歐陽(yáng)桂,郭會(huì)朵,劉明珠,2,錢荷英,2*

(1.江蘇科技大學(xué) 生物技術(shù)學(xué)院,江蘇 鎮(zhèn)江 212100;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蠶業(yè)研究所,江蘇 鎮(zhèn)江 212018)

0 引言

【研究意義】中國(guó)作為蠶桑絲綢文化的發(fā)祥地,迄今已有超過(guò)5 000年的栽桑養(yǎng)蠶歷史[1]。從《孟子.梁惠王上》記載的“五畝之宅,樹(shù)之以桑,五十者可以衣帛矣”,到“家有五畝桑,脫貧奔小康”等,蠶桑產(chǎn)業(yè)一直是我國(guó)傳統(tǒng)優(yōu)勢(shì)特色產(chǎn)業(yè),為我國(guó)經(jīng)濟(jì)發(fā)展做出了重要貢獻(xiàn)。農(nóng)以種為先,經(jīng)過(guò)數(shù)千年的馴化和人工選擇,家蠶逐漸形成了各具特色的四大地理系統(tǒng),進(jìn)化成豐富多樣的種質(zhì)資源。這些種質(zhì)資源是家蠶遺傳學(xué)研究的珍貴素材,為新品種培育提供了重要的物質(zhì)基礎(chǔ)。因此,做好蠶種質(zhì)資源的收集和保存對(duì)家蠶遺傳學(xué)研究和新品種培育均具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】蠶種質(zhì)資源有其特殊性,不能像植物種子一樣進(jìn)行低溫或干燥的長(zhǎng)期保存,也不能像動(dòng)物一樣進(jìn)行精液、卵或胚胎的冷凍保存,只能每年進(jìn)行活體飼養(yǎng)繼代保存[2-3]。目前,國(guó)內(nèi)常規(guī)一化或者二化品種一般采取單式冷藏法[4],在春季飼養(yǎng)、產(chǎn)卵,然后經(jīng)過(guò)夏秋季的蠶種保護(hù),到冬季浴消后置于冷庫(kù)保存;次年春季出庫(kù)飼養(yǎng),繼代保存。單式冷藏法操作簡(jiǎn)便,冷藏有效期不能超過(guò)90 d,基本能滿足常規(guī)越年種春制春用的要求,為生產(chǎn)上常用方法[5]。復(fù)式冷藏法和三級(jí)冷藏法流程較繁瑣,但冷藏有效期可達(dá)200 d,孵化率在90%以上[5-9]。在生產(chǎn)上常因桑葉不夠、人力或物力緊張,以致春天不能及時(shí)出庫(kù)飼養(yǎng),需要將春制春用、秋制春用的蠶種冷藏至夏秋季再飼養(yǎng);此外,春蠶飼養(yǎng)期間各種病毒害帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)或意外情況,需要有備用的蠶種留在冷庫(kù),以備不時(shí)之需[10]?！狙芯壳腥朦c(diǎn)】常規(guī)方法保種時(shí),如果春季不出庫(kù),隨著時(shí)間的延長(zhǎng),蠶種的孵化率會(huì)急劇降低,甚至不孵化,導(dǎo)致該資源滅絕,了解蠶種的耐冷藏能力尤為重要?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】選擇2020年春制種370個(gè),常規(guī)冷藏至2021年6月22日出庫(kù)催青,探明家蠶春制越年種延期冷藏的孵化率,以期為蠶種過(guò)剩時(shí)合理制定家蠶的保種及飼養(yǎng)方案提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

370個(gè)不同家蠶品種,均為中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院家蠶種質(zhì)資源保存中心保存的2020年春制春用種,按不同地理系統(tǒng)及不同的化性、眠性等性狀將其分為7個(gè)類別,包括20個(gè)中系一化三眠種、15個(gè)日系一化四眠種、50個(gè)歐系一化四眠種、49個(gè)一化地方四眠種、38個(gè)二化地方四眠種、100個(gè)中系二化四眠種和98個(gè)日系二化四眠種(表1)。

1.2 方法

1.2.1 孵化率 蠶種單式冷藏法[11]冷藏至2021年6月22日出庫(kù)催青,于7月4日調(diào)查孵化率。每品種調(diào)查7蛾圈(28蛾框制種隨機(jī)抽取1列),掃除孵化蟻蠶,數(shù)每個(gè)卵圈的總良卵數(shù)和孵化的卵殼數(shù),計(jì)算孵化率。

