莫晗 劉檜 馮超 謝遠(yuǎn)亮，3 王秋雁 李天宇

作者單位：530021 南寧1廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科；2廣西醫(yī)科大學(xué)基因組與個體化醫(yī)學(xué)研究中心；3廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院泌尿外科

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)中最常見的一種惡性腫瘤，其發(fā)病率居惡性腫瘤的第10 位，死亡率居惡性腫瘤的第12 位［1］。近年來，盡管膀胱癌的診療手段有了很大的改進(jìn)，但是膀胱癌患者的生存情況并未得到較大的改善。因此，迫切需要開發(fā)新的個性化治療方案來延長患者的生存期。據(jù)統(tǒng)計，男性的膀胱癌發(fā)病率遠(yuǎn)高于女