測定類珠藻的細(xì)胞密度。利用6 d時(shí)對(duì)苯二酚的使用劑量和其對(duì)類珠藻的抑制率進(jìn)行回歸分析，計(jì)算6 d時(shí)對(duì)苯二酚對(duì)類珠藻的EC50。

取4 mL藻液于10 mL離心管中，4 ℃、8000 r/min離心10 min，棄上清液，收集藻細(xì)胞。向收集了藻細(xì)胞的離心管中加入4 mL 95%的乙醇，于4 ℃低溫環(huán)境中避光浸提藻細(xì)胞內(nèi)的葉綠素a和類胡蘿卜素，24 h后取出，再次離心并收集上清液，用分光光度計(jì)于665、649、470 nm處測定吸光度，參照李合生[16]所述方法計(jì)算藻細(xì)胞內(nèi)葉綠素a和類胡蘿卜素的含量。

按上述方法收集藻細(xì)胞，加入5 mL磷酸緩沖液(0.05 mol/L、pH 6.8)重懸，將重懸后的藻細(xì)胞轉(zhuǎn)移至陶瓷研缽中，加入少許石英砂并在液氮環(huán)境中研磨破碎藻細(xì)胞，4 ℃、8000 r/min離心10 min，收集上清液。運(yùn)用分光光度計(jì)分別測定上清液在620、650、565 nm處的吸光度，并按林燊等[17]所述方法計(jì)算藻藍(lán)蛋白(PC)和別藻藍(lán)蛋白(APC)含量，兩者構(gòu)成藍(lán)藻中藻膽蛋白的主要成分，此處以兩者含量和為藻膽蛋白含量。采用氮藍(lán)四唑光還原法和鉬酸銨比色法分別測定上清液中超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)活性。采用考馬斯亮藍(lán)法和硫代巴比妥酸法分別測定上清液中可溶性蛋白含量和丙二醛(MDA)含量。

1.3.2類珠藻葉綠素光誘導(dǎo)熒光測定(JIP–test)

運(yùn)用藻類葉綠素?zé)晒鉁y定儀(AquaPen–C AP–C 100)測定類珠藻葉綠素光誘導(dǎo)熒光多相瞬態(tài)上升動(dòng)力學(xué)特征，并繪制類珠藻OJIP動(dòng)力學(xué)曲線[18]。取樣2 mL，熒光測定前將所有樣品置于黑暗處進(jìn)行暗適應(yīng)15 min，熒光測定的光化光照度為2.4×105lx，熒光瞬時(shí)上升曲線的記錄時(shí)間為5×10–5～1 s。參照CHRISTEN等[19]所述方法，分析葉綠素光誘導(dǎo)熒光動(dòng)力學(xué)參數(shù)：光合系統(tǒng)Ⅱ最大光化學(xué)效率(P0)、捕獲的激子將電子傳遞到電子傳遞鏈中超過電子受體QA的其他電子受體的概率(0)、用于電子傳遞的量子產(chǎn)額(E0)、熱耗散量子比率(D0)、光合放氧復(fù)合體電子傳遞效率、光合系統(tǒng)Ⅱ綜合效能(PIabs)。

1.3.3類珠藻固氮活性的測定

于120 mL的培養(yǎng)瓶中加入5 mL藻液，以帶硅膠塞的螺帽密封，抽出10%的氣體，注入等體積的乙炔，繼續(xù)培養(yǎng)5 h，而后抽取800 μL氣樣，使用安捷倫GC–9A型氣相色譜儀測定生成的乙烯的量。氣相色譜柱為安捷倫CP7518(CP–Al2O3/KCl，50 m×0.53 mm，i.d. 10.00 μm)，檢測器為FID。氣相色譜儀的工作條件設(shè)定如下：檢測室溫度120 ℃，柱溫70 ℃，氮?dú)饬魉贋?0 mL/min，氫氣流速為50 mL/min，空氣流速為500 mL/min。以單位藻細(xì)胞在單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生乙烯的量表示固氮活性。

1.4　數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

運(yùn)用SPSS 13.1對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，選用LSD進(jìn)行多重比較。

