姚桂紅, 凌 云, 張雨佳, 邢仕歌, 姚美伊, 國 偉, 張 峰

(中國檢驗檢疫科學(xué)研究院食品安全研究所,北京 100176)

牛奶在進(jìn)入市場前一般需要經(jīng)過熱處理來減少微生物數(shù)量,延長牛奶的保質(zhì)期[1-4]。然而牛奶在熱處理或貯存過程中極易發(fā)生美拉德反應(yīng)[1,5,6],這對牛奶的營養(yǎng)價值、理化性質(zhì)和風(fēng)味均會產(chǎn)生較大的影響,甚至誘發(fā)生成糠醛、晚期糖基化終末產(chǎn)物、丙烯酰胺等對人體健康有害的產(chǎn)物[7-10],且這些有害產(chǎn)物在存儲期間可能會進(jìn)一步增加,因此需要選擇合適的熱敏指標(biāo)來評判牛奶的熱處理強度?？钒彼崾侨槠访览路磻?yīng)的初級階段產(chǎn)物Amadori化合物酸水解時形成的產(chǎn)物[11,12],化學(xué)性質(zhì)較Amadori化合物更穩(wěn)定[13]。由此可以用糠氨酸間接量化Amadori產(chǎn)物,來評估牛乳的美拉德反應(yīng)程度。國際上常用糠氨酸含量作為判斷液態(tài)奶產(chǎn)品品質(zhì)的一個敏感指標(biāo)[14-18]。其中,歐盟各國早在1992年就將糠氨酸作為評判乳制品品質(zhì)的一個重要指標(biāo),并于1996年提出用糠氨酸作為判定復(fù)原乳的主要指標(biāo)。為提高我國乳業(yè)的核心競爭力,我國發(fā)起并實施了優(yōu)質(zhì)乳工程,并通過對國產(chǎn)奶和進(jìn)口奶科學(xué)系統(tǒng)的對比研究,確定了牛乳中糠氨酸可以作為品質(zhì)高低的評判指標(biāo)[19]。

目前常見的糠氨酸檢測方法主要有高效液相色譜法(HPLC)[12,19,20]、超高效液相色譜法[21,22]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[23-25]、高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜法(high performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry,HPLC-Q-TOF/MS)[26]、毛細(xì)管電泳-串聯(lián)質(zhì)譜法[27]和表面熒光法[28]等。其中,HPLC是應(yīng)用最早、普及最廣的檢測方法,國際奶業(yè)聯(lián)合會(International Dairy Federation,IDF)和國際標(biāo)準(zhǔn)化組織(International Organization for Standardization,ISO)于2014年頒布的乳及乳制品中糠氨酸含量的測定方法(ISO 18329-2004)[29]及我國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 939-2016《巴氏殺菌乳和UHT滅菌乳中復(fù)原乳的鑒定》中均采用了HPLC。但在實際檢測時,由于牛奶水解樣品中含有糖、有機酸等雜質(zhì),可能會嚴(yán)重干擾糠氨酸的準(zhǔn)確定量。相較常用的HPLC,液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法和HPLC-Q-TOF/MS抗干擾能力強,在排除干擾組分鑒別目標(biāo)物方面具有優(yōu)勢,非常適合檢測復(fù)雜牛奶基質(zhì)中的糠氨酸?？钒彼崾撬崴猱a(chǎn)物,糠氨酸中的酸溶液會對質(zhì)譜響應(yīng)有影響,進(jìn)而影響糠氨酸的準(zhǔn)確定量,尤其當(dāng)糠氨酸含量較低時,易導(dǎo)致檢測結(jié)果被誤判,進(jìn)而影響巴氏殺菌乳的等效性評價?，F(xiàn)有報道的質(zhì)譜法均未考察酸對質(zhì)譜響應(yīng)的影響。故本研究基于HPLC-Q-TOF/MS建立了液態(tài)乳中糠氨酸含量的測定方法,并考察了糠氨酸溶液中酸濃度對質(zhì)譜信號的影響,為液態(tài)乳中糠氨酸的準(zhǔn)確定量提供高效可靠的技術(shù)手段。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