孵化率=孵化的卵殼數(shù)/總良卵數(shù)×100%。

1.2.2 不同孵化率級(jí)別的分布頻率 將孵化率的觀測(cè)值劃分為 10個(gè)(Ⅰ～Ⅹ)等級(jí),每個(gè)級(jí)差為10.00%,以此計(jì)算不同地理系統(tǒng)的蠶卵在不同孵化率級(jí)別的分布頻率(pi)。孵化率觀測(cè)值的10個(gè)等級(jí)劃分標(biāo)準(zhǔn):Ⅰ級(jí),孵化率<10.00%;Ⅱ級(jí),孵化率為10.01%～20.00%;Ⅲ級(jí),孵化率為20.01%～30.00%;Ⅳ級(jí),孵化率為30.01%～40.00%;Ⅴ級(jí),孵化率為40.01%～50.00%;Ⅵ級(jí),孵化率為50.01%～60.00%;Ⅶ級(jí),孵化率為60.01%～70.00%;Ⅷ級(jí),孵化率為70.01%～80.00%;Ⅸ級(jí),孵化率為80.01%～90.00%;Ⅹ級(jí),孵化率為90.01%～100.0%。

表1 370個(gè)家蠶種質(zhì)資源的基本信息Table 1 Basic information of 370 silkworm germplasm resources

續(xù)表1

pi=ni/n

式中,pi表示孵化率處于第i個(gè)等級(jí)的分布頻率,ni表示第i個(gè)等級(jí)所含品種數(shù)量,n表示品種總數(shù)量[12]。

1.2.3 延期冷藏后蠶種的實(shí)用價(jià)值 一般認(rèn)為,延期冷藏后總孵化率低于10%的蠶種基本已無(wú)實(shí)用價(jià)值,低于30%的則為保種較難成功[4,12]。故又將孵化率劃分為無(wú)實(shí)用價(jià)值(<10.00%)、保種價(jià)值低(10.00%～30.00%)、保種價(jià)值高(>30.00%)3個(gè)級(jí)別,根據(jù)p無(wú)實(shí)用價(jià)值=∑pi(i=1)、p保種價(jià)值低=∑pi(i=2,3)和p保種價(jià)值高=∑pi(i=4,5,6,7,8,9,10)分別計(jì)算7個(gè)類別蠶種無(wú)實(shí)用價(jià)值、保種價(jià)值低和保種價(jià)值高的蠶種分布頻率,繪制7個(gè)類別蠶種的實(shí)用價(jià)值孵化率頻率分布圖,用以分析各類蠶種延期冷藏至6月下旬的實(shí)用價(jià)值。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Excel 2019和SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析總孵化率的平均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差及變異系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 370份不同類別蠶種各孵化率等級(jí)的孵化率及蠶種數(shù)

從表2可知,370份蠶種最高孵化率為88.00%,最低孵化率為0,平均孵化率僅30.30%。其中,孵化率等級(jí)除Ⅹ級(jí)的品種數(shù)為0外,在其余9個(gè)等級(jí)中,Ⅰ級(jí)的品種數(shù)最多,為100個(gè)品種,占總數(shù)的27.03%;Ⅱ級(jí)和Ⅵ級(jí)其次,均為54個(gè)品種,各占總數(shù)的14.60%;Ⅶ級(jí)最少,為8個(gè)品種,占總數(shù)的2.16%。孵化率大于60%的品種僅有28個(gè),占總數(shù)的7.57%。從品種類別看,370份蠶種可分為中系一化種、日系一化種、歐系一化種、地方一化種、地方二化種、中系二化種和日系二化種7個(gè)類別,其品種數(shù)分別20個(gè)、15個(gè)、50個(gè)、49個(gè)、38個(gè)、100個(gè)和98個(gè),各類別的平均孵化率依次為歐系一化種(45.03%)>中系二化種(29.07%)>地方一化種(28.71%)>日系二化種(28.38%)>地方二化種(26.03%)>中系一化種(25.61%)>日系一化種(24.10%);變異系數(shù)依次為歐系一化種(61.16%)<日系二化種(73.23%)<地方一化種(75.04%)<中系二化種(77.21%)<日系一化種(85.08%)<中系一化種(88.06%)<地方二化種(89.33%)。

表2 370份不同類別蠶種各孵化率等級(jí)的孵化率及蠶種數(shù)Table 2 Hatching rate and silkworm egg number of 370 silkworm germplasm resources with different geosystem at different grades of hatching rate

