章璐幸, 周 征, 曹 琳, 錢 江*

(1.浙江藥科職業(yè)大學,浙江 寧波 315100; 2.寧波市藥品檢驗所,浙江 寧波 315048)

真菌毒素造成的污染是食品安全較為重要的問題之一,植物在種植、生長、收獲、加工、運輸?shù)雀鱾€環(huán)節(jié)均有被污染的可能,根據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織的統(tǒng)計,全球25%的食品受到不同程度的真菌毒素污染,這已經(jīng)成為一個全球性的問題[1-3]。目前發(fā)現(xiàn)的數(shù)百種真菌毒素中,約有12種真菌毒素被認為具有嚴重健康危害,其中黃曲霉素B1(AFB1)被列為Ⅰ類致癌物[4]。

前期,本課題組應(yīng)用超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜(UPLC-Q-TOF/MS)建立了水稻、小麥中18種真菌毒素的高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫,可以在無對照品的狀態(tài)下,準確篩查出水稻、小麥中痕量的真菌毒素,建立了良好的非靶向定性方法[5]。參考GB 2761-2017《食品安全國家標準 食品中真菌毒素限量》[6]和EC No.1881/2006[7],在稻谷、小麥基質(zhì)中有明確監(jiān)管限量要求的真菌毒素有7種,對這7種真菌毒素有必要進行定量分析,確定是否符合標準限度要求,保護公眾食品安全。

目前定量首選的方法是液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[8,9],其具有較高的靈敏度和選擇性[10,11],但為了準確定性和定量真菌毒素,需要獲得高濃度對照品和相應(yīng)的同位素內(nèi)標[12],有些對照品如AFB1純度高、毒性大,不可避免會對實驗者及實驗環(huán)境造成一定危害,而且靠預先設(shè)定的對照品來進行定性,無法獲取對照品以外的真菌毒素殘留信息[13]。另外,LC-MS/MS分辨力有限,容易產(chǎn)生假陽性現(xiàn)象。高分辨質(zhì)譜(HRMS)可在全掃描模式下采集選定質(zhì)量范圍內(nèi)的全部離子,提供大量的定性信息。隨著技術(shù)的發(fā)展,HRMS選擇性、動態(tài)范圍、線性、靈敏度等有了很大的提升,從而擴大了在定量分析中的應(yīng)用[14,15]。四極桿-飛行時間質(zhì)譜兼具四極桿的高選擇性和飛行時間質(zhì)譜的高分辨率,數(shù)據(jù)采集可以兼容定量分析的靈敏度和選擇性。

本文基于UPLC-Q-TOF/MS,建立了水稻、小麥基質(zhì)中7種真菌毒素的測定方法。采用UPLC-Q-TOF/MS在全信息串聯(lián)質(zhì)譜(MSE)模式下對樣品進行篩查,針對篩查結(jié)果為陽性的樣品,采用ESI源,在正、負離子飛行時間多反應(yīng)監(jiān)測(TOF-MRM)模式下進一步檢測,用基質(zhì)匹配標準曲線進行校準定量,為水稻、小麥中真菌毒素污染監(jiān)測和風險預警提供有力的技術(shù)支持。

1 實驗部分

1.1 儀器與試藥

G2 XS四極桿-飛行時間高分辨質(zhì)譜儀、ACQUITY UPLC超高效液相色譜儀、MassLynx V4.2工作站、UNIFI科學信息學系統(tǒng)(美國Waters公司); Milli-Q超純水純化系統(tǒng)(美國Millipore公司);電子天平(瑞士METTLER TOLEDO公司); L580離心機(上海盧湘儀離心機儀器有限公司); LPD2500振蕩器(萊普特科學儀器(北京)有限公司)。

黃曲霉素B1(10.0 μg/mL)、黃曲霉素B2(AFB2,10.0 μg/mL)、黃曲霉素G1(AFG1,10.0 μg/mL)、黃曲霉素G2(AFG2,10.0 μg/mL)、赭曲霉素(OTA,100 μg/mL)、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON,1 000 μg/mL)標準溶液,玉米赤霉烯酮(ZEN,10.0 mg)標準品均購自阿爾塔科技有限公司;QuEChERS萃取鹽包購自美國安捷倫科技公司;甲醇、乙腈(質(zhì)譜純)購自德國Merck公司;乙酸、甲酸、乙酸銨(質(zhì)譜純)均購自阿拉丁試劑;實驗用水為Milli-Q超純水。

1.2 色譜-質(zhì)譜分析條件

1.2.1UPLC條件

色譜柱為Waters HSS T3柱(100 mm×2.1 mm,1.8 μm),柱溫40 ℃,流動相A為含5 mmol/L乙酸銨的1%乙酸水溶液,流動相B為甲醇,流速為0.3 mL/min,樣品進樣量為10 μL。梯度洗脫程序見表1。

