林娜

（浙江誠(chéng)德檢測(cè)研究有限公司，浙江 寧波 315000）

0 引言

糞大腸菌群不僅存在于排泄物或人、動(dòng)物腸道內(nèi)，在各地水體環(huán)境中也檢測(cè)出糞大腸菌群，這種情況會(huì)導(dǎo)致整個(gè)水體環(huán)境被污染，誘發(fā)腸道病原菌感染[1]。做好糞大腸菌群的檢測(cè)工作，不僅能充分掌握監(jiān)測(cè)水源區(qū)域糞大腸菌群的實(shí)際污染情況，而且也能為第一時(shí)間開展預(yù)測(cè)、以及流行病的控制提供有利條件。

1 糞大腸菌群檢測(cè)原理及檢測(cè)流程

1.1 發(fā)酵法原理及其檢測(cè)流程

發(fā)酵法適用于地表水、地下水、生活污水和工業(yè)廢水中糞大腸的測(cè)定。首先，針對(duì)發(fā)酵法檢測(cè)原理來講，經(jīng)上文的分析可以明確，糞大腸菌群能都對(duì)乳糖起到分解作用的同時(shí)，產(chǎn)酸產(chǎn)氣，在多管發(fā)酵階段，乳糖蛋白胨培養(yǎng)基顏色會(huì)發(fā)生變化，并逐漸出現(xiàn)氣泡。其次，針對(duì)發(fā)酵法檢測(cè)流程來講，糞大腸菌群主要是借助乳糖蛋白胨多管進(jìn)行發(fā)酵，在實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)階段，應(yīng)從以下5點(diǎn)入手：①開展無(wú)菌實(shí)驗(yàn)，科學(xué)合理的對(duì)其進(jìn)行消毒和滅菌處理，避免實(shí)驗(yàn)環(huán)境存有細(xì)菌。陽(yáng)性及陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)，確保陽(yáng)性菌株呈陽(yáng)性反應(yīng)，陰性菌株呈陰性反應(yīng)。②籌備水樣樣本，組建實(shí)驗(yàn)組，以水樣污染程度為基礎(chǔ)，科學(xué)合理的明確接種量。通常情況下，可采用10mL、1mL、0.1mL。③準(zhǔn)備三倍乳糖蛋白胨培養(yǎng)液或者單倍乳糖蛋白胨培養(yǎng)液，如果接種體積為10mL 的情況下，則可應(yīng)用三倍乳糖蛋白胨培養(yǎng)液，而針對(duì)單倍乳糖蛋白胨培養(yǎng)液來講，更加適宜應(yīng)用在接種體積≤1mL的情況下。④針對(duì)初發(fā)酵實(shí)驗(yàn)來講，充分混勻被檢測(cè)水樣，并將其裝入培養(yǎng)液試管中，值得注意的是，要確保儲(chǔ)存試管和5 份培養(yǎng)液全部完成滅菌與消毒處理。并且將其放置在（37.0±0.5）℃的條件下培養(yǎng)（24±2）h。如果在培養(yǎng)的過程中發(fā)現(xiàn)產(chǎn)酸產(chǎn)氣的現(xiàn)象，則證明陽(yáng)性反應(yīng)。⑤復(fù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，對(duì)初發(fā)酵實(shí)驗(yàn)呈陽(yáng)性反應(yīng)的試管輕微搖晃，在恒溫為（44.5±0.5）℃條件下培養(yǎng)（24±2）h。值得注意的是，在復(fù)發(fā)酵階段，培養(yǎng)基中可能會(huì)出現(xiàn)其他種類菌落。若想確保目標(biāo)菌落的純度，要將其他菌落放置在溫度為（45.5±0.5）℃條件下的EC 肉湯培養(yǎng)基中單獨(dú)培養(yǎng)（24±2）h，在培養(yǎng)的過程中，要觀察其是否存在陽(yáng)性產(chǎn)氣現(xiàn)象，如果存在，則表明滋生了糞大腸菌群。在發(fā)酵階段，通過最大可能數(shù)MPN 值與指數(shù)關(guān)系開展科學(xué)、精準(zhǔn)的精算工作[2]。

式中：C——樣品中糞大腸菌群數(shù)，MPN/L；MPN——每100mL 樣品中糞大腸菌群，MPN/100mL；f——實(shí)際水樣最大接種量，mL；100——10×10mL，其中10 將MPN 值的單位MPN/100mL 轉(zhuǎn)換為MPN/L，10mL 為MPN 表中最大接種量，mL。

