孫以康，李美帥，陳四清，邊力，劉永勝，常青

（1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國家實(shí)驗(yàn)室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266071；3.煙臺市海洋經(jīng)濟(jì)研究院，山東 煙臺 264006）

中華蛸（Octopus sinensis）[1-3]俗稱“八爪魚”、“章魚”、“母豬章”和“紅章”等，主要分布于溫帶、亞熱帶和熱帶海域，是我國南方重要經(jīng)濟(jì)物種[4～6]。中華蛸肉細(xì)味美，蛋白質(zhì)含量高，可生食也可制成干品，有補(bǔ)血益氣、收斂生肌的藥用價(jià)值，作為海味和滋補(bǔ)品深受人們喜愛，在日本、韓國有更大市場，是重要的出口產(chǎn)品[7-10]。近幾年，大量捕撈及生態(tài)環(huán)境的不斷惡化，中華蛸資源量衰減，不能滿足市場需求[11,12]。但中華蛸生長周期短、生長速度快、食物轉(zhuǎn)化率高和產(chǎn)卵量大，極具養(yǎng)殖潛力[13,14]。目前，中國、日本等國家已開始中華蛸人工養(yǎng)殖技術(shù)的研究。

蛸類產(chǎn)卵后雌蛸守護(hù)卵群，用漏斗不斷給卵群噴水，清理卵群表面雜物，確保卵群有充足的氧氣，護(hù)卵期間雌蛸幾乎不離開卵群，攝食量極少，往往因消耗過大等原因而死亡[15,16]。中華蛸繁育時(shí)，個(gè)別親蛸經(jīng)常在護(hù)卵期間意外死亡或離開孵化巢，失去親體看護(hù)的受精卵孵化率極低，大多會出現(xiàn)腐敗死亡。有研究表明，在無親蛸看護(hù)下受精卵發(fā)育10 d左右便會滋生霉菌和原生動物停止發(fā)育[17,18]。中華蛸受精卵在無親體看護(hù)下，發(fā)育到何期可以孵出幼體，目前尚沒有研究報(bào)道。若可以實(shí)現(xiàn)中華蛸受精卵的全人工孵化，便可以通過運(yùn)輸受精卵串的方式代替親蛸運(yùn)輸，降低運(yùn)輸成本，有利于中華蛸養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的擴(kuò)大；中華蛸親體在產(chǎn)卵后有衰老現(xiàn)象，并且在護(hù)卵期間攝食量極少，親體完成護(hù)卵后的體重較產(chǎn)卵前明顯變輕，肉質(zhì)明顯變差，若能實(shí)現(xiàn)中華蛸受精卵全人工孵化，可以將中華蛸親體及時(shí)賣出而降低養(yǎng)殖成本。

本實(shí)驗(yàn)觀察了中華蛸受精卵發(fā)育狀態(tài)，在受精卵不同發(fā)育時(shí)期從孵化巢取出，進(jìn)行人工孵化，研究中華蛸受精卵人工孵化與中華蛸親體護(hù)卵孵化的差異，尋找中華蛸受精卵可進(jìn)行人工孵化的最佳發(fā)育時(shí)期，可為中華蛸受精卵人工孵化技術(shù)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 親體采捕及培育

實(shí)驗(yàn)所用中華蛸親體捕自福建連江海域，體質(zhì)量為0.68～1.74 kg，運(yùn)至煙臺天源水產(chǎn)有限公司牟平實(shí)驗(yàn)基地，放入水泥池（6 m×2 m×1.5 m）中培育。培育池中放置蛸巢（圖1），蛸巢間距在50 cm 以上。所用海水是經(jīng)砂濾池過濾的自然海水，鹽度29～32，水溫21 ℃～25 ℃，日換水量150%～200%。

圖1 蛸巢Fig.1 The nest of O.sinensis

每日下午投喂菲律賓蛤仔（Ruditapes philippinarum）、櫛孔扇貝（Chlamys farreri）、凍蝦、日本蛤（Charybdis japonica）等，第二天上午清理殘餌。培育第一天親體便有交配現(xiàn)象（圖2），經(jīng)過50 d 培育親體自然產(chǎn)卵。