表1 UPLC梯度洗脫程序

1.2.2Q-TOF/MS條件

ESI正離子模式:毛細管電壓3.00 kV,錐孔電壓40 V,離子源溫度110 ℃,脫溶劑氣溫度450 ℃,錐孔氣流速50 L/h,脫溶劑氣流速800 L/h。ESI負離子模式:毛細管電壓2.50 kV,錐孔電壓40 V,離子源溫度110 ℃,脫溶劑氣溫度450 ℃,錐孔氣流速50 L/h,脫溶劑氣流速800 L/h。LockSpary溶液:亮氨酸腦啡肽(正離子m/z556.277 1,負離子m/z554.261 5);采集模式:MSE、TOF-MRM模式。MSE模式設(shè)置:質(zhì)量掃描范圍m/z50～1 200;掃描時間0.25 s;低碰撞能量(LE)關(guān)閉,高碰撞能量(HE)為3～40 eV; TOF-MRM模式設(shè)置:詳見表2中的參數(shù)設(shè)置。數(shù)據(jù)采集由MassLynx V4.2工作站完成。

表2 7種真菌毒素的質(zhì)譜參數(shù)

1.3 樣品前處理

準確稱取5.0 g樣品,于50 mL聚丙烯具塞離心管中,加入20 mL 0.2%甲酸水-乙腈(50∶50,v/v),渦旋混勻,振蕩提取25 min,加入QuEChERS萃取鹽包(含4 g硫酸鎂、1 g氯化鈉、1 g檸檬酸鈉、0.5 g檸檬酸二鈉鹽),振蕩5 min,以4 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min,取上清液,用0.22 μm聚四氟乙烯濾膜過濾,取續(xù)濾液,進樣分析。

1.4 標準溶液配制

分別精密量取AFG1、AFG2、AFB1、AFB2、OTA、DON標準品原溶液1 mL,置于5 mL容量瓶中,用乙腈定容至刻度;ZEN標準品用乙腈定量溶解至10 mL容量瓶中,配制7種真菌毒素標準儲備液,于-20 ℃避光保存。取7種真菌毒素標準儲備液適量,用乙腈稀釋制成AFG1、AFG2、AFB1、AFB2、OTA、DON、ZEN質(zhì)量濃度分別為50.0、50.0、50.0、50.0、200、40 000、2 000 ng/mL的混合標準溶液,于-20 ℃避光保存。

按課題組前期[5]確定的篩查方法,選用未檢出真菌毒素的樣品作為空白樣品,按1.3節(jié)處理得到空白基質(zhì)溶液,取7種真菌毒素混合標準溶液適量,用空白基質(zhì)溶液稀釋,配制成基質(zhì)匹配混合校準溶液,其中AFG1、AFG2、AFB1、AFB2的質(zhì)量濃度分別為0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 ng/mL,OTA為1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 ng/mL,DON為200、400、600、800、1 000 ng/mL,ZEN為10.0、20.0、30.0、40.0、50.0 ng/mL。

小說中的“我”遵循伊一生前遺囑，把“候人兮猗”刻上她墓碑?！昂蛉速忖ⅰ?，是詩之南音第一聲，為涂山氏等候心上人禹歸來而發(fā)聲為詩。在漫長等待中，涂山氏終于化作“望夫石”。作家伊一把它刻在自己的墓碑上——或者說作家李舍把它刻在伊一墓碑上，以墓碑替代了“望夫石”。

1.5 UNIFI篩查條件

參照本課題組前期[5]研究,篩查條件為:選取加合物(包括[M+H]+、[M+NH4]+、[M-H]-和[M+CH3COO]-)作為目標質(zhì)量,低能量通道質(zhì)譜報告強度閾值100,高能量通道質(zhì)譜報告強度閾值20;絕對保留時間漂移0.3 min;離子測得質(zhì)量數(shù)與數(shù)據(jù)庫中的離子理論質(zhì)量數(shù)匹配容差5×10-6。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1色譜柱的選擇

實驗比較了BEH HILIC C18(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)和HSS T3(100 mm×2.1 mm,1.8 μm)色譜柱,使用BEH HILIC C18色譜柱時,化合物出峰速度過快,其中DON幾乎無保留,使用后者,化合物峰形和保留時間較為合理。推測HSS T3柱具有較高的硅烷親和性,能增強極性化合物的保留。因此選擇HSS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.8 μm)。