現(xiàn)階段，在我國(guó)糞大腸菌群的眾多檢測(cè)方式中，乳糖蛋白胨多管發(fā)酵法的應(yīng)用較為常見，且在全世界范圍內(nèi)的應(yīng)用都較為普遍。對(duì)此，世界各地研究人員在乳糖蛋白胨多管發(fā)酵法方面達(dá)成一致，此類檢測(cè)方式成為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方式。乳糖蛋白胨多管發(fā)酵法的優(yōu)勢(shì)為成本低、技術(shù)要求不高、不需要投入大量的人力、結(jié)果精準(zhǔn)性較高等；劣勢(shì)為實(shí)驗(yàn)操作過程煩瑣、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，在獲得實(shí)驗(yàn)結(jié)果之后，需要專人驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否精準(zhǔn)[3]。

在采用乳糖蛋白胨多管發(fā)酵法的過程中，對(duì)于實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)人員數(shù)量也有著一定的要求，因此，基層機(jī)構(gòu)難以確保乳糖蛋白胨多管發(fā)酵法的應(yīng)用效果。隨著我國(guó)科技水平日新月異的發(fā)展，也帶動(dòng)了乳糖蛋白胨多管發(fā)酵法的進(jìn)一步發(fā)展，并且逐漸發(fā)展為五管法、十二管法、以及十五管法。

1.2 濾膜法原理及其檢測(cè)流程

濾膜法適用于地表水、地下水、生活飲用水和工業(yè)廢水中糞大腸菌群的測(cè)定，但當(dāng)樣品渾濁度較高時(shí)，應(yīng)選用其他方法。首先，濾膜法原理如下。實(shí)驗(yàn)人員要做好實(shí)驗(yàn)環(huán)境與儀器的滅菌、消毒等工作，將微孔濾膜放入過濾器內(nèi)，倒入水樣，利用抽濾法對(duì)水樣進(jìn)行過濾。在抽濾后，細(xì)菌被截留在濾膜上。將濾膜與培養(yǎng)基表面充分結(jié)合在一起，并科學(xué)合理的開展接種作業(yè)，將其放置在恒溫為（44.5±0.5）℃環(huán)境下實(shí)施培養(yǎng)，在整個(gè)培養(yǎng)的過程中，實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)對(duì)其進(jìn)行全面的觀察。如果培養(yǎng)基滋生糞大腸菌群的情況下，要求實(shí)驗(yàn)人員其判斷是否滿足糞大腸菌群特點(diǎn)，做好菌落計(jì)數(shù)，測(cè)定樣品中糞大腸菌群濃度。

其次，濾膜法檢測(cè)流程如下。①對(duì)檢測(cè)水樣進(jìn)行過濾處理，對(duì)工具進(jìn)行滅菌消毒之后，借助工具夾起滅菌濾膜邊緣，觀察細(xì)膩的一面，并將其放在下面，將細(xì)膩面的濾膜放入過濾器內(nèi)緊貼濾床，實(shí)施滅菌處理、添加水樣。添加水樣時(shí)根據(jù)樣品的種類判斷接種量，最小的過濾體積為10mL，如接種量小于10mL 應(yīng)逐級(jí)稀釋。利用吸管提取待檢測(cè)水樣，值得注意的是，對(duì)于吸管同樣也要進(jìn)行滅菌消毒后方可使用，開啟過濾器閥門實(shí)施負(fù)壓50kPa 的抽濾。②培養(yǎng)細(xì)菌，在對(duì)水樣進(jìn)行過濾之后，對(duì)實(shí)驗(yàn)儀器中的氣體進(jìn)行抽出，5s 之后關(guān)閉過濾器閥門。將過濾器下置，帶菌落膜放置在MFC 培養(yǎng)基表面開展接種作業(yè)。在接種的過程中，要防止濾膜吸附菌種的一面朝下，將濾膜緊密貼合在培養(yǎng)基表面，如若不然，則可能會(huì)對(duì)菌種的正常生長(zhǎng)帶來不利影響。在培養(yǎng)之后，做好培養(yǎng)皿的密封處理，并將其放入溫度為（44.5±0.5）℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（24±2）h。③對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行全面統(tǒng)計(jì)，計(jì)算菌落數(shù)量。糞大腸菌群顏色是藍(lán)色或者藍(lán)綠色，與其他菌落顏色對(duì)比來講，糞大腸菌群顏色好區(qū)分，再加上在培養(yǎng)環(huán)境溫度的作用下，其他菌落可能會(huì)與培養(yǎng)基試劑發(fā)生反應(yīng)[4]。在培養(yǎng)中止之后，通過區(qū)分顏色，便可以判斷糞大腸菌群菌落，對(duì)其數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)之后，以體積與濃度關(guān)系為基礎(chǔ)，獲得每升水樣中大腸菌群菌落的實(shí)際數(shù)量。計(jì)算公式：糞大腸菌群菌落數(shù)=。