2　結(jié)果與分析

2.1　對(duì)苯二酚對(duì)類珠藻生長的影響

從表1可知，2 d時(shí)，2.5 mg/L對(duì)苯二酚對(duì)類珠藻的生長具有刺激作用，其藻細(xì)胞密度顯著高于其他處理的，比對(duì)照的高30.6%；5.0、10.0 mg/L對(duì)苯二酚處理的類珠藻細(xì)胞密度與對(duì)照組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。從2 d到6 d，對(duì)照組類珠藻按正常的速率生長，而對(duì)苯二酚處理的類珠藻的細(xì)胞密度均下降。6 d時(shí)，2.5、5.0、10.0 mg/L對(duì)苯二酚處理的類珠藻藻細(xì)胞密度均顯著低于對(duì)照的，分別低30.3%、35.2%、47.9%，但是不同質(zhì)量濃度對(duì)苯二酚處理間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。6 d時(shí)對(duì)苯二酚對(duì)類珠藻的EC50為12.88 mg/L。

同列不同字母示同一時(shí)間組內(nèi)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(<0.05)。

2.2　對(duì)苯二酚對(duì)類珠藻光合色素含量的影響

從表1可知，與對(duì)照相比，對(duì)苯二酚處理對(duì)類珠藻細(xì)胞內(nèi)葉綠素a和類胡蘿卜素的含量無顯著影響；2 d時(shí)，2.5、5.0、10.0 mg/L對(duì)苯二酚對(duì)類珠藻細(xì)胞內(nèi)藻膽蛋白(PC+APC)含量具有顯著的刺激作用，對(duì)類珠藻細(xì)胞內(nèi)PC和APC含量的比值影響不大；6 d時(shí)，對(duì)苯二酚對(duì)類珠藻細(xì)胞內(nèi)藻膽蛋白含量的刺激作用消失，2.5、5.0 mg/L對(duì)苯二酚對(duì)類珠藻細(xì)胞內(nèi)藻膽蛋白含量沒有顯著的影響，但PC和APC含量的比值分別為對(duì)照的1.99倍和3.50倍，而10.0 mg/L對(duì)苯二酚處理顯著降低細(xì)胞內(nèi)的藻膽蛋白含量，但對(duì)PC和APC含量的比值影響不大。

2.3　對(duì)苯二酚對(duì)類珠藻葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)特征的影響

從圖1可以看出，2、6 d時(shí)，所有處理類珠藻葉綠素?zé)晒馑矐B(tài)動(dòng)力學(xué)特征均呈現(xiàn)典型的OIJP曲線特征；2 d時(shí)，熒光動(dòng)力學(xué)瞬態(tài)上升曲線斜率(d/d0)隨對(duì)苯二酚質(zhì)量濃度的增加而增加，6 d時(shí)，各處理組動(dòng)力學(xué)d/d0差異不明顯。從表2可以看出，與對(duì)照相比，2 d時(shí)，對(duì)苯二酚處理能降低能量分配比率參數(shù)P0、E0和PIabs值，5.0 mg/L對(duì)苯二酚處理的P0僅為對(duì)照的79.1%，對(duì)苯二酚質(zhì)量濃度越高，抑制效應(yīng)越明顯，對(duì)0和光合放氧復(fù)合體電子傳遞效率也具有抑制效應(yīng)，且隨著對(duì)苯二酚濃度增加，抑制效應(yīng)越強(qiáng)，而D0隨著對(duì)苯二酚質(zhì)量濃度升高逐漸增強(qiáng)；6 d時(shí)，2.5 mg/L對(duì)苯二酚處理的PIabs值顯著增加，而10.0 mg/L對(duì)苯二酚處理的P0顯著降低，0顯著增加。

圖1　對(duì)苯二酚處理的類珠藻葉綠素?zé)晒馑矐B(tài)動(dòng)力學(xué)特征

表2　對(duì)苯二酚處理的類珠藻葉綠素?zé)晒馑矐B(tài)動(dòng)力學(xué)參數(shù)變化特征

同列不同字母示同一時(shí)間組內(nèi)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(<0.05)。

2.4　對(duì)苯二酚對(duì)類珠藻固氮活性的影響

從表3可知，2 d時(shí)，對(duì)苯二酚處理的類珠藻固氮活性均顯著低于對(duì)照的；但在2.5～10.0 mg/L的濃度范圍內(nèi)，固氮活性隨對(duì)苯二酚濃度的增加而增加。6 d時(shí)，2.5 mg/L對(duì)苯二酚處理的固氮活性與對(duì)照的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而5.0、10.0 mg/L對(duì)苯二酚處理的固氮活性仍顯著低于對(duì)照的。