2.1.2流動相條件的優(yōu)化

本實驗比較了水-甲醇體系、1%甲酸水溶液-甲醇體系、1%乙酸水溶液-甲醇體系與LS/T 6133-2018《糧油檢驗主要谷物中16種真菌毒素的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》標準中的含5 mmol/L乙酸銨的1%乙酸水溶液-甲醇體系。結(jié)果顯示,采用含5 mmol/L乙酸銨的1%乙酸水溶液-甲醇體系時,得到的離子響應(yīng)強度和峰形最優(yōu),提取離子色譜圖如圖1所示。

圖1 7種真菌毒素混合標準溶液的提取離子色譜圖

2.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

7種真菌毒素中AFG1、AFG2、AFB1、AFB2、OTA采用正離子模式,DON、ZEN采用負離子模式,若均以正離子或負離子模式電離,會導致信號響應(yīng)值達不到最佳。

本實驗對MSE和TOF-MRM 2種數(shù)據(jù)采集模式進行比較,在色譜條件、離子源參數(shù)和積分方法一致的前提下,采用TOF-MRM模式獲得的7種真菌毒素信號強度高、基線噪聲小,有更好的靈敏度和選擇性,適用于定量分析。MSE模式能夠獲得質(zhì)量數(shù)精準的完整碎片信息,適于定性篩查分析。以AFB1為例,TOF-MRM模式和MSE模式所獲得的質(zhì)譜圖對比如圖2所示,該結(jié)果清楚展示了兩種采集模式的差異。

2.3 前處理方法的優(yōu)化

向水稻、小麥空白基質(zhì)中定量加入7種真菌毒素標準品,考察提取溶劑甲酸水溶液-乙腈(50∶50,v/v)中甲酸的體積分數(shù)(0、0.2%、0.4%、0.8%、2.0%)對回收率的影響。結(jié)果如圖3所示,與不添加甲酸相比,加入甲酸后目標化合物的回收率整體有所提高,甲酸體積分數(shù)為0.2%和0.4%時,回收率較高且接近。隨著甲酸體積分數(shù)的增加,正離子模式下黃曲霉素類、OTA回收率逐漸降低,而負離子模式下DON和ZEN回收率基本不變,綜合考慮,最終選擇甲酸體積分數(shù)為0.2%。

圖3 提取溶劑中甲酸的體積分數(shù)對(a)水稻和(b)小麥基質(zhì)中真菌毒素回收率的影響

2.3.2凈化方式的選擇

以水稻、小麥空白基質(zhì)加標樣品的回收率為考察對象,以0.2%甲酸水溶液-乙腈(50∶50,v/v)為稀釋液,比較了直接提取稀釋法、MycoSpin 400凈化柱法、QuEChERS萃取鹽包結(jié)合Captiva EMR-Lipid過濾柱、QuEChERS萃取鹽包結(jié)合Oasis PRIME HLB小柱和QuEChERS萃取鹽包直接凈化法。結(jié)果表明,用直接提取稀釋法提取液離心后取上清液,過0.22 μm濾膜,7種真菌毒素的絕對響應(yīng)較低,而且隨著進樣次數(shù)的增加目標物信號響應(yīng)逐漸降低直到淹沒在基線噪聲中,因此后續(xù)不再考察。對于其他凈化法的考察結(jié)果如圖4所示。QuEChERS萃取鹽包直接凈化法中AFG1、AFG2、AFB1、AFB2、ZEN的回收率比采用QuEChERS萃取鹽包結(jié)合凈化柱法(Captiva EMR-Lipid過濾柱、Oasis PRIME HLB小柱)更高?？赡艿脑蚴翘盍螮MR和HLB本身對脂質(zhì)有較強的去除效果,對ZEN中的大環(huán)類結(jié)構(gòu)有較強的吸附作用,對AFG1、AFG2、AFB1、AFB2中的雙呋喃環(huán)香豆素結(jié)構(gòu)可能也有一定的吸附作用。通過幾種前處理方法的比較,我們選用QuEChERS萃取鹽包直接凈化法,操作簡便,回收率高。

圖4 凈化方法對(a)水稻和(b)小麥基質(zhì)中真菌毒素回收率的影響

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

分別用提取溶劑和基質(zhì)溶液配制純?nèi)軇藴嗜芤汉突|(zhì)匹配混合校準溶液,以目標組分色譜峰面積對質(zhì)量濃度繪制標準曲線。ME=(基質(zhì)匹配校準曲線的斜率-溶劑標準曲線的斜率)/溶劑標準曲線的斜率×100%,|ME|≤20%為弱基質(zhì)效應(yīng),可以忽略;20%<|ME|≤50%為中等基質(zhì)效應(yīng);|ME|>50%為強基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果表明,在水稻基質(zhì)中AFG1、AFG2、AFB1、AFB2和OTA具有中等強度的基質(zhì)效應(yīng);在小麥基質(zhì)中僅有OTA和ZEN為中等強度的基質(zhì)效應(yīng)。因此需采用基質(zhì)匹配校準曲線進行校準定量。

