田金龍，李俊偉，董宏標(biāo)，曾祥兵，張家松

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院，河北 秦皇島 066000；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)村農(nóng)業(yè)部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510300；3.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所深圳試驗(yàn)基地，廣東 深圳 518121）

食性研究能夠分析動(dòng)物與環(huán)境之間的聯(lián)系，是生態(tài)學(xué)中一項(xiàng)重要的研究?jī)?nèi)容[1]。常規(guī)的動(dòng)物食性研究方法有直接觀察、胃內(nèi)容物分析、食物殘留物分析以及排泄物分析等[2]。這些方法有較大的局限性，如樣品只能夠反映動(dòng)物近期的攝食情況，無(wú)法客觀反映中遠(yuǎn)期的攝食情況以及發(fā)育過(guò)程中食性的轉(zhuǎn)變；短暫而非長(zhǎng)期的攝食對(duì)象影響研究結(jié)果的準(zhǔn)確性[3]；而對(duì)于珍稀和微小物種的研究存在著樣品損傷程度高、研究周期長(zhǎng)、勞動(dòng)強(qiáng)度大和技術(shù)要求高等特點(diǎn)[4]。

水生生態(tài)系統(tǒng)具有復(fù)雜的營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)，傳統(tǒng)水生動(dòng)物食性研究方法效果較差。同位素示蹤技術(shù)將觀察與識(shí)別水平上升至分子層次[5]，廣泛應(yīng)用在地球化學(xué)、農(nóng)業(yè)化學(xué)、環(huán)境化學(xué)等研究領(lǐng)域，是科學(xué)研究的精確手段。國(guó)際原子能機(jī)構(gòu)年報(bào)指出：同位素示蹤技術(shù)的影響廣度可能只有現(xiàn)代電子學(xué)和數(shù)據(jù)處理才能與同位素相比[6]。其具有示蹤與指示等功能，以檢測(cè)快捷、結(jié)果準(zhǔn)確等特點(diǎn)，可以判斷動(dòng)物食物來(lái)源、攝食偏好、棲息地環(huán)境、分布格局以及洄游路線等關(guān)鍵信息[7,8]。面對(duì)水生動(dòng)物復(fù)雜的營(yíng)養(yǎng)級(jí)結(jié)構(gòu)，穩(wěn)定同位素技術(shù)不僅能反映出實(shí)時(shí)的營(yíng)養(yǎng)級(jí)位置與能量流動(dòng)，還可用于研究養(yǎng)殖生物生長(zhǎng)過(guò)程中食性的轉(zhuǎn)換和食物鏈中捕食者與被捕食者的相互關(guān)系。本文介紹了穩(wěn)定同位素技術(shù)原理以及在水生動(dòng)物體內(nèi)的分布、影響因素和食性案例，為穩(wěn)定同位素在水生生物食性研究中的應(yīng)用提供參考。

1 穩(wěn)定同位素技術(shù)的原理

自然界中大多數(shù)元素都存在兩個(gè)或者兩個(gè)以上的同位素，不同同位素之間的細(xì)微化學(xué)差異是由中子的數(shù)量決定[9]。在食物流動(dòng)中，較重的同位素在攝食動(dòng)物中具有累積的傾向，以重同位素形式（13C和15N）保留在組織中，而輕同位素形式（12C 和14N）則被排泄出機(jī)體。這種代謝效應(yīng)導(dǎo)致動(dòng)物消費(fèi)者與生長(zhǎng)者之間的同位素差異，稱為同位素分餾效應(yīng)，導(dǎo)致自然環(huán)境中某一物種在食物網(wǎng)位置越高，其組織中的重同位素就越多[10-13]。因此，同位素差異為穩(wěn)定同位素作為生物標(biāo)志物或者示蹤劑在水生動(dòng)物食性研究中的應(yīng)用提供了條件[14]。目前水生態(tài)系統(tǒng)應(yīng)用較多的同位素是碳（13C/12C）、氮（15N/14N）和硫（34S/32S）[15]。碳穩(wěn)定同位素的分餾程度小，可用于檢測(cè)水生動(dòng)物的攝食種類；氮穩(wěn)定同位素則存在一定程度的同位素分餾，可以檢測(cè)個(gè)體的生長(zhǎng)代謝過(guò)程，或者群體狀態(tài)下食物網(wǎng)的結(jié)構(gòu)和營(yíng)養(yǎng)級(jí)；硫同位素則在微生物的代謝規(guī)律、環(huán)境污染、氣候變化的響應(yīng)中有重要作用。因此，分析動(dòng)物組織的穩(wěn)定同位素可以得出所處特定時(shí)間段的食物來(lái)源、生存環(huán)境、分布特征及洄游路線等關(guān)鍵信息[16]。