2.5　對(duì)苯二酚處理下類珠藻細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活性和MDA含量變化特征

從表3可知，2.5～10.0 mg/L對(duì)苯二酚對(duì)藻細(xì)胞內(nèi)的SOD活性沒有顯著影響；5.0、10.0 mg/L對(duì)苯二酚可顯著提高藻細(xì)胞內(nèi)的CAT活性，2 d時(shí)，5.0、10.0 mg/L對(duì)苯二酚處理CAT活性分別為對(duì)照的4.92倍和5.83倍，6 d時(shí)所有處理細(xì)胞內(nèi)的CAT活性較2 d時(shí)同一處理的均有所下降，但5.0、10.0 mg/L對(duì)苯二酚處理的CAT活性與對(duì)照的差距進(jìn)一步擴(kuò)大，分別為對(duì)照的7.51倍和9.96倍；2 d時(shí)，2.5～10.0 mg/L對(duì)苯二酚處理的類珠藻MDA含量均顯著低于對(duì)照的，其中，2.5 mg/L對(duì)苯二酚處理的含量最低，僅為對(duì)照的36.4%，3組對(duì)苯二酚處理的類珠藻MDA含量隨對(duì)苯二酚處理濃度的增加而顯著遞增，6 d時(shí)，各處理的MDA含量間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3　對(duì)苯二酚處理的類珠藻的固氮活性和抗氧化酶活性及丙二醛含量

同列不同字母示同一時(shí)間組內(nèi)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(<0.05)。

3　結(jié)論與討論

對(duì)苯二酚具有較強(qiáng)的生物毒性。B?HRS等[20]的研究顯示，對(duì)苯二酚對(duì)銅綠微囊藻()具有極強(qiáng)的生物毒性，其24、48 h的生長EC50分別為0.96、0.49 mg/L；對(duì)苯二酚對(duì)不同種類微藻的毒性差異較大，對(duì)苯二酚對(duì)藍(lán)藻門中的集胞藻(sp.)的毒性是其對(duì)銅綠微囊藻的毒性的8.46%。本研究中；10.0 mg/L的對(duì)苯二酚對(duì)類珠藻的生長沒有明顯的抑制作用，可見類珠藻對(duì)對(duì)苯二酚的耐受能力強(qiáng)于銅綠微囊藻；6 d時(shí)，2.5 mg/L對(duì)苯二酚即可顯著抑制類珠藻的生長，此時(shí)對(duì)苯二酚對(duì)類珠藻的EC50為12.88 mg/L，這也進(jìn)一步表明類珠藻對(duì)對(duì)苯二酚有較強(qiáng)的耐受性。

丁惠君等[21]的研究結(jié)果顯示，當(dāng)對(duì)苯二酚濃度為0.2 mg/L時(shí)，銅綠微囊藻的葉綠素a含量已無法檢測到。本研究中，所有對(duì)苯二酚處理的類珠藻細(xì)胞內(nèi)的葉綠素a與類胡蘿卜素含量并未出現(xiàn)下降現(xiàn)象，光合色素含量的變化特性再次表明類珠藻對(duì)對(duì)苯二酚的耐受能力強(qiáng)于銅綠微囊藻；2 d的對(duì)苯二酚處理能增加藍(lán)藻藻膽蛋白的含量，這可能與藻細(xì)胞的應(yīng)激效應(yīng)有關(guān)[22]；隨著處理時(shí)間的延長，6 d時(shí)，10.0 mg/L對(duì)苯二酚處理顯著降低了類珠藻藻膽蛋白含量，盡管2.5、5 mg/L對(duì)苯二酚處理的類珠藻藻膽蛋白含量沒有顯著影響，但是卻顯著改變了PC和APC含量的比值，PC所占比例增加，而APC所占比例降低。APC的捕光效率高于PC的[23]，盡管對(duì)苯二酚處理沒有降低類珠藻藻膽蛋白的含量，卻提高了PC的相對(duì)比率，從而導(dǎo)致了類珠藻捕光效率降低。