圖2 中華蛸交配Fig.2 O.sinensis mating

1.2 卵串處置方法對孵化率影響試驗(yàn)

中華蛸受精卵分次成熟，分批產(chǎn)出，卵串在孵化巢中如同麥穗緊密排列（圖3-a、圖3-b），卵粒半透明形如米粒[19]（圖3-c）。選取四只同一天產(chǎn)卵的親蛸，每天觀察卵串的產(chǎn)出情況，在相應(yīng)位置做好標(biāo)記，受精卵經(jīng)親體看護(hù)孵化24 d 左右幼蛸破膜而出。通過觀察胚胎發(fā)育狀態(tài)，將特定時(shí)期的受精卵從蛸巢取出，放入篩盆人工孵化。篩盆固定于網(wǎng)筐上（圖4），周圍放置1～2 個(gè)氣石。篩盆網(wǎng)眼小于幼蛸，上沿稍高出水面，以防初孵幼蛸逃逸。孵化期間水溫22.8 ℃～26.4 ℃，鹽度29～32，日換水量180%～250%。

圖3 中華蛸受精卵串Fig.3 A cluster of O.sinensis fertilized eggs

圖4 實(shí)驗(yàn)裝置Fig.4 Experimental device

根據(jù)中華蛸受精卵發(fā)育天數(shù)以及關(guān)鍵結(jié)構(gòu)（色素斑、吸盤、眼點(diǎn)等）的發(fā)育程度，將受精卵分為A、B、C、D、E、F、G、H 8 個(gè)時(shí)期[20]，每個(gè)時(shí)期所取受精卵分為四組。對照組為卵串間隔3～4 cm 放置于篩盆；組1 為卵串間隔3～4 cm 放置于篩盆，每天用洗瓶吹洗卵串，每次間隔1 h；組2 為卵串緊密疊放置于篩盆；組3 為卵串緊密疊放置于篩盆，每天用洗瓶吹洗卵串，每次間隔1 h。受精卵孵化成功后，統(tǒng)計(jì)孵出和未孵出幼蛸的數(shù)量，計(jì)算孵化率。

1.3 由親蛸護(hù)卵和沒有親蛸護(hù)卵孵出的幼蛸7 日成活率比較

選取對照組F、G 和H 期孵出的幼蛸和組1 在F、G 和H 期孵化的幼蛸以及由親蛸護(hù)卵孵化的幼蛸各100 只，置于20 L 的水桶中，每組設(shè)三個(gè)平行。以鹵蟲無節(jié)幼體為幼蛸的開口餌料[21,22]，在轉(zhuǎn)移至水桶后的0 h、24 h、48 h 投喂相同重量的鹵蟲并吸底換水，日換水量為20%，每天及時(shí)吸出死亡幼蛸。

按下式計(jì)算孵化率和成活率：

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（means±SD）表示，用Excel 2019 和SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)及單因素分析，以P<0.05 為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同時(shí)期受精卵的發(fā)育狀態(tài)

在蛸巢中不同發(fā)育期的受精卵串的發(fā)育狀態(tài)如圖5 和圖6 所示。水溫22.8～26.4 ℃時(shí)，A 時(shí)期為發(fā)育1 d 的呈半透明狀受精卵，外層具有膠質(zhì)保護(hù)膜，無特殊分化的結(jié)構(gòu)（圖5-a）；B 時(shí)期為發(fā)育8 d的受精卵，已分化發(fā)育出眼、腕、漏斗等胚胎原基（圖5-b）；C 時(shí)期為發(fā)育11 d 的受精卵，胚胎眼點(diǎn)呈紅色，此時(shí)的卵串每個(gè)受精卵上均有紅色眼點(diǎn)（圖5-c、圖6-a）；D 時(shí)期為發(fā)育14 d 的受精卵，胚胎眼點(diǎn)由紅色轉(zhuǎn)為紫黑色，腕足已清晰可見（圖5-d、圖6-b）；E 時(shí)期為發(fā)育16 d 的受精卵，胚胎身體上開始出現(xiàn)5～8 個(gè)色素斑，色素斑呈淺紅色，腕足上的吸盤清晰可見（圖5-e、圖6-c）；F 時(shí)期為發(fā)育18 d 的受精卵，胚胎身體上淺紅色素斑增至10～18 個(gè)（圖5-f、圖6-d）；G 時(shí)期為發(fā)育20 d 的受精卵，身體上的色素斑進(jìn)一步增加至20～24 個(gè)，其中胴體背部上的色素斑顏色變深呈暗紅色，卵串整體呈灰色（圖5-g、圖6-e、圖7-a）；H 時(shí)期為發(fā)育23 d 的受精卵，卵串呈灰褐色，由于臨近自然孵化日期，此時(shí)將卵串取出胚胎會因外界環(huán)境刺激提前1 d 孵化。孵出的幼蛸腕部吸附有尚未吸收完全的卵黃（圖5-h、圖7-b）。