2.2 不同地理系統(tǒng)蠶種各孵化率等級(jí)的分布

2.2.1 中系一化三眠蠶 從圖1看出,中系一化三眠蠶有20個(gè)品種,平均孵化率為25.61%,在10個(gè)孵化率等級(jí)中,除Ⅶ級(jí)、Ⅷ級(jí)和Ⅹ級(jí) 3個(gè)等級(jí)無(wú)蠶種分布外,其余7個(gè)孵化率等級(jí)均有蠶種分布。在有蠶種分布的7個(gè)等級(jí)中,孵化率Ⅰ級(jí)品種最多,有7個(gè),占總數(shù)的35.00%;Ⅳ級(jí)的品種其次,有4個(gè),占總數(shù)的20.00%;Ⅲ級(jí)、Ⅵ級(jí)和Ⅸ級(jí)的品種最少,均僅有1個(gè),各占總數(shù)的5.00%。其中,孵化率為Ⅸ級(jí)的1個(gè)品種為修水二號(hào),其孵化率達(dá)88.00%。中系一化三眠蠶延期冷藏后整體孵化率下降嚴(yán)重,說(shuō)明其蠶卵耐冷藏能力有限,若將春制種保存至夏季使用的風(fēng)險(xiǎn)極大,必須采取復(fù)式冷藏方法。

圖1 中系一化三眠蠶各孵化率等級(jí)的分布Fig.1 Distribution of Chinese univoltine trimolter at different grades of hatching rate

2.2.2 日系一化蠶 從圖2可知,日系一化種有15個(gè)品種,平均孵化率為24.10%,在10個(gè)孵化率等級(jí)中,孵化率Ⅰ～Ⅵ級(jí)6個(gè)等級(jí)均有蠶種分布。在有蠶種分布的6個(gè)等級(jí)中,孵化率Ⅰ級(jí)的品種最多,有5個(gè),占總數(shù)的33.33%;Ⅲ級(jí)的品種其次,有4個(gè),占總數(shù)的26.67%;Ⅱ級(jí)和Ⅳ級(jí)的品種最少,均僅有1個(gè),各占總數(shù)的6.67%?？傮w看,延期冷藏后日系一化種整體孵化率低,孵化率的變異系數(shù)較高。

圖2 日系一化蠶各孵化率等級(jí)的分布Fig.2 Distribution of Japanese univoltine silkworm at different grades of hatching rate

2.2.3 歐系一化種 從圖3看出,歐系一化種有50個(gè)品種,平均孵化率為45.03%,在10個(gè)孵化率等級(jí)中,僅Ⅹ級(jí)無(wú)蠶種分布,其余9個(gè)等級(jí)均有蠶種分布。在有蠶種分布的9個(gè)等級(jí)中,Ⅵ級(jí)和Ⅸ級(jí)的品種最多,均有8個(gè),分別占總數(shù)的16.00%;Ⅱ級(jí)和Ⅴ級(jí)的品種其次,均為6個(gè),各占總數(shù)的12.00%;Ⅶ級(jí)的品種最少,僅有2個(gè),占總數(shù)的4.00%。總體看,歐系一化種孵化率在60.00%以上品種最多(15個(gè))和孵化率分布等級(jí)最廣(9個(gè))。

圖3 歐系一化種各孵化率等級(jí)的分布 Fig.3 Distribution of European univoltine variety at different grades of hatching rate

2.2.4 地方種一化 從圖4可知,地方種一化有49個(gè)品種,平均孵化率為28.71%,在10個(gè)孵化率等級(jí)中,Ⅰ～Ⅵ級(jí)6個(gè)等級(jí)均有蠶種分布,其中,Ⅶ級(jí)的品種最多,有14個(gè),占總數(shù)的28.57%;Ⅰ級(jí)的品種其次,有13個(gè),占總數(shù)的26.53%;Ⅲ級(jí)的品種最少,僅有3個(gè),占總數(shù)的6.12%。

圖4 一化性地方品種各孵化率等級(jí)的分布Fig.4 Distribution of local univoltine variety at different grades of hatching rate

2.2.5 地方種二化 從圖5可知,地方種二化有38個(gè)品種,平均孵化率為26.03%,在10個(gè)孵化率等級(jí)中,Ⅰ～Ⅱ級(jí)和Ⅳ～Ⅶ級(jí)均有蠶種分布,其余5個(gè)等級(jí)無(wú)蠶種分布。在有蠶種分布的5個(gè)等級(jí)中,Ⅰ級(jí)的品種最多,有15個(gè),占總數(shù)的39.47%;Ⅵ級(jí)的品種其次,有11個(gè),占總數(shù)的28.95%;Ⅳ級(jí)的品種最少,僅3個(gè),占總數(shù)的7.89%?？梢?jiàn),二化性地方品種的孵化率變異系數(shù)最大,為89.33%,且二化性地方品種與一化性地方品種的孵化率分布狀況相似,顯示出地方種種間差異大,遺傳多樣性豐富。