一般來(lái)說(shuō)，穩(wěn)定同位素值用符號(hào)δ 來(lái)表示，其定義為：

式中，X 表示所測(cè)定元素，如：C、N、O、H 和S等，R 為元素重同位素和輕同位素的比值，R 標(biāo)準(zhǔn)品為國(guó)際統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)品的同位素比值。

2 影響水生動(dòng)物體內(nèi)穩(wěn)定同位素組成和分布的因素

2.1 食物來(lái)源對(duì)水生動(dòng)物體內(nèi)穩(wěn)定同位素的影響

穩(wěn)定同位素是一種基于生產(chǎn)力的定量方法，不同的食物來(lái)源會(huì)影響動(dòng)物體內(nèi)的同位素組成，可通過(guò)測(cè)定水生動(dòng)物與其攝食物的穩(wěn)定同位素值來(lái)判斷食物來(lái)源、量化食物比例和同化物質(zhì)的速率、探究長(zhǎng)期食性及生命活動(dòng)規(guī)律[17]。水生動(dòng)物組織中碳同位素反映了光合途徑中有機(jī)質(zhì)的來(lái)源，例如C3植物（Calvin 途徑）通過(guò)RUB 羧化酶固定CO2，而C4植物（Hatch-Slack 途徑）以PEP 羧化酶固定CO2。兩種羧化酶的不同途徑，導(dǎo)致13C 在不同植物之間分布差異，C3植物δ13C 值介于-34‰～-25‰，平均值約為-27‰；而C4植物的δ13C 值介于-17‰～-11‰，平均值約為-13‰[18]。因此，在海洋環(huán)境中穩(wěn)定碳同位素比值δ13C 可以顯示底棲和中上層、近岸和近海、淡水和海水?dāng)z食者之間的差異。氮同位素的分餾效應(yīng)使得δ15N 能夠反映水生動(dòng)物機(jī)體營(yíng)養(yǎng)水平，消費(fèi)者的穩(wěn)定氮同位素比值δ15N 在營(yíng)養(yǎng)同化過(guò)程中高于生產(chǎn)者，可以反映出數(shù)周至數(shù)月內(nèi)的攝食行為[19]。通常情況下，用穩(wěn)定同位素混合模型來(lái)估計(jì)同化食物來(lái)源對(duì)動(dòng)物組織的相對(duì)貢獻(xiàn)。早期Saito 等[20]建立同位素質(zhì)量平衡方程，能夠采用一種同位素定量計(jì)算對(duì)兩種食物的來(lái)源。

式中，C 表示測(cè)定的穩(wěn)定同位素種類，δ13Cm為消費(fèi)者同位素比值，δ13Cx、δ13Cy則代表食源x 和y的校準(zhǔn)后的穩(wěn)定同位素比值。

水生動(dòng)物的食源往往多樣化，當(dāng)食源超過(guò)n+1時(shí)，方程組不確定，無(wú)法使用模型。Phillips 和Gregg等[21]改進(jìn)了同位素質(zhì)量平衡方程與編寫了IsoSource應(yīng)用程序，可以在食源數(shù)量超過(guò)n+1 的情況下計(jì)算潛在食源貢獻(xiàn)的頻率和范圍。

式中，f1、f2、f3表示三個(gè)未知的比例食源貢獻(xiàn)，m表示混合物，X、Y 表示測(cè)定的穩(wěn)定同位素種類，δXm和δYm則代表穩(wěn)定同位素種類X 和Y 校準(zhǔn)后的消費(fèi)者穩(wěn)定同位素值。