圖5 中華蛸發(fā)育狀態(tài)Fig.5 The developmental diagram of fertilized eggs in O.sinensis

圖6 中華蛸受精卵串Fig.6 The developmental diagram of fertilized egg cluster in O.sinensis

2.2 不同發(fā)育時(shí)期從蛸巢中取出對孵化率的影響

將發(fā)育至A、B 時(shí)期的受精卵從蛸巢中取出人工孵化時(shí)，無論哪種方式都無法孵出幼體，發(fā)育7 d左右便停止發(fā)育，此受精卵較正常受精卵輕微膨大，表面呈淺紅色，卵黃渾濁變白。發(fā)育至C 時(shí)期時(shí)將其和親蛸分離進(jìn)行人工孵化，僅有卵串分散放置時(shí)（對照組、組1）有幼體孵出，孵化率極低。選取C、D、E 時(shí)期的受精卵進(jìn)行人工孵化時(shí)，雖可以少量的孵化出幼蛸，但孵化出幼蛸的受精卵多數(shù)位于卵串上卵粒相對稀疏的位置，且未孵化的受精卵渾濁發(fā)灰沒有光澤（表1）。

表1 受精卵孵化率（%）Tab.1 Hatching rate of fertilized egg（%）

受精卵發(fā)育到F、G 時(shí)期時(shí)開始人工孵化，孵化率明顯升高，H 時(shí)期時(shí)孵化率可達(dá)99%。當(dāng)受精卵發(fā)育至F、G 時(shí)期時(shí)，卵串中央以及卵串兩端的受精卵均可孵化成功，未孵化成功的受精卵卵黃變白，卵粒發(fā)灰失去光澤，在解剖鏡下觀察時(shí)，胚胎不蠕動。H 時(shí)期的受精卵串取出放入篩盆后便有幼蛸孵化，2 h 后卵串上的受精卵只有少數(shù)孵化失敗。

在人工孵化過程中，排列稀疏的卵串孵化率明顯高于排列緊密的卵串，且隨著受精卵臨近孵出日期，吹洗卵串對孵化率的影響逐漸減（表1、圖8）。

圖8 不同條件下受精卵孵化率與發(fā)育時(shí)期的關(guān)系Fig.8 The relationship between hatching rate and developmental period of fertilized eggs under different conditions

2.3 幼蛸7 日成活率比較

人工孵化和自然孵化的F、G 時(shí)期受精卵所得幼蛸7 日成活率無顯著差異（P>0.05）。由H 時(shí)期受精卵人工孵化所得幼蛸7 日成活率顯著低于自然孵化幼蛸和F、G 時(shí)期受精卵所孵化的幼蛸，其平均7 日存活率僅為11.7%（P<0.05）（表2）。因此，當(dāng)受精卵發(fā)育至G 時(shí)期時(shí)取出人工孵化可得到較好的孵化效果。實(shí)驗(yàn)過程中，F(xiàn)、G 時(shí)期受精卵所孵出的幼蛸以及自然孵出的幼蛸大多聚集在水體表面，只有少數(shù)位于水體的中下層，而H 時(shí)期提前1 d 孵化的幼蛸，大多聚集的水體中下層。此現(xiàn)象也表明，H時(shí)期提前孵化的幼蛸活力較差。

