戴垚，王瑾，戴麗，何長(zhǎng)征，劉峰*

辣椒綠莖突變體轉(zhuǎn)錄組及候選基因表達(dá)分析

戴垚1,2,3，王瑾1,2,3，戴麗1,2,3，何長(zhǎng)征1,2,3，劉峰1,2,3*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.園藝作物種質(zhì)創(chuàng)新與新品種選育教育部工程研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128；3.蔬菜生物學(xué)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

以EMS誘變的辣椒綠莖突變體和紫莖野生型樟樹港辣椒(ST–8)為材料，測(cè)定莖中花青素含量；采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)(RNA–seq)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT–PCR)分析與辣椒莖中花青素生物合成相關(guān)基因的表達(dá)水平。結(jié)果表明：突變體莖中的花青素含量極顯著低于ST–8莖中的花青素含量；與ST–8相比，共獲得1794個(gè)差異表達(dá)基因，包括1003個(gè)上調(diào)表達(dá)基因，791個(gè)下調(diào)表達(dá)基因；與花青素生物合成途徑相關(guān)的基因包括9個(gè)結(jié)構(gòu)基因()和3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子()；對(duì)與花青素合成相關(guān)的差異表達(dá)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組表達(dá)量分析和qRT–PCR分析，篩選出4個(gè)結(jié)構(gòu)基因()和1個(gè)轉(zhuǎn)錄因子()，推測(cè)這5個(gè)基因可能在辣椒莖中花青素生物合成途徑中起重要作用。

辣椒；莖；轉(zhuǎn)錄組；差異表達(dá)基因；花青素；突變體

辣椒(L)原產(chǎn)于中南美洲，自16 世紀(jì)后期傳入中國(guó)后成為了中國(guó)重要的蔬菜和調(diào)味品，對(duì)中國(guó)的飲食文化產(chǎn)生了深刻影響[1-2]。辣椒富含多種物質(zhì)，具有抗氧化、降脂降糖、抗菌和抗癌等作用[3]，屬于食﹑藥兩用資源[4]，在食品、醫(yī)藥和化妝品等方面都受到廣泛關(guān)注。辣椒適應(yīng)性強(qiáng)、經(jīng)濟(jì)效益高、種植范圍廣，已成為農(nóng)民增收、農(nóng)村發(fā)展的支柱產(chǎn)業(yè)[5]。

花青素是一類常見的植物水溶性色素，屬于類黃酮次生代謝物，具有多種生物學(xué)功能，如植物著色、促進(jìn)花粉和種子傳播、抵御紫外線傷害、抗低溫等[6]。此外，花青素還具有抗氧化、抗炎、保護(hù)視力、抗腫瘤等功能[7]?；ㄇ嗨厥且员奖彼釣橹苯雍铣汕绑w，通過類黃酮途徑合成的，涉及多種結(jié)構(gòu)基因和轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)與調(diào)控。在植物細(xì)胞中，花青素通常不能以單體形式存在，而是在類黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶(UFGT)的催化下與糖苷結(jié)合形成穩(wěn)定的花青素苷[8]，在谷胱甘肽–S–轉(zhuǎn)移酶(GST)的作用下從細(xì)胞質(zhì)運(yùn)輸?shù)揭号葜袃?chǔ)存起來[9]。

轉(zhuǎn)錄因子可形成復(fù)合物，通過與結(jié)構(gòu)基因的啟動(dòng)子結(jié)合或調(diào)控其他類型的轉(zhuǎn)錄因子，來抑制或促進(jìn)花青素合成途徑中結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，影響花青素的積累。其中，由MYB、bHLH和WD40蛋白組成的MBW復(fù)合物受到廣泛關(guān)注[10]。MYB轉(zhuǎn)錄因子是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，也是植物花青素生物合成過程中最重要的調(diào)控因子[11]。在成熟的蘋果果實(shí)中，MdMYB1的表達(dá)與果實(shí)紅皮部分花青素的合成密切相關(guān)[12]。bHLH轉(zhuǎn)錄因子是調(diào)控花青素合成的第二大類轉(zhuǎn)錄因子家族。辣椒中CabHLH1可直接與DFR啟動(dòng)子結(jié)合，激活類黃酮的表達(dá)[13]。研究[14]發(fā)現(xiàn)，WD40轉(zhuǎn)錄因子也參與調(diào)控花青素的合成。