穩(wěn)定同位素技術(shù)在研究生態(tài)問題時(shí)也有局限性，尤其是當(dāng)某些食源的比例很不穩(wěn)定，特定值的選擇，例如最大值與最小值的選取會(huì)造成結(jié)果難以解釋。貝葉斯模型將概率模型擬合到同位素?cái)?shù)據(jù)中，涵括各種不確定性源、鑒別因子、大于n+1 的源、以及直觀的估計(jì)框架中的分層結(jié)構(gòu)，減少了分析水生生物食源的不精確性[22，23]。貝葉斯混合模型表達(dá)式為：

式中：Xij表示混合食源i 同位素j 的δ 值；Pk表示食物來(lái)源k 的比例；Sjk表示第k 個(gè)食物來(lái)源的第j 種同位素的δ 值，服從均值為m 方差的正態(tài)分布；Cjk表示第k 個(gè)食物來(lái)源的j 同位素的分餾系數(shù)，服從均值為λ 方差為τ 的正態(tài)分布；ε 是殘余誤差，表示其他各個(gè)混合物間無(wú)法量化的方差，其均值和標(biāo)準(zhǔn)差在通常情況下均為0。

2.2 代謝過(guò)程對(duì)穩(wěn)定同位素富集的影響

生物體內(nèi)穩(wěn)定同位素值的變化不僅取決于反應(yīng)物的同位素組成，而且反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的途徑以及物理化學(xué)條件也影響穩(wěn)定同位素的富集。例如機(jī)體營(yíng)養(yǎng)狀況、體型、飲食質(zhì)量、同化效率、排泄形式、蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)率等代謝影響因素[24,25]。由于穩(wěn)定同位素的物理化學(xué)差異而顯得高度規(guī)律，可以跟蹤宏觀化學(xué)反應(yīng)的分子通量來(lái)計(jì)算生物體內(nèi)穩(wěn)定同位素的通量。如分子發(fā)生在合成和分解代謝亞通量分配過(guò)程中的同化、生長(zhǎng)以及轉(zhuǎn)換合成和原子在轉(zhuǎn)化過(guò)程中的重新構(gòu)建。這為研究水生動(dòng)物食性微觀過(guò)程與宏觀現(xiàn)象提供一種新的方法，使得生物體與所處環(huán)境之間的質(zhì)量通道連通（圖1）。

圖1 同位素視角下細(xì)胞產(chǎn)物合成示意圖Fig.1 Schematic diagram of cell product synthesis from isotope perspective

機(jī)體細(xì)胞中一種廣義化合物轉(zhuǎn)化為其他化合物的幾個(gè)步驟不會(huì)改變剩余化合物的同位素組成。如果只有一個(gè)底物參與宏化學(xué)反應(yīng)，則產(chǎn)物具有與底物相同的同位素組成：產(chǎn)物1 在分解代謝途徑中具有與底物1 相同的同位素組成。如果有兩個(gè)及以上的底物參與反應(yīng)，則產(chǎn)物2 的同位素組成取決于底物1 和底物2 的比例（圖1）。

3 穩(wěn)定同位素的應(yīng)用案例

3.1 食物來(lái)源分析

許多水生動(dòng)物生長(zhǎng)過(guò)程中往往會(huì)伴隨著食性的多次轉(zhuǎn)變，尤其是幼魚階段，攝食較為復(fù)雜。研究水生動(dòng)物食性有助于人工飼養(yǎng)馴化和集約化生產(chǎn)，提高生產(chǎn)效率。以胃內(nèi)容物為主的分析方法對(duì)攝食習(xí)性與營(yíng)養(yǎng)級(jí)的鑒定中，雖然對(duì)短期餌料生物的判別與鑒定直觀與精準(zhǔn)，但面對(duì)消化度高的餌料生物以及有機(jī)碎屑多的情況下，不能客觀反映長(zhǎng)期的攝食偏好以及食性轉(zhuǎn)變[26]。穩(wěn)定同位素技術(shù)針對(duì)水生動(dòng)物生長(zhǎng)中的食性轉(zhuǎn)變與能量流動(dòng)，長(zhǎng)期的捕食與被捕食關(guān)系等方面具有一定優(yōu)勢(shì)與便利性。