最后，每次實(shí)驗(yàn)都要進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)，分為空白對(duì)照和陽(yáng)性陰性對(duì)照。空白對(duì)照即每次實(shí)驗(yàn)都要用無(wú)菌水進(jìn)行空白測(cè)定。陽(yáng)性及陰性對(duì)照即陽(yáng)性菌株呈陽(yáng)性反應(yīng)，陰性菌株呈陰性反應(yīng)。

1.3 紙片快速檢測(cè)法原理及其檢測(cè)流程

紙片法適用于地表水、廢水中糞大腸菌群的快速測(cè)定。首先，紙片快速檢測(cè)法原理如下。針對(duì)實(shí)驗(yàn)階段的濾紙吸收選擇性培養(yǎng)基來講，要確保濾紙和培養(yǎng)基之間貼合的緊密性，做好培養(yǎng)溫度與培養(yǎng)時(shí)間的把控，培養(yǎng)時(shí)間為24h。細(xì)菌在繁殖的過程中，難免會(huì)形成酸，導(dǎo)致溴甲酚紫指示劑顏色發(fā)生變化，與此同時(shí)，脫氫酶會(huì)促使底物還原為三苯甲臢，顏色成紅色，簡(jiǎn)而言之，如果黃色背景下產(chǎn)生紅色斑點(diǎn)的情況下，則可明確樣品中是否滋生糞大腸菌群、以及滋生之后的糞大腸菌群濃度。其次，紙片快速檢測(cè)流程如下。具體來講，紙片快速檢測(cè)法和發(fā)酵法的流程大同小異。清潔水樣取10mL 水樣量紙片5 張，每張接種水樣10mL；然后，1mL水樣量紙片10 張，其中5 張接種水樣各1mL，另5 張各接種1：10 的稀釋水樣1mL。受污染的水樣接種3 個(gè)不同稀釋度的1mL 稀釋水樣各5 張。接種好的紙片將其放置在溫度為（44.5±0.5）℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24h，觀察有無(wú)菌落形成。當(dāng)然每次實(shí)驗(yàn)都要進(jìn)行空白測(cè)定，培養(yǎng)后的紙片上不得有任何顏色反應(yīng)，并使用標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行陽(yáng)性、陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)。菌落陽(yáng)性反應(yīng)參考：①紙片上出現(xiàn)紅斑或紅暈且周圍變黃。②紙片全片變黃，無(wú)紅斑或紅暈。菌落陰性反應(yīng)參考：①紙片部分變黃，無(wú)紅斑或紅暈。②紙片的紫色背景上出現(xiàn)紅斑或紅暈，而周圍不變黃。③紙片無(wú)變化[5]。記錄菌落數(shù)量和紙片陽(yáng)性情況，查MPN 值表得到MPN 值，按式（2）換算并報(bào)告1L 水樣中糞大菌群數(shù)：

式中：C——水樣總大腸菌群或糞大腸菌群濃度，MPN/L；M——查MPN 表得到的MPN 值，MPN/100mL；Q——實(shí)際水樣最大接種量，mL；100——10×10mL，其中10將MPN 值 的 單 位MPN/100mL 轉(zhuǎn) 換 為MPN/L，10mL 為MPN 表中最大接種量，mL。