圖5 二化性地方品種各孵化率等級(jí)的分布 Fig.5 Distribution of local bivoltine variety at different grades of hatching rate

2.2.6 中系二化育成種 從圖6可知,中系二化育成種有100個(gè)品種,其總體平均孵化率為29.07%,在10個(gè)孵化率等級(jí)中,僅Ⅸ級(jí)和Ⅹ級(jí)2個(gè)等級(jí)無(wú)蠶種分布,其余8個(gè)等級(jí)均有蠶種分布。在有蠶種分布的8個(gè)等級(jí)中,Ⅰ級(jí)的品種最多,有25個(gè),占總數(shù)的25.00%;Ⅱ級(jí)的品種其次,有21個(gè),占總數(shù)的21.00%;Ⅶ級(jí)和Ⅷ級(jí)的品種最少,均為5個(gè),各占總數(shù)的5.00%?？傮w看,中系二化種孵化率等級(jí)從低到高對(duì)應(yīng)的品種分布頻率整體呈下降趨勢(shì)。

圖6 中系二化種各孵化率等級(jí)的分布 Fig.6 Distribution of Chinese bivoltine variety at different grades of hatching rate

2.2.7 日系二化育成種 從圖7看出,中系二化育成種有98個(gè)品種,其總體平均孵化率為28.38%,在10個(gè)孵化率等級(jí)中,僅Ⅷ級(jí)和Ⅹ級(jí) 2個(gè)等級(jí)無(wú)蠶種分布,其余8個(gè)等級(jí)均有蠶種分布。在有蠶種分布的8個(gè)等級(jí)中,Ⅰ級(jí)的品種最多,有30個(gè),占總數(shù)的30.61%;Ⅳ級(jí)的品種其次,有17個(gè),占總數(shù)的17.35%;Ⅶ級(jí)和Ⅸ級(jí)的品種最少,均為1個(gè),各占總數(shù)的1.02%,其中6 100蠶種(T8F)孵化率為88.00%,是所有蠶種中孵化率最高的品種之一。

圖7 日系二化種各孵化率等級(jí)的分布 Fig.7 Distribution of Japanese bivoltine variety at different grades of hatching rate

2.3 延期冷藏后蠶種實(shí)用價(jià)值的分布頻率

從圖8可知,在保種價(jià)值高各類別品種中,歐系一化種為68.00%,日系二化種為48.98%,地方一化種和地方二化種各約為47.00%,中系一化三眠種、中系二化四眠種及日系一化四眠種分別為45.00%、42.00%和33.33%。歐系一化種只有10.00%品種孵化率低于10.00%,表現(xiàn)最好;而其他類別品種孵化率低于10.00%的依次為中系二化種(25.00%)<地方品種一化種(26.53%)<日系二化種(30.61%)<日系一化種(33.33%)<中系一化種(35.00%)<地方品種二化種(39.47%)。雖然地方一化種與地方二化種保種價(jià)值高的品種分布頻率不相上下,但地方品種二化種無(wú)實(shí)用價(jià)值的品種分布頻率較地方品種一化種高很多。說(shuō)明,地方二化種的耐冷藏能力總體上較地方一化種差,但由于其品種分布廣泛,故孵化率較高的品種也較多。

圖8 各類別蠶種實(shí)用價(jià)值的分布頻率 Fig.8 Distribution frequency of practical value of different silkworm categories

2.4 不同眠性和化性蠶種的孵化率

370個(gè)蠶品種按眠性和化性進(jìn)行劃分,共有一化三眠品種20個(gè)、一化四眠品種114個(gè)和二化四眠品種236個(gè)。以化性分類比較,一化種的平均孵化率為33.82%,二化種(二化四眠)為28.30%;經(jīng)t檢驗(yàn)結(jié)果顯示,一化種孵化率顯著高于二化種。以眠性分類比較,四眠蠶的平均孵化率為30.57%,三眠蠶(一化三眠)為25.61%,經(jīng)t檢驗(yàn)結(jié)果顯示,四眠蠶平均孵化率高于三眠蠶,但差異并不顯著。綜合眠性和化性看,延期冷藏后平均孵化率為一化四眠種>二化四眠種>三眠蠶。