本研究中，即使是2.5 mg/L對(duì)苯二酚處理2 d也能顯著降低類珠藻光合系統(tǒng)Ⅱ的綜合性能，由此推測2.5 mg/L對(duì)苯二酚可能已造成了類珠藻光合系統(tǒng)Ⅱ的損傷。熒光參數(shù)P0、0、光合放氧復(fù)合體電子傳遞效率分別反映光合系統(tǒng)Ⅱ反應(yīng)中心電子供體側(cè)、受體側(cè)及光合放氧復(fù)合體的性能[23]。熒光參數(shù)分析結(jié)果表明，對(duì)苯二酚處理可造成光合系統(tǒng)Ⅱ反應(yīng)中心電子供體側(cè)和受體側(cè)受損，其中電子供體側(cè)表現(xiàn)更為敏感。光合系統(tǒng)Ⅱ電子傳遞受損導(dǎo)致部分電子回流，使得對(duì)苯二酚還原速率(d/d0)增加。對(duì)比對(duì)苯二酚處理下類珠藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)、生長和光合色素含量的變化特征可以發(fā)現(xiàn)，類珠藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)比生長和光合色素含量變化特征更靈敏。

KULASOORIYA等[24]的研究結(jié)果顯示，微生物的固氮活性對(duì)環(huán)境因子脅迫響應(yīng)靈敏。本研究的結(jié)果也顯示，固氮活性對(duì)對(duì)苯二酚處理的響應(yīng)比生長和光合色素含量的靈敏。生物固氮需要消耗大量的生物能，細(xì)胞每固定1分子的氮?dú)庑枰?6分子的ATP[25]。當(dāng)細(xì)胞受到脅迫時(shí)，細(xì)胞需要更多的生物能來應(yīng)對(duì)脅迫，導(dǎo)致分配給固氮作用的能量份額會(huì)降低，進(jìn)而降低細(xì)胞的固氮活性[26]。此外，對(duì)苯二酚處理?xiàng)l件下類珠藻光合作用效率顯著降低。光合作用產(chǎn)能降低可能是對(duì)苯二酚處理?xiàng)l件下其固氮活性降低的另一個(gè)原因。

光合系統(tǒng)中，受到光活化的高能電子若不通過光合作用電子傳遞的方式淬滅，則會(huì)轉(zhuǎn)化為氧自由基，這是光合微生物細(xì)胞內(nèi)源性氧自由基的主要來源之一[23]。SOD和CAT是細(xì)胞內(nèi)主要的抗氧化酶，當(dāng)細(xì)胞受到氧化脅迫后，細(xì)胞內(nèi)的抗氧化酶活性往往會(huì)上升[27]。對(duì)苯二酚處理?xiàng)l件下類珠藻光合系統(tǒng)的電子傳遞效率降低，表明有更高比例的高能電子轉(zhuǎn)化為內(nèi)源性氧自由基，這可能是對(duì)苯二酚處理?xiàng)l件下類珠藻細(xì)胞內(nèi)CAT活性升高的原因之一。從對(duì)苯二酚的化學(xué)結(jié)構(gòu)來看，對(duì)苯二酚本身是一種還原劑，但是對(duì)苯二酚也可以在金屬離子的誘導(dǎo)下發(fā)生自氧化，產(chǎn)生氧自由基[28–29]。可見，對(duì)苯二酚對(duì)細(xì)胞氧化和抗氧化系統(tǒng)具有復(fù)雜的作用效應(yīng)，它既可以充當(dāng)還原劑緩解氧化脅迫，也可以自氧化成自由基對(duì)細(xì)胞造成氧化損傷[8]。本研究的結(jié)果顯示，盡管對(duì)苯二酚處理后類珠藻細(xì)胞內(nèi)CAT活性升高，但是細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)氧化產(chǎn)物MDA含量卻顯著低于對(duì)照。據(jù)此可以推測，對(duì)苯二酚處理可能沒有導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)膜受到氧化性損傷。此外，由于對(duì)苯二酚本身的化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，其在類珠藻培養(yǎng)體系中的濃度會(huì)隨培養(yǎng)時(shí)間的延長而衰減，這可能是2 d時(shí)對(duì)苯二酚對(duì)類珠藻光合系統(tǒng)Ⅱ電子傳遞效率和固氮酶活性的抑制強(qiáng)度遠(yuǎn)高于6 d的原因。

[1] MODOLO L V，DA-SILVA C J，BRAND?O D S，et al. A minireview on what we have learned about urease inhibitors of agricultural interest since mid-2000s[J]. Journal of Advanced Research，2018，13：29–37．

[2] GUO J H，LIU X J，ZHANG Y，et alSignificant acidification in major Chinese croplands[J]．Science，2010，327：1008–1010．

[3] ZHU Q C，LIU X J，HAO T X，et al．Cropland acidification increases risk of yield losses and food insecurity in China[J]．Environmental Pollution，2020，256：113145．