1.4 酶底物法原理及檢測(cè)流程

酶底物適用于地表水、地下水、生活污水和工業(yè)廢水中糞大腸菌群的測(cè)定。首先，酶底物法原理如下。眾所周知，大腸菌群菌落能形成β-半乳糖苷酶，并對(duì)乳糖起到分解的作用，從而導(dǎo)致培養(yǎng)基有菌區(qū)域顏色出現(xiàn)變化。統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性反應(yīng)出現(xiàn)數(shù)量，計(jì)算樣品中糞大腸菌群的濃度值。其次，酶底物法檢測(cè)流程如下。①根據(jù)樣品污染程度確定接種量，避免樣品培養(yǎng)后出現(xiàn)全部陽(yáng)性或全部陰性。對(duì)于未知樣品，可選用多個(gè)接種量進(jìn)行檢測(cè)。②將被檢測(cè)水樣容量控制在100mL，對(duì)量瓶進(jìn)行消毒、滅菌處理之后，取出100mL 測(cè)試水樣或稀釋樣品，在水樣中添加MMO-MUG 粉末，并將粉末與水樣充分融合在一起。③將準(zhǔn)備好的水樣溶液全部倒入97 孔定量盤。④如果在定量盤產(chǎn)生氣泡的情況下，用手撫平97孔定量盤背面，然后用程控定量封口機(jī)封口。⑤將其放置在溫度為（44.5±0.5）℃環(huán)境下培養(yǎng)并觀察（24±2）h。在此階段，如果檢測(cè)水樣顏色發(fā)生了變化的情況下，則表明被檢測(cè)水體滋生了糞大腸菌群，分別記錄97 孔定量盤中大孔和小孔陽(yáng)性孔數(shù)。從97 孔定量盤法MPN中查得每100mL 中糞大腸菌群的MPN 值后，再根據(jù)不同稀釋度，按式（3）換算成糞大腸菌群數(shù)：

式中：C——樣品中糞大腸菌群數(shù)，MPN/L；MPN——每100mL 樣品中糞大腸菌群，MPN/100mL；f——實(shí)際水樣最大接種量，mL；1000——將C 單位由MPN/mL 轉(zhuǎn)換成MPN/L。

同樣每次實(shí)驗(yàn)都要進(jìn)行空白對(duì)照和陰性陽(yáng)性對(duì)照?？瞻讓?duì)照就是用無(wú)菌水按步驟進(jìn)行測(cè)定，培養(yǎng)后的97 孔定量盤不得有任何顏色反應(yīng)，否則該次實(shí)驗(yàn)判定無(wú)效。陰性陽(yáng)性對(duì)照就是用標(biāo)準(zhǔn)菌株制成菌懸液，按步驟進(jìn)行操作，陽(yáng)性菌株呈現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，陰性菌株呈現(xiàn)陰性反應(yīng)。

2 檢測(cè)方式的檢測(cè)結(jié)果對(duì)比

多管發(fā)酵法、濾膜法、紙片快速檢測(cè)法以及酶底物法檢測(cè)結(jié)果如表1 所示。通過對(duì)表1 的分析可以明確，糞大腸菌群不同的檢測(cè)方式也存在一定的不同。針對(duì)發(fā)酵法和濾膜法來講，發(fā)酵法流程復(fù)雜、限制因素多、可行度低，再加上發(fā)酵法所耗實(shí)驗(yàn)周期久，因此，發(fā)酵法應(yīng)用不常見，濾膜法更為方便，但濾膜法有其局限性，其對(duì)渾濁度較高的樣品，無(wú)法檢測(cè)。紙片快速法與發(fā)酵法相對(duì)比而言，紙片快速法顧名思義，其操作流程簡(jiǎn)單，不需要確認(rèn)實(shí)驗(yàn)，再加上精準(zhǔn)度高，經(jīng)濟(jì)實(shí)惠等優(yōu)勢(shì)，其在對(duì)結(jié)果要求時(shí)間短的糞大腸菌群檢測(cè)中更為常見。針對(duì)酶底物法來講，其同樣操作簡(jiǎn)單，一次實(shí)驗(yàn)即可完成檢測(cè)，但在技術(shù)方面有著一定的難度，同時(shí)所需成本較高。

表1 糞大腸菌群不同檢測(cè)方式的檢測(cè)對(duì)比

3 結(jié)語(yǔ)

綜上所述，在糞大腸菌群檢測(cè)中，發(fā)酵法、濾膜法的應(yīng)用較為普遍，值得注意的是，糞大腸菌群不同的檢測(cè)方式，都有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)與劣勢(shì)，因此，在糞大腸菌群檢測(cè)未來發(fā)展的過程中，要求業(yè)內(nèi)人士加大不同檢測(cè)方式的研究力度，盡可能減少檢測(cè)成本的同時(shí)，避免投入大量的檢測(cè)時(shí)間，與此同時(shí)，也要注重檢測(cè)效率和檢測(cè)結(jié)果精準(zhǔn)性的提升。