ACQUITY UPLC型超高效液相色譜系統(tǒng)+Xevo G2 Q-TOF型高分辨四極桿飛行時間質(zhì)譜儀,配置標(biāo)準(zhǔn)電噴霧離子源(electrospray ionization,ESI)(美國Waters公司); Vortex-KB3渦旋混合器(美國Scientific Industries公司); DKN612C烘箱(重慶雅馬拓科技有限公司); Advantage A10 Milli-Q去離子水發(fā)生器(美國Millipore公司); AQ-C18色譜柱(150 mm×3.5 mm,5 μm,日本島津公司)。

牛奶樣品(市售,101個批次303個樣品);糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.99%,美國Sigma Aldrich公司);乙酸銨、乙腈、甲酸(色譜純,美國Thermo Fisher Scientific公司);鹽酸(分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。實驗用水采用Millipore純水儀制備。

1.2 實驗條件

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備液:稱取適量糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)品,用濃度為3.00 mol/L的鹽酸配制成質(zhì)量濃度為10.00 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

標(biāo)準(zhǔn)工作液:移取一定量的標(biāo)準(zhǔn)儲備液,用1.00 mol/L的鹽酸稀釋至所需濃度,標(biāo)準(zhǔn)工作液中鹽酸最終濃度為1.25 mol/L,臨用現(xiàn)配。

1.2.2樣品水解

王峰恩等[11]報道,牛乳酸解時鹽酸濃度≥6 mol/L時Amadori化合物完全酸水解為糠氨酸。本研究移取2.00 mL牛奶樣品置于耐熱玻璃試管中,加入5 mL鹽酸溶液(12.00 mol/L)和1 mL水,渦旋混勻。密閉試管并將其置于烘箱中,在110 ℃下水解12 h。加熱水解結(jié)束后將耐熱玻璃試管從烘箱中取出,冷卻至室溫,渦旋混勻后過濾。移取1.00 mL濾液,加入5.00 mL 6.00 g/L的乙酸銨溶液(此時水解液中鹽酸濃度約為1.25 mol/L),混勻后過0.22 μm水相濾膜,濾液供上機待測。

1.2.3樣品水解液中蛋白質(zhì)測定

移取2.00 mL牛奶水解液,按GB 5009.5-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定》規(guī)定的凱氏定氮法測定樣品水解液中蛋白質(zhì)的含量。

1.2.4色譜條件

色譜柱:AQ-C18(150 mm×3.5 mm,5 μm);柱溫:室溫(25 ℃);流動相A:0.20%甲酸水溶液,流動相B:乙腈;進(jìn)樣量:5.00 μL;流速:0.30 mL/min;梯度洗脫程序:0～0.2 min,5%B; 0.2～10 min,5%B～100%B; 10～13 min,100%B～5%B; 13～15 min,5%B。

1.2.5質(zhì)譜條件

在電噴霧離子源正離子模式(ESI+)下以全掃描方式掃描,掃描范圍為m/z50～400,毛細(xì)管電壓4.0 kV,錐孔電壓40 V,離子源溫度100 ℃,去溶劑氣溫度350 ℃,去溶劑氣流量600 L/h,為了保障質(zhì)量數(shù)精度,用甲酸鈉對儀器質(zhì)量軸進(jìn)行質(zhì)量校正。

1.2.6糠氨酸含量計算

糠氨酸含量以質(zhì)量分?jǐn)?shù)F計,數(shù)值以毫克每百克蛋白質(zhì)(mg/100 g)表示,按公式(1)計算:

(1)

式中:C為樣品水解液中糠氨酸含量(mg/L);D為測定時稀釋倍數(shù)(D=6);m為樣品水解液中蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度(g/L)。

1.2.7基質(zhì)效應(yīng)考察

本研究在牛奶基質(zhì)中添加糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液,配制成質(zhì)量濃度為0.05、0.10、0.20、0.50、1.00和2.00 mg/L的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液。同時配制相同質(zhì)量濃度的溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液,以HPLC-Q-TOF/MS測定,按公式(2)計算ME:

(2)

其中,B為基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率;A為溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率。

當(dāng)ME值為80.0%～120.0%時,表明基質(zhì)對目標(biāo)物干擾較小,基質(zhì)效應(yīng)在可接受范圍內(nèi),在實際檢測中可以采用溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線定量;反之則應(yīng)采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線降低基質(zhì)干擾影響。