Wild 等[27]結(jié)合穩(wěn)定同位素分析與貝葉斯混合模型，分析來(lái)自阿拉斯加灣抹香鯨（Physeter macrocephalus）和七種潛在食源的組織樣本。結(jié)果表明，δ13C 和δ15N 分餾系數(shù)分別為（1.28±0.38）‰和（2.82±0.30）‰，法式角鯊（Squalus suckleyi）、鰩（Rajidae spp）和巖魚（Sebastes spp）在抹香鯨食源中的比例依次為35%、28%和12%，為漁民和漁業(yè)管理人員提供了了解重要漁業(yè)物種信息。寧加佳等[28]在研究汕尾紅海灣海域口蝦蛄（Oratosquilla oratoria）餌料中不同生物的食物貢獻(xiàn)比例發(fā)現(xiàn)，口蝦蛄的δ13C值為-18.1‰～-16.3‰，δ15N 值為10.9‰～13.5‰，δ13C 和δ15N 分餾系數(shù)分別為（0.4±1.3）‰和（3.4±1.0）‰，δ13C 和δ15N 值的變化幅度均較大，意味著口蝦蛄的食物來(lái)源較多，其中各食源貢獻(xiàn)占比依次為貝類38.6%、蟹類22.9%、橈足類16.0%和魚類8.9%。為了確定稻-蝦共作養(yǎng)殖模式克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）對(duì)稻田中豐富自然資源的利用效率，李聰?shù)萚29]通過(guò)穩(wěn)定同位素分析了不同蛋白含量的飼料（“碳/ 氮”C/N 分別為8、12和16）對(duì)養(yǎng)殖克氏原螯蝦生長(zhǎng)的貢獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)δ13C 和δ15N 分餾系數(shù)分別為（0.96±0.38）‰和（2.12±0.53）‰，人工投喂的飼料占比分別為38.03%～44.17%、22.13%～25.35%和18.85%～19.40%；據(jù)此而優(yōu)化了投喂策略，既避免了飼料浪費(fèi)與過(guò)量投喂，又提高了克氏原螯蝦對(duì)于稻田天然餌料的利用率，利于實(shí)現(xiàn)對(duì)稻田資源的合理利用。因此，在水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)中運(yùn)用穩(wěn)定同位素技術(shù)分析食性，可以優(yōu)化餌料種類組成，提高餌料利用率，實(shí)現(xiàn)健康高效生產(chǎn)。

3.2 食物網(wǎng)結(jié)構(gòu)和營(yíng)養(yǎng)級(jí)分析

食物網(wǎng)中的能量流動(dòng)與物質(zhì)循環(huán)可以評(píng)估水生動(dòng)物在所處環(huán)境中的適應(yīng)性變化，闡明不同營(yíng)養(yǎng)級(jí)之間的相互聯(lián)系。穩(wěn)定同位素能夠分析有關(guān)原始營(yíng)養(yǎng)來(lái)源的信息，即追蹤從底層生產(chǎn)者到頂級(jí)捕食者的能量流動(dòng)和營(yíng)養(yǎng)循環(huán)，估計(jì)營(yíng)養(yǎng)水平，資源利用和食物來(lái)源，為適應(yīng)性過(guò)程、物種瓶頸、種群動(dòng)態(tài)和保護(hù)優(yōu)先物種提供數(shù)據(jù)支撐[30]。通過(guò)穩(wěn)定同位素構(gòu)建棲息地選擇和利用模型，確定覓食策略和營(yíng)養(yǎng)分流，評(píng)估物種的生存狀況和生態(tài)系統(tǒng)功能，發(fā)現(xiàn)復(fù)雜食物網(wǎng)動(dòng)力學(xué)背后的機(jī)制過(guò)程[31-33]。穩(wěn)定同位素營(yíng)養(yǎng)級(jí)計(jì)算公式為：