[4] 雋英華，陳振華，張玉蘭，等．脲酶抑制劑氫醌對(duì)土壤脲酶動(dòng)力學(xué)行為的調(diào)控效應(yīng)[J]．中國土壤與肥料，2015(4)：53–58．

[5] 李玉，王茂瑩，張倩，等．包膜脲酶抑制劑增效尿素對(duì)小麥生長的影響及其機(jī)理研究[J]．水土保持學(xué)報(bào)，2020，34(2)：283–289．

[6] 賴睿特，楊涵博，張克強(qiáng)，等．硝化/脲酶抑制劑及生物質(zhì)炭對(duì)養(yǎng)殖肥液灌溉土壤氮素轉(zhuǎn)化的影響[J]．農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境學(xué)報(bào)，2020，37(4)：537–543．

[7] MAZZEI L，CIANCI M，MUSIANI F，et alInactivation of urease by 1,4-benzoquinone：chemistry at the protein surface[J]．DaltonTransactions，2016，45(13)：5455–5459.

[8] ENGUITA F J，LEIT?O A L．Hydroquinone：environmental pollution，toxicity，and microbial answers[J]．BioMed Research International，2013，2013：542168．

[9] GUERRAR．Ecotoxicological and chemical evaluation of phenolic compounds in industrial effluents[J]. Chemosp- here，2001，44(8)：1737–1747．

[10] MCGREGORD．Hydroquinone：an evaluation of the human risks from its carcinogenic and mutagenic properties[J]．Critical Reviews in Toxicology，2007，37(10)：887–914．

[11] LIU L H，LING X X，WU M H，et al．Rb silencing mediated by the down-regulation of MeCP2is involved in cell transformation induced by long-term exposure to hydroquinone[J]．Molecular Carcinogenesis，2017，56(2)：651–663．

[12] BELLENGER J P，DARNAJIOUX R，ZHANG X，et al. Biological nitrogen fixation by alternative nitrogenases in terrestrial ecosystems：a review[J]．Biogeochemistry，2020，149(1)：53–73．

[13] ABINANDAN S，SUBASHCHANDRABOSE S R，VENKATESWARLU K，et al．Soil microalgae and cyanobacteria：the biotechnological potential in the maintenance of soil fertility and health[J]．Critical Reviews in Biotechnology，2019，39(8)：981–998．

[14] 沈銀武，黎尚豪．固氮藍(lán)藻培養(yǎng)和應(yīng)用的結(jié)果與展望[J]．水生生物學(xué)報(bào)，1993，17(4)：357–364．

[15] HU T，CHEN A W，JIANG Y X，et al．Application of a newly recorded diazotrophic cyanobacterium in acidified and Cd contaminated paddy soil：Promotes rice yield and decreases Cd accumulation[J]．The Science of the Total Environment，2022，814：152630．

[16] 李合生．植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)[M]．北京：高等教育出版社，2000．

[17] 林燊，彭欣，吳忠興，等．我國水華藍(lán)藻的新類群：阿氏浮絲藻()生理特性[J]．湖泊科學(xué)，2008，20(4)：437–442．

[18] 王鈺亮，劉洋，潘文靜，等．藍(lán)藻水華新種：螺旋浮絲藻()的生理特征研究[J]．河南師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2016，44(6)：130–134．

[19] CHRISTEN D，SCH?NMANN S，JERMINI M，et al. Characterization and early detection of grapevine() stress responses to esca disease by in situ chlorophyll fluorescence and comparison with drought stress[J]．Environmental and Experimental Botany，2007，60：504–514．

[20] B?HRS H，PUTSCHEW A，STEINBERG C E W. Toxicity of hydroquinone to different freshwater phototrophs is influenced by time of exposure and pH [J]．Environmental Science and Pollution Research，2013，20(1)：146–154．

[21] 丁惠君，張維昊，周偉斌，等．兩種酚酸類化感物質(zhì)對(duì)銅綠微囊藻生長的影響[J]．2007，30(7)：1–3．

[22] SHAO J H，LIU D M，GONG D X，et al．Inhibitory effects of sanguinarine against the cyanobacteriumNIES-843 and possible mechanisms of action[J]．Aquatic Toxicology，2013，142：257–263．