3 討論

康秀清[13]研究發(fā)現(xiàn),單式冷藏法延期冷藏100～130 d對(duì)春制春品種良卵孵化率無(wú)影響,而超過(guò)140 d后孵化率較低。吳冬秀等[14]對(duì)中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所357個(gè)品種春制越年種采用復(fù)式冷藏法冷藏至8月下旬后,三眠蠶普通孵化率最高,其次是日本系統(tǒng)二化種、歐洲系統(tǒng)一化種和中國(guó)系統(tǒng)一化種,均超過(guò)40.0%;而日本系統(tǒng)一化種達(dá)32.1%,中國(guó)系統(tǒng)二化種僅18.5%。研究結(jié)果表明,370份蠶種最高孵化率為88.00%,最低孵化率為0,平均孵化率僅30.30%,且超過(guò)1/2的品種孵化率低于30.00%,整體孵化水平低;其中,孵化率<10.00%的品種數(shù)最多,為100個(gè)品種,占總數(shù)的27.03%;孵化率大于60.00%的品種僅有28個(gè),占總數(shù)的7.57%。從品種類別看,370份蠶種可分為中系一化種、日系一化種、歐系一化種、地方一化種、地方二化種、中系二化種和日系二化種7個(gè)類別,其品種數(shù)分別20個(gè)、15個(gè)、50個(gè)、49個(gè)、38個(gè)、100個(gè)和98個(gè),各類別的平均孵化率依次為歐系一化種(45.03%)>中系二化種(29.07%)>地方一化種(28.71%)>日系二化種(28.38%)>地方二化種(26.03%)>中系一化種(25.61%)>日系一化種(24.10%);變異系數(shù)依次為歐系一化種(61.16%)<日系二化種(73.23%)<地方一化種(75.04%)<中系二化種(77.21%)<日系一化種(85.08%)<中系一化種(88.06%)<地方二化種(89.33%)。從實(shí)用價(jià)值看,春制越年種延期冷藏后約有48.38%的品種孵化率>30.00%,可用于保種備用。綜合眠性與化性,春制越年種延期冷藏后平均孵化率依次為一化四眠種>二化四眠種>三眠蠶,與康秀清[13]的研究結(jié)果相近;與吳冬秀等[14]采用復(fù)式冷藏法的研究結(jié)果存在一定差異,原因可能是采用的冷藏法方法或取樣的品種不同所致。另外,在本研究中,歐系一化種延期冷藏后平均孵化率為45.03%,具保種實(shí)用價(jià)值的品種達(dá)68.00%,均遠(yuǎn)大于其他類別。原因可能是該類品種幼蟲(chóng)期長(zhǎng),食桑量多,蠶卵大,卵質(zhì)飽滿,具有良好的耐冷藏能力。而中系一化種和日系一化種種延期冷藏后平均孵化率最低,總體耐冷藏能力表現(xiàn)較差,可能是2類品種的食桑量少,幼蟲(chóng)經(jīng)過(guò)短,卵小有關(guān)。不過(guò)中系一化三眠種1004(修水2號(hào))孵化率達(dá)88.00%,此品種從來(lái)源分類可歸于地方土種。而地方種四眠蠶(一化和二化)孵化率呈兩極分化狀態(tài),處在中間的品種較少;且一化種比二化種耐冷藏能力更強(qiáng),與所有品種整體上一化種比二化種更耐冷藏的結(jié)果相吻合?？梢?jiàn),不論是歐洲還是中國(guó)本土的地方種,這類資源中蘊(yùn)含的遺傳多樣性更豐富,與杜周和等[15]的研究結(jié)果一致。因此,要加強(qiáng)地方種的收集與保護(hù)。此外,雖然中系二化種平均總孵化率比日系二化種高,無(wú)實(shí)用價(jià)值品種的頻率比日系二化種小,但日系二化種變異系數(shù)很大,且保種價(jià)值高的品種頻率比中系二化種多,說(shuō)明,日系二化種有較大的種性挖掘潛力。

4 結(jié)論

不同類別蠶種以歐系一化種的孵化率最高,地方品種的遺傳多樣性較豐富;春制越年種采用單式冷藏法冷藏至6月下旬后整體孵化率會(huì)大幅降低,孵化率大于60.00%的品種僅占總數(shù)的7.57%,蠶種最好在春季使用,單式冷藏的春制越年種不適合延遲至夏季飼養(yǎng)。