表2 幼蛸7 日成活率（%）Tab.2 Survival rate of 7 day old O.sinensis（%）

3 討論

3.1 不同發(fā)育時(shí)期脫離親體對孵化率的影響

波紋龍蝦（Panulirus homarus）、日本米蝦（Caridina japonica）和中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）的胚胎離體孵化時(shí)，在任何發(fā)育時(shí)期均能孵化出健康的幼體，且隨著臨近出膜期，胚胎的孵化率逐漸升高[23-25]。中華蛸受精卵脫離親體進(jìn)行人工孵化時(shí)，發(fā)育前期的受精卵無法孵出幼體，當(dāng)卵串排列稀疏時(shí)，從黑珠期開始，受精卵也具有隨著臨近出膜期孵化率逐漸升高的趨勢。

將中華蛸不同發(fā)育時(shí)期受精卵串取出人工孵化時(shí)，A、B 時(shí)期的受精卵發(fā)育7 d 左右卵黃渾濁變白，內(nèi)部有絲狀結(jié)構(gòu)，停止發(fā)育，推測受精卵可能是被霉菌或者其它原生動物寄生，具體是何種生物還有待于進(jìn)一步探究。當(dāng)受精卵發(fā)育至G 時(shí)期取出時(shí)，胚胎已基本發(fā)育成型，在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，胚胎有時(shí)會輕微扭動，卵黃也已較小，推測此時(shí)對于霉菌或其他寄生者來說，由于幼蛸免疫力增強(qiáng)、受精卵內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)減少、胚胎臨近孵出時(shí)間沒有充足的寄生時(shí)間等原因不再利于寄生。當(dāng)受精卵發(fā)育至H 時(shí)期時(shí)已非常臨近自然孵出日期，將蛸巢提出水面取受精卵時(shí)，因?yàn)闈B透環(huán)境變化劇烈，胚胎在卵膜內(nèi)劇烈蠕動，提前1 d 破膜而出，因此H 時(shí)期孵化率高但成活率低。

3.2 卵串的疏密程度和吹卵對孵化率的影響

中華蛸親體在護(hù)卵期間會不斷用漏斗給卵群噴水，并時(shí)常用腕足撥弄卵群，這樣能清理受精卵上所粘附的雜物，使卵群有充足的氧氣。受精卵串排列緊密組的孵化率均低于卵串排列稀疏組，在相同疏密程度下吹洗卵串也可提高孵化率，這表明在人工孵化時(shí)，將卵串間隔開保持充足的溶氧是確保孵化成功的關(guān)鍵。在擬目烏賊（Sepia lycidas）的人工孵化過程中孵化率也會隨著孵化密度的升高而降低，且在相同密度下充氣與否會顯著影響孵化率[26]。

通過對照組、組1 和組3 的對比表明，隨著受精卵臨近孵出，吹洗卵串對孵化率的影響逐漸減小，推測這可能和霉菌、原生動物等沒有充足的寄生時(shí)間有關(guān)，因此在生產(chǎn)實(shí)踐過程中，只需保證卵串排列相對稀疏便可得到較高的孵化率。

3.3 剛出膜幼蛸7 日成活率的比較

幼蛸出膜后腕部會包裹有尚未吸收完全的外卵黃囊，經(jīng)6～12 h 外卵黃囊被完全吸收，但被覆在消化腺周圍的內(nèi)卵黃囊需2～3 d 才會被消化吸收完全[27]。在幼蛸7 日成活率實(shí)驗(yàn)中，第3 d 時(shí)每個(gè)實(shí)驗(yàn)組的幼蛸成活率均有明顯下降，推測和內(nèi)卵黃囊消化吸收完全，能量供給不足有關(guān)。H 時(shí)期所孵幼蛸較正常孵化幼蛸提前1 d 孵出，其7 日成活率顯著低于自然孵化的幼蛸以及F、G 時(shí)期孵化的幼蛸，推測其原因是由早產(chǎn)所導(dǎo)致。