[23] LIN Y Q，CHEN A W，HE Y X，et al．Responses of(Cyanobacteria) to sanguinarine stress：morphological and physiological characteristics associated with competitive advantage[J]．Phycologia，2019，58(3)：260–268．

[24] KULASOORIYA S A，MAGANA-ARACHCHI D N. Nitrogen fixing cyanobacteria：their diversity，ecology and utilisation with special reference to rice cultivation[J].Journal of the National Science Foundation of Sri Lanka，2016，44 (2)：111–128．

[25] 晁愛敏，于海燕，肖鵬，等．杭州湘湖拉氏擬柱孢藻()藻株的分離及其特征研究[J]．河南師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2021，49(4)：106–113．

[26] HONG H Z，SHEN R，ZHANG F T，et al．The complex effects of ocean acidification on the prominent N2-fixing cyanobacterium[J]．Science，2017，356：527–531．

[27] CHAKRABORTY S，TIWARI B，SINGH S S，et al. Differential physiological，oxidative and antioxidative responses of cyanobacteriumto attenuate malathion pesticide toxicity[J]．Biocatalysis and Agricultural Biotechnology，2017，11：56–63．

[28] NORTH M，TANDON V J，THOMAS R，et al. Genome-wide functional profiling reveals genes required for tolerance to benzene metabolites in yeast[J]．PLoS One，2011，6(8)：e24205．

[29] PEROTTI E B R．Impact of hydroquinone used as a redox effector model on potential denitrification，microbial activity and redox condition of a cultivable soil[J]．Revista Argentina de Microbiología，2015，47(3)：212–218．

Bio-toxicity of hydroquinone on

YAN Qiong，SHAO Jihai*，CHEN Jiefeng，F(xiàn)ENG Ye

(College of Environment & Ecology, Hunan Agricultural University, Changsha, Hunan 410128, China)

In order to elucidate the biotoxicity of the urease inhibitor hydroquinone to the nitrogen-fixing cyanobacterium,sp. YYLX235, which was isolated from an acidified rice paddy field, the effects of hydroquinone (0.0, 2.5, 5.0, 10.0 mg/L) on the growth, photosynthesis, nitrogen fixing enzyme activity, antioxidant enzyme activity and oxidative damage characteristics ofsp. YYLX235 were investigated on 2, 6 d.The results of concentration gradient toxicology tests showed that 2.5 mg/L hydroquinone had stimulating effects on the growth and phycobilin protein ofsp YYLX235 at the 2 d, but the stimulatory effect shifted to an inhibitory effect as the treatment time increased. Hydroquinone showed no significant effects on the contents of chlorophylland carotenoids in the cells ofsp. YYLX235. The electron transfer efficiency of photosystem Ⅱ(PSⅡ) ofsp. YYLX235 was sensitive to hydroquinone stress. The electron donating side of PS Ⅱ was severely damaged by hydroquinone, the maximum quantum yield of primary photochemistry of 5.0 mg/L hydroquinone treatment at 2 d was only 79.1% of that of the control. The activity of catalase(CAT) in the cells ofsp. YYLX235 was promoted by hydroquinone. The CAT activity of 10.0 mg/L hydroquinone treatment was 9.96 times that of the control at 6 d，while no oxidative damage on lipids was observed under hydroquinone stress. The activity of nitrogen fixation ofsp. YYLX235 was significantly inhibited by hydroquinone.

sp.; diazotrophic cyanobacteria; hydroquinone; photosynthesis; antioxidative enzyme; nitrogenase

X171.5；Q945.78

A

1007–1032(2023)05–0624–07

閆瓊，邵繼海，陳杰鋒，馮燁．對(duì)苯二酚對(duì)類珠藻的生物毒性[J]．湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2023，49(5)：624–630．

YAN Q，SHAO J H，CHEN J F，F(xiàn)ENG Y．Bio-toxicity of urease inhibitor hydroquinone on[J]．Journal of Hunan Agricultural University(Natural Sciences)，2023，49(5)：624–630．

http://xb.hunau.edu.cn

2022–06–08

2023–10–20

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(32071647)

閆瓊(1997—)，女，湖南岳陽人，碩士研究生，主要從事農(nóng)業(yè)環(huán)境微生物學(xué)研究，907162133@qq.com；*通信作者，邵繼海，博士，教授，主要從事藍(lán)藻生理生態(tài)研究，shao@hunau.net

10.13331/j.cnki.jhau.2023.05.018

責(zé)任編輯：鄒慧玲

英文編輯：柳正