1.3 數(shù)據(jù)處理

HPLC-Q-TOF/MS所得質(zhì)譜數(shù)據(jù)采用隨機配置的美國Waters公司的MassLynx 4.2軟件采集,在MassLynx 4.2軟件上進(jìn)行定性定量處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 定性定量分析依據(jù)

HPLC-Q-TOF/MS測定牛奶樣品中的糠氨酸時,以一級母離子的精確質(zhì)量數(shù)、同位素豐度比和色譜保留時間等信息作為定性依據(jù),母離子響應(yīng)強度為定量分析依據(jù)。測定0.2 mg/L的糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液,提取離子流色譜圖及質(zhì)譜圖見圖1?？钒彼針?biāo)準(zhǔn)品的色譜保留時間為1.23 min,精確相對分子質(zhì)量為255.133 3。在實際樣品檢測時,相應(yīng)質(zhì)荷比的提取離子色譜圖中出現(xiàn)了與糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)品保留時間一致(變化范圍在±0.5%之內(nèi))的色譜峰,若精確質(zhì)量數(shù)偏差范圍在±5×10-6之內(nèi)且同位素豐度比相差不大于10%,即可判斷該樣品中存在糠氨酸。

圖1 糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)品(0.2 mg/L)的(a)提取離子流色譜圖及(b)質(zhì)譜圖

2.2 鹽酸濃度對糠氨酸檢測結(jié)果的影響

本研究采用ESI采集質(zhì)譜信號,試樣中酸的濃度可能促進(jìn)或抑制樣品離子電離,從而影響質(zhì)譜信號。因此,本研究對比了以3種不同濃度鹽酸溶液(0.30、1.25、3.00 mol/L)配制的糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)譜響應(yīng),采集到的糠氨酸峰面積分別為2 643、1 359和902。隨著鹽酸濃度的升高,糠氨酸質(zhì)譜響應(yīng)降低,這可能是由于隨著酸濃度增大,樣品中的氫離子增多,過多的氫離子與樣品離子競爭電荷,從而抑制了質(zhì)譜信號。另外,糠氨酸所處溶液環(huán)境對糠氨酸的穩(wěn)定性影響較大,陳美霞等[30]對比了糠氨酸溶解在3種不同濃度鹽酸(0.1、1.0、3.0 mol/L)中的穩(wěn)定性,發(fā)現(xiàn)用3.0 mol/L鹽酸配制的糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液穩(wěn)定性最佳,這是由于糠氨酸為酸性分子,較高的酸性環(huán)境有助于提高其存儲穩(wěn)定性。本研究實際上機樣品經(jīng)酸解稀釋后溶液中鹽酸濃度約為1.25 mol/L。為了提高目標(biāo)物的定量準(zhǔn)確性,本研究糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液配制在3.0 mol/L鹽酸中,將標(biāo)準(zhǔn)工作液配制在1.25 mol/L鹽酸溶液中,與上機試樣中鹽酸濃度一致。

2.3 流動相的選擇

戶江濤[23]對比發(fā)現(xiàn),糠氨酸在酸性體系流動相中峰形更加對稱,分離效果更好。多數(shù)研究在流動相中添加三氟乙酸(見表1),三氟乙酸酸性較強,長期使用會損害色譜柱,縮短其使用壽命。本研究綜合考慮目標(biāo)物信號、除雜等因素,采用酸性較弱的甲酸和洗脫能力更強的乙腈作為流動相,得到了很好的分離效果。

表1 糠氨酸檢測方法比較

2.4 基質(zhì)效應(yīng)考察

牛奶樣品基質(zhì)復(fù)雜,樣品中的其他組分在質(zhì)譜分析過程中可對糠氨酸響應(yīng)造成不可預(yù)期的抑制或者增強。本研究通過對比基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率來評價方法的基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果顯示,溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=15 941X-1 650.9,基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=16 850X-2 225,由此得出ME為105.70%,基質(zhì)效應(yīng)在可接受范圍內(nèi),因此在測定過程中采用溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.5 方法的線性范圍、檢出限和定量限