近年來，有關(guān)辣椒花青素的研究報(bào)道較多，但主要集中在辣椒果實(shí)中[15–17]，對(duì)辣椒莖中花青素的相關(guān)報(bào)道較少。CHEN等[18]研究發(fā)現(xiàn)，CaHY5直接調(diào)控花青素的生物合成與運(yùn)輸，控制辣椒下胚軸花青素的積累，可作為苗期形態(tài)鑒定的關(guān)鍵基因。為探究影響辣椒莖中花青素生物合成的關(guān)鍵基因及調(diào)控機(jī)制，本研究中，以突變體和野生型辣椒ST–8的莖為材料進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，以明確其關(guān)鍵基因及調(diào)控機(jī)制，旨在為辣椒莖中花青素合成相關(guān)基因的鑒定及功能分析提供參考。

1　材料與方法

1.1 材料

從樟樹港辣椒(ST–8)的突變體庫(kù)中篩選出1個(gè)穩(wěn)定遺傳的綠莖突變體，該突變體由EMS誘變獲得，由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院提供。2021年2月，將野生型ST–8及突變體的種子播種于育苗穴盤中，在湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)的人工氣候溫室中培養(yǎng)，16 h光照(25 °C)，8 h黑暗(20 °C)，光照度為24 000 lx，相對(duì)濕度為65%。幼苗長(zhǎng)至4葉1心后移至單個(gè)營(yíng)養(yǎng)缽(直徑17 cm)于溫室中常規(guī)栽培。分別采集ST–8和開花期植株的莖，3次生物學(xué)重復(fù)，液氮速凍后置于–80 ℃冰箱保存，用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和qRT–PCR分析。

1.2 花青素含量測(cè)定

分別采集及ST–8開花期植株的莖，采用植物花青素檢測(cè)試劑盒(上海茁彩生物科技有限公司出品)測(cè)定莖中花青素的含量。

1.3 轉(zhuǎn)錄組差異基因分析

分別采集及ST–8開花期植株的莖，使用TransZol試劑盒(北京全式金生物技術(shù)股份有限公司出品)提取RNA。利用Illumina HiSeq? X–Ten平臺(tái)進(jìn)行PE雙末端測(cè)序(由百邁克生物科技有限公司完成)，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。利用FastQC(v0.11.5)[19]和Trimmomatic(v0.36)[20]過濾低質(zhì)量讀段，運(yùn)用Tophat2(v2.1.1)[21]將過濾后得到的讀段比對(duì)到辣椒‘Zunla’參考基因組上，以獲得高質(zhì)量讀段。采用DESeq2對(duì)高質(zhì)量讀段進(jìn)行差異表達(dá)基因分析，篩選閾值設(shè)置為|log2|≥1(為差異倍數(shù))，錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率<0.05，基因表達(dá)量用值(每1000個(gè)堿基轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的片段)表示[22]。采用R語言ggplot2程序包進(jìn)行差異表達(dá)基因主成分分析。

1.4 差異表達(dá)基因功能注釋

將和ST–8的差異表達(dá)基因蛋白序列提交到Plant Transcriptional Regulatory Map online(http:// plantregmap.cbi.pku.edu.cn/go.php)進(jìn)行差異表達(dá)基因GO富集注釋，利用AgriGO(v2.0)[23]和WEGO 2.0[24]軟件進(jìn)行分析。

將和ST–8的差異表達(dá)基因蛋白序列提交到KOBAS 3.0 (http://kobas.cbi.pku.edu.cn/anno_ iden.php)在線軟件進(jìn)行KEGG通路富集分析，利用R語言ggplot2程序包將分析結(jié)果可視化。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析(qRT–PCR)