2.5 標準曲線、檢出限和定量限

前期,課題組已在UNIFI上建立了谷物中的18種真菌毒素數(shù)據(jù)庫,并在無標準品的情況下,準確篩查出谷物中的真菌毒素殘留,建立了良好的非靶向定性方法[5]。當篩查出的真菌毒素明顯高于或低于限量時,容易得出準確的評判結(jié)論,但當其響應(yīng)接近限量時,定量測定的準確性對結(jié)果的判定尤為重要,因此建立了包含限量濃度的標準曲線。如表3所示,本文根據(jù)GB 2761-2017和EC No.1881/2006標準對谷物類及其制品的要求,合計對7種真菌毒素規(guī)定了限量,選取兩個標準中較低的最大殘留限量(MRL)作為本試驗的限量標準。取1.4節(jié)的基質(zhì)匹配混合校準溶液,按照1.2.1和1.2.2節(jié)方法進行測定,以目標組分色譜峰面積對質(zhì)量濃度繪制標準曲線。

表3 7種真菌毒素的最大限量

結(jié)果如表4、表5所示,在水稻和小麥基質(zhì)中,各化合物在其線性范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)(r)≥0.990 0,以定量離子信噪比大于3計算檢出限,為0.50～400 μg/kg,以定量離子信噪比大于10計算定量限,為1.00～800 μg/kg。

表4 水稻基質(zhì)中7種真菌毒素的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限和基質(zhì)效應(yīng)

表5 小麥基質(zhì)中7種真菌毒素的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限和基質(zhì)效應(yīng)

2.6 回收率和精密度

在空白水稻、小麥基質(zhì)中添加低、中、高3個水平的混合標準溶液,按1.3節(jié)方法處理,每個水平平行6份,進行回收率試驗,并計算相對標準偏差(RSD)。結(jié)果表明,水稻和小麥基質(zhì)中真菌毒素在低、中、高3個加標水平下的平均回收率分別為88.1%～123.9%和102.0%～123.4%; RSD分別為0.2%～13.6%和0.8%～14.8%(表6)。說明方法具有良好的準確度和精密度,適用于水稻和小麥中 7種真菌毒素的定量。

表6 水稻和小麥中7種真菌毒素的加標回收率和精密度(n=6)

2.7 實際樣品檢測

收集了浙江省46批水稻和24批小麥,按照本課題組前期建立的方法[5]進行篩查,并按本文的方法進行定量測定,結(jié)果46批水稻中有1批篩查出了AFB1和AFB2,篩出率為2.2%,其中含量分別為10.8 μg/kg和1.2 μg/kg,根據(jù)本文規(guī)定的限量標準(表3),有1批超標,超標率為2.2%。24批小麥中有9批篩查出DON,篩出率為37.5%,19批篩查出ZEN,篩出率為79.2%。根據(jù)本文規(guī)定的限量標準(表3),測定結(jié)果表明DON和ZEN均未超過限量,超標率為0。

需要進一步強調(diào),由于MSE和TOF-MRM模式的側(cè)重點不同,建議對于那些殘留量低,毒性大的真菌毒素用MSE模式先行篩查,在篩查陽性確證后用TOF-MRM模式進行定量。以AFG1為例,用MSE模式進行篩查,按照課題組制定的篩查規(guī)則[5],精確質(zhì)量數(shù)的容差設(shè)為5×10-6,在UNIFI工作站中運行方法,結(jié)果在AFG1對應(yīng)保留時間范圍內(nèi)無目標物的加合離子和碎片離子精確質(zhì)量數(shù)(圖5a和b),判斷得出AFG1未篩出。同批樣品,在TOF-MRM模式,對應(yīng)保留時間處疑似有AFG1的色譜峰(圖5c)。推測產(chǎn)生的原因是用TOF-MRM模式進行定量時,儀器固有條件決定了定量離子的質(zhì)量數(shù)容差約為1 Da,導致基質(zhì)中的一些干擾物因質(zhì)量數(shù)和保留時間都與目標物接近,形成假陽性現(xiàn)象。

圖5 水稻樣品在MSE模式下(a)低能量、(b)高能量質(zhì)譜圖和(c)在TOF-MRM模式下的提取離子色譜圖

3 結(jié)論

本文以稻谷和小麥作為研究對象,建立了基于自建數(shù)據(jù)庫的超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜對水稻和小麥中7種真菌毒素定量的方法。該方法前處理操作簡便,篩查精準,定量準確,適用于大批量水稻、小麥中7種真菌毒素的定量,為谷物中的真菌毒素篩查檢測提供新思路與新方法,也為監(jiān)管提供技術(shù)支持。