式中，TL 表示所測(cè)定水生生物的營(yíng)養(yǎng)級(jí)；δ15Nsample為系統(tǒng)消費(fèi)者氮穩(wěn)定同位素比值；δ15Nbaseline為該系統(tǒng)基線生物的氮穩(wěn)定同位素比值；△δ15N 為1 個(gè)營(yíng)養(yǎng)級(jí)的富集度；a 代表所選取基線生物的營(yíng)養(yǎng)級(jí)。

在水生態(tài)系統(tǒng)中，初級(jí)生產(chǎn)者的碳和氮穩(wěn)定同位素比率隨時(shí)空變化而變化。初級(jí)生產(chǎn)者和初級(jí)消費(fèi)者穩(wěn)定同位素值的變化規(guī)律對(duì)研究食物網(wǎng)至關(guān)重要。郭承秧等[34]研究了雅浦海溝的底棲生物營(yíng)養(yǎng)級(jí)與食物來(lái)源，浮游植物的δ13C 和δ15N 分別為（-22.8±0.4）‰與（5.4±0.4）‰，浮游動(dòng)物的δ13C和δ15N 為（-21.8±0.8）‰和（6.8±0.2）‰，而巨型底棲生物的δ13C 和δ15N 為-20.1‰～-16.8‰和11.9‰～17.9‰，此差異表明巨型底棲生物的初級(jí)食源浮游動(dòng)物與浮游植物等在向下輸送過(guò)程歷經(jīng)食物鏈傳遞和細(xì)菌的降解。而營(yíng)養(yǎng)級(jí)方面則海綿（3.4～4.7）、海參（3.3～3.6）、海蛇尾（3.4～3.5）、海星（3.2～3.7）、鉤蝦（2.9～3.3）、?？?.1），表明了不同物種間食源存在多元化。為了闡明大亞灣珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)的簡(jiǎn)化食物網(wǎng)結(jié)構(gòu)，朱文濤等[35]應(yīng)用穩(wěn)定同位素技術(shù)測(cè)定了大亞灣珊瑚礁區(qū)樣品的δ13C 和δ15N值，發(fā)現(xiàn)食物網(wǎng)δ13C 和δ15N 分別為-23.22‰～-10.76‰、4.32‰～15.82‰；營(yíng)養(yǎng)級(jí)范圍分別為腹足類1.84～2.68、雙殼類1.70～2.49、魚類2.45～3.64，結(jié)果表明藻類與浮游植物等初級(jí)生產(chǎn)者為食物網(wǎng)提供了重要碳源。陸亞楠等[36]采用穩(wěn)定同位素技術(shù)分析了江蘇近海不同季節(jié)的生物類群，結(jié)果表明春季營(yíng)養(yǎng)級(jí)范圍為1.52～4.28，夏季營(yíng)養(yǎng)級(jí)范圍為1.25～3.52，秋季營(yíng)養(yǎng)級(jí)范圍1.34～4.15。春季食源較廣，生物營(yíng)養(yǎng)層次與群落多樣性高；夏季食源更豐富，但生態(tài)位分化程度底；而秋季食物網(wǎng)結(jié)構(gòu)較單一，營(yíng)養(yǎng)生態(tài)位分布較廣。這些穩(wěn)定同位素的應(yīng)用研究為近海漁業(yè)環(huán)境保護(hù)和漁業(yè)資源恢復(fù)與管理提供一定科學(xué)依據(jù)。

3.3 水生動(dòng)物洄游路線分析

洄游能使魚類獲得更有利的生存條件，更好地適應(yīng)環(huán)境、繁衍后代[37]。穩(wěn)定同位素利用個(gè)體中不同組織周轉(zhuǎn)率，以跟蹤δ13C 和δ15N 隨時(shí)間的變化，量化魚類洄游中的食物來(lái)源，推斷不同的棲息地環(huán)境進(jìn)而得出洄游路線[38-40]。通過(guò)洄游路線分析物種內(nèi)、種群內(nèi)和個(gè)體之間覓食行為的微觀棲息地變化，為監(jiān)測(cè)漁業(yè)資源、提高漁業(yè)生產(chǎn)效率及增殖放流等提供一個(gè)新的觀察角度，也可為珍惜洄游魚類的保護(hù)提供規(guī)劃。