使用HiScript? IIQ RT SuperMix(+gDNAwiper) 試劑盒(Vazyme Biotech Co. Ltd，美國(guó))將ST–8和莖的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再將cDNA樣品稀釋至100 ng/μL，用于qRT–PCR分析，反應(yīng)體系為：10 μL SYBR qPCR Master Mix，0.4 μL引物，7.2 μL ddH2O和2 μL稀釋cDNA。利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)特異性引物，以為內(nèi)參基因，引物序列如表1所示。使用羅氏LightCycle? 96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行qRT–PCR分析，設(shè)置3個(gè)重復(fù)，采用公式2–ΔΔCt計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

表1　qRT–PCR引物序列

2　結(jié)果與分析

2.1　表型分析

觀察突變體和野生型ST–8的表型特征，發(fā)現(xiàn)野生型ST–8的莖總體呈綠色，帶有紫色，莖節(jié)間為明顯的紫色，而突變體的莖為均勻的綠色。對(duì)花青素含量進(jìn)行測(cè)定，ST–8的莖中花青素含量為188.04 μg/g，突變體花青素含量只有17.19 μg/g，二者差異極顯著。

2.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量控制

采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)綠莖和ST–8紫莖共6個(gè)樣本(3次重復(fù))進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。去除低質(zhì)量讀段后，各樣本過濾后平均讀段為21 277 448個(gè)，讀段總堿基數(shù)為5.99～6.80 Gbp，平均為6.37 Gbp。過濾后數(shù)據(jù)的Q20指標(biāo)均大于96%，Q30指標(biāo)均大于91%，GC含量為42.64%～43.79%(表2)。

表2　RNA–seq樣本數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估

為了明確各樣本之間的相關(guān)性，對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行主成分分析，結(jié)果如圖1所示。PC1、PC2的方差百分比分別為44.7%和18.9%，和ST–8的組內(nèi)聚集效果和組間分離趨勢(shì)差異明顯，說明該測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量較高，可以滿足轉(zhuǎn)錄組分析的要求。

圖1　差異表達(dá)基因的主成分分析

2.3 差異表達(dá)基因的鑒定及功能富集分析

采用DESeq2軟件，定義樣本之間|log2|≥1，錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率<0.05的基因?yàn)椴町惐磉_(dá)基因，其中將log2≥1的基因定義為上調(diào)表達(dá)基因，log2≤–1的基因?yàn)橄抡{(diào)表達(dá)基因。結(jié)果顯示，突變體與野生型相比，共獲得1794個(gè)差異表達(dá)基因(DEGs)，其中1003個(gè)(56%)上調(diào)表達(dá)，791個(gè)(44%)下調(diào)表達(dá)。

將轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的差異表達(dá)基因(DEGs)進(jìn)行GO富集分析。由圖2可知，DEGs廣泛富集在細(xì)胞組分、生物過程和分子功能3大類。在細(xì)胞組分類別中，有269個(gè)基因富集在細(xì)胞內(nèi)，占總基因數(shù)量的23.2%；263個(gè)(22.7%)基因存在于細(xì)胞內(nèi)部分；235個(gè)(20.3%)基因存在于細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器。在分子功能類別中，雜環(huán)化合物結(jié)合和有機(jī)環(huán)化合物結(jié)合均有395個(gè)(34.1%)基因富集，有353個(gè)基因(30.5%)富集于離子結(jié)合。在生物過程類別中，有314個(gè)基因(27.1%)富集在有機(jī)物代謝過程，287個(gè)(24.8%)基因存在于初級(jí)代謝過程，259個(gè)(22.4%)基因富集在細(xì)胞代謝過程。以上結(jié)果表明，和ST–8的差異表達(dá)基因在代謝過程中發(fā)揮著重要作用，推測(cè)其可能是造成與ST–8莖顏色差異的原因之一。

為了明確差異表達(dá)基因的代謝通路，將差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG通路富集分析。如表3所示，共有780個(gè)差異表達(dá)基因注釋到103條代謝通路中。有166個(gè)差異表達(dá)基因富集在代謝途徑中，占總基因數(shù)的21.28%；107個(gè)(13.72%)差異表達(dá)基因富集于次生代謝物生物合成；少部分差異表達(dá)基因富集在MAPK信號(hào)途徑--–植物、植物--–病原體互作、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、苯丙素生物合成、玉米素生物合成和類黃酮生物合成等途徑中。此外，有5條特異性富集通路(富集度>0.2)，分別為單萜生物合成、油菜素甾醇生物合成、類黃酮生物合成、不飽和脂肪酸的生物合成、倍半萜生物合成和三萜生物合成途徑。推測(cè)和ST–8莖中的差異表達(dá)基因可能與次生代謝物的生物合成過程相關(guān)。