在選定的工作參數(shù)下測定糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)系列溶液,結(jié)果顯示,在0.05～2.00 mg/L范圍內(nèi),糠氨酸質(zhì)量濃度與峰面積值呈良好的線性關(guān)系,線性回歸方程為Y=15 941X-1 650.9,相關(guān)系數(shù)(r)為0.994。分別以信噪比為3(S/N=3)和10(S/N=10)來確定檢出限(LOD)和定量限(LOQ)。LOD和LOQ分別為0.50 mg/100 g蛋白和1.50 mg/100 g蛋白。該方法的檢出限與現(xiàn)有報道的比較見表1,相對現(xiàn)有報道,檢出限明顯降低。由于生鮮乳中的糠氨酸含量一般高于2 mg/100 g,故本方法能滿足日常液態(tài)乳中糠氨酸的檢測要求。

2.6 回收率和精密度

選取某品牌巴氏殺菌乳樣品作為加標(biāo)回收樣品,添加低、中、高3個水平的糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(1.52、3.03、15.17 mg/100 g)后按照1.2節(jié)方法進(jìn)行樣品前處理及檢測,每個加標(biāo)水平重復(fù)測定6次,計算平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。結(jié)果如表2所示,糠氨酸的平均回收率為79.9%～119.7%,RSD為1.4%～2.6%。表明該方法回收率高,穩(wěn)定性好,能滿足巴氏殺菌乳中糠氨酸的檢測要求。

表2 某品牌巴氏殺菌乳中糠氨酸的加標(biāo)回收率和RSD(n=6)

2.7 實際樣品檢測

本研究同時采用2016年發(fā)布的農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 939-2016(HPLC)和本研究所建立的HPLC-Q-TOF/MS檢測某市售品牌巴氏殺菌乳中的糠氨酸,檢測結(jié)果見圖2。由圖2a可知,采用HPLC方法,樣品的糠氨酸組分與含有的雜質(zhì)不能實現(xiàn)良好分離,進(jìn)而影響定量的準(zhǔn)確性。HPLC-Q-TOF/MS具有可以獲得一級精確質(zhì)量數(shù)、同位素比率信息、較完整的化合物裂解碎片信息等優(yōu)勢,通過提取精確的糠氨酸質(zhì)荷比(質(zhì)量偏差不高于5×10-6)可以有效去除其他組分的干擾,大大提高定性定量的準(zhǔn)確度,且不受進(jìn)樣次數(shù)增加的影響。另外,本研究采用洗脫能力更強的乙腈溶液作為流動相進(jìn)行檢測分析,可以更好地去除分離檢測系統(tǒng)中殘留的雜質(zhì)。利用所建立的HPLC-Q-TOF/MS方法檢測了101個批次303個某市售品牌巴氏殺菌乳樣品,市售巴氏殺菌乳的全掃描色譜圖及提取精確質(zhì)量數(shù)離子圖如圖2b～c所示。樣品糠氨酸含量為5.1～11.9 mg/100 g,檢測結(jié)果符合其他文獻(xiàn)中巴氏殺菌乳中糠氨酸檢測值[16],間接證明本方法的可靠性。

3 結(jié)論

糠氨酸是評價牛奶成品品質(zhì)的重要指標(biāo)之一。本研究針對復(fù)雜基質(zhì)造成的定性定量不準(zhǔn)確的問題,結(jié)合高分辨四極桿飛行時間質(zhì)譜高效快速、高質(zhì)量精度、高靈敏度的特點,建立了液態(tài)乳中糠氨酸的分析檢測方法。相比于行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)HPLC法,檢測時長縮短至15 min,且通過提取精確的糠氨酸質(zhì)荷比(質(zhì)量偏差不高于5×10-6),并對比保留時間及同位素豐度比,可以有效去除雜質(zhì)干擾,對于目標(biāo)物的定性定量分析也更為精確,且不受進(jìn)樣次數(shù)的影響。相較現(xiàn)有報道的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法和HPLC-Q-TOF/MS法,本研究進(jìn)一步考察了鹽酸濃度對糠氨酸質(zhì)譜響應(yīng)的影響,確?？钒彼岫扛鼫?zhǔn)確,實現(xiàn)了乳品中糠氨酸的精準(zhǔn)檢測,可用于市場牛乳中糠氨酸的監(jiān)控。但本研究前處理方法仍較為復(fù)雜,今后研究中將對簡化糠氨酸前處理步驟進(jìn)行深入研究。