為了確定安大略湖大西洋鮭（Salmo salar）種群是否會(huì)到大西洋溯河產(chǎn)卵，Guiry 等[41]利用考古發(fā)掘的骨骼與歷史博物館存檔的鮭鱗片進(jìn)行碳、氮、硫穩(wěn)定同位素分析，結(jié)果表明來(lái)自安大略湖的原始鮭種群其整個(gè)生命周期并沒有遷移到大西洋溯河產(chǎn)卵。該項(xiàng)研究時(shí)間跨度長(zhǎng)達(dá)500 余年，為后續(xù)增殖放流和資源保護(hù)提供了重要依據(jù)。崔瑩等[42]通過(guò)采集野生中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）洄游路線上不同時(shí)間段的幼體及可能的食物來(lái)源，探討在洄游時(shí)期幼蟹的食性轉(zhuǎn)變。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從大眼幼體到幼蟹，δ13C 值減小，而δ15N 值增加，表明野生絨螯蟹洄游遷徙過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)級(jí)增高，由攝食浮游生物轉(zhuǎn)變?yōu)榈讞?，且逐漸加大攝取陸源性食物。Silva等[43]利用貝葉斯混合模型研究亞速爾群島藍(lán)鯨（Balaenoptera musculus）、塞鯨（Balaenoptera borealis）、長(zhǎng)須鯨（Balaenoptera physalus）的營(yíng)養(yǎng)生態(tài)位和遷移途徑。結(jié)果表明，長(zhǎng)須鯨δ15N 值高于藍(lán)鯨和塞鯨，表明其具有較高營(yíng)養(yǎng)位的攝食，混合模型則證明藍(lán)鯨和塞鯨主要利用來(lái)自非洲西北部上層和中上層熱帶/亞熱帶地區(qū)的食源，而長(zhǎng)須鯨利用伊比利亞半島周圍食源。穩(wěn)定同位素技術(shù)的應(yīng)用為有效保護(hù)物種、遷移過(guò)程中的攝食信息起了關(guān)鍵性作用。

4 展望

穩(wěn)定同位素為水生動(dòng)物的食性研究提供了新的技術(shù)途徑，可以從不同的角度開展研究，追蹤營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的來(lái)源去向，在魚類等開口餌料的選擇、食性的轉(zhuǎn)換、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用以及捕食的多樣性等方面具有重要意義[44-47]。貝葉斯模型的引入可以在一定程度解決穩(wěn)定同位素的食性研究所面臨的方法學(xué)限制，但在食物網(wǎng)季節(jié)性變化與基線變化方面仍具有一定的挑戰(zhàn)[48-51]，未來(lái)需要對(duì)這兩點(diǎn)設(shè)計(jì)新模型和算法。

食物來(lái)源相似的同位素比例經(jīng)常重疊，無(wú)法識(shí)別特定食源物種，只能分辨大類的官能團(tuán)，這可能會(huì)掩蓋數(shù)量上次要但營(yíng)養(yǎng)上重要的食源。通過(guò)與DNA 條形碼、脂肪酸分析等[52-55]其他檢測(cè)方法結(jié)合，進(jìn)行餌料豐度分析時(shí)，可以提高在物種水平上確定潛在食源的準(zhǔn)確性。未來(lái)隨著穩(wěn)定同位素檢測(cè)方法示蹤識(shí)別能力的提高，例如面對(duì)棲息地遷移、季節(jié)性食源變化和餌料出現(xiàn)頻率時(shí)，水生動(dòng)物同化餌料存在一定的時(shí)間滯后性，考慮穩(wěn)定同位素動(dòng)力學(xué)，量化穩(wěn)定同位素周轉(zhuǎn)率，建立特定條件下的同位素時(shí)鐘來(lái)提供準(zhǔn)確的參數(shù)[56]，可以更好地定位物質(zhì)、能量流動(dòng)，為水生動(dòng)物的食性研究提供更好的參考依據(jù)。