表3　差異表達(dá)基因KEGG通路富集分析結(jié)果

2.4 花青素合成相關(guān)基因的表達(dá)量分析

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果，篩選出與花青素生物合成途徑有關(guān)的結(jié)構(gòu)基因和轉(zhuǎn)錄因子(圖3)，分別為。其中，在ST–8紫莖中，的表達(dá)量均明顯高于綠莖中的表達(dá)量，而的表達(dá)量均低于的，的表達(dá)量無明顯差異。

圖3　參與花青素合成途徑候選基因的表達(dá)量熱圖

2.5 qRT–PCR驗(yàn)證與關(guān)鍵基因的篩選

為了驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果的可靠性，采用qRT–PCR分析ST–8和莖中與花青素合成相關(guān)的基因的相對(duì)表達(dá)量。如圖4所示，花青素合成通路的上游基因(、)在ST–8莖中的表達(dá)量顯著高于的，花青素合成通路中間基因()的表達(dá)量無顯著差異，下游基因()在ST–8莖中的表達(dá)水平顯著高于的。此外，在ST–8莖中轉(zhuǎn)錄因子()的表達(dá)水平也顯著高于突變體。對(duì)比qRT–PCR的分析結(jié)果和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，二者趨勢(shì)基本一致，說明測(cè)序結(jié)果可靠。推測(cè)至少有4個(gè)結(jié)構(gòu)基因()和1個(gè)轉(zhuǎn)錄因子()是影響辣椒莖中花青素生物合成的關(guān)鍵基因。

A　植物花青素生物合成途徑；B　ST–8與gh1莖中花青素通路基因的qRT–PCR分析結(jié)果?！?”“**”“***”分別表示材料間的差異在0.05、0.01、0.001水平具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)論與討論

基于基因測(cè)序技術(shù)的發(fā)展及公布的辣椒基因組序列，辣椒分子育種技術(shù)得到快速發(fā)展[25]。使用EMS作為誘變劑，具有易操作、成本低、專一性強(qiáng)、產(chǎn)生點(diǎn)突變頻率高、染色體畸變頻率低等優(yōu)勢(shì)[26]。YANG等[27]通過EMS誘變構(gòu)建了辣椒突變體庫(kù)，篩選出辣椒矮稈突變體。李月[28]通過EMS誘變獲得辣椒突變?nèi)后w，篩選并培育了穩(wěn)定的抗炭疽病辣椒品種。在辣椒分子育種中，利用EMS誘變創(chuàng)制新種質(zhì)是提高育種效率的有效方法[29]。

顏色是辣椒的一個(gè)重要表型特征，是辨識(shí)辣椒物種類別、成熟度和進(jìn)化特征的重要指標(biāo)[9]。目前關(guān)于辣椒果實(shí)顏色的研究報(bào)道[30–33]較多，而對(duì)莖顏色的研究較少。本研究中，從EMS誘變的ST–8突變體庫(kù)中篩選出了1個(gè)穩(wěn)定遺傳的綠莖辣椒突變體材料，對(duì)突變體的綠莖和野生型的紫莖進(jìn)行花青素含量測(cè)定后發(fā)現(xiàn)，二者的花青素含量具有極顯著差異，突變體的莖中幾乎不含花青素，說明野生型的莖所呈現(xiàn)的紫色與花青素的合成與積累有關(guān)。為了探究影響辣椒莖中花青素生物合成的關(guān)鍵基因，采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)和qRT–PCR技術(shù)對(duì)突變體和野生型的莖進(jìn)行差異表達(dá)基因分析。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果顯示，在野生型紫莖中的表達(dá)水平均顯著高于突變體的，的表達(dá)水平均低于突變體的，而的表達(dá)水平二者之間無明顯差異。為驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的可靠性，進(jìn)一步對(duì)ST–8和莖中與花青素合成相關(guān)的基因進(jìn)行qRT–PCR分析，結(jié)果表明，在野生型莖中和的表達(dá)量均顯著高于突變體，分析結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果基本一致。推測(cè)至少有4個(gè)結(jié)構(gòu)基因()和1個(gè)轉(zhuǎn)錄因子()參與調(diào)控辣椒莖中花青素的生物合成。植物花青素的代謝調(diào)控機(jī)制復(fù)雜，其結(jié)構(gòu)基因與轉(zhuǎn)錄因子形成了一個(gè)龐大的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，且花青素的合成與積累易受環(huán)境因素的影響，本研究篩選出的影響辣椒莖中花青素合成的關(guān)鍵基因，還需進(jìn)一步研究，以驗(yàn)證其功能。

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[31] 霍瑞春．不同辣椒品質(zhì)檢測(cè)及辣椒紅素合成相關(guān)基因、表達(dá)分析[D]．包頭：內(nèi)蒙古科技大學(xué)，2022．

[32] 馮鵬龍．辣椒不同果色類胡蘿卜素相關(guān)基因的克隆及調(diào)控機(jī)理研究[D]．西寧：青海大學(xué)，2022．

[33] 周燕．辣椒果實(shí)紫色性狀的光響應(yīng)及遺傳研究[D]．?？冢汉Ｄ洗髮W(xué)，2021．

Transcriptome and differential expression analysis of green stem mutantin

DAI Yao1,2,3，WANG Jin1,2,3，DAI Li1,2,3，HE Changzheng1,2,3，LIU Feng1,2,3*

(1.College of Horticulture, Hunan Agricultural University, Changsha, Hunan 410128, China; 2.ERC for Germplasm Innovation and New Variety Breeding of Horticultural Crops, Changsha, Hunan 410128, China; 3.Key Laboratory for Vegetable Biology of Hunan Province, Changsha, Hunan 410128, China)

EMS-induced pepper green stem mutantand wild-type purple stem ‘Zhangshugang’ (ST-8) were used as materials in this study, and the anthocyanin content was determined. Transcriptome sequencing (RNA-seq) and real-time fluorescence quantitative PCR (qRT-PCR) were used to analyze the gene expression levels related to anthocyanin biosynthesis in pepper stems. The results showed that the anthocyanin content in the stem of mutantwas significantly lower than that in the stem of ST-8. Compared with ST-8,obtained 1794 differentially expressed genes, including 1003 up-regulated genes and 791 down-regulated genes. Among them, genes related to anthocyanin biosynthesis pathway include 9 structural genes (,,,,,,,,and 3 transcription factors (,,). Transcriptome expression analysis and qRT-PCR analysis were performed on differentially expressed genes related to anthocyanin synthesis. The results of the two analyses were basically the same. Four structural genes (,,,) and one transcription factor (were screened. It is speculated that these five genes might play an important role in the anthocyanin biosynthesis pathway in pepper stems.

pepper; stem; transcriptome; differentially expressed genes; anthocyanins; mutant

S641.3；Q786

A

1007–1032(2023)05–0567–08

戴垚，王瑾，戴麗，何長(zhǎng)征，劉峰．辣椒綠莖突變體轉(zhuǎn)錄組及候選基因表達(dá)分析[J]．湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2023，49(5)：567–574．

DAI Y，WANG J，DAI L，HE C Z，LIU F．Transcriptome and differential expression analysis of green stem mutantin[J]．Journal of Hunan Agricultural University (Natural Sciences), 2023, 49(5)：567–574．

http://xb.hunau.edu.cn

2023–02–23

2023–10–09

岳麓山種業(yè)創(chuàng)新項(xiàng)目(2021NK1006)；特色蔬菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS–24–A–15)

戴垚(1999—)，女，湖南邵陽人，碩士研究生，主要從事辣椒分子遺傳育種研究，3501510879@qq.com；*通信作者，劉峰，博士，研究員，主要從事辣椒種質(zhì)資源重要性狀功能基因挖掘及新種質(zhì)創(chuàng)制研究，liufengrich@126.com

10.13331/j.cnki.jhau.2023.05.010

責(zé)任編輯：毛友純

英文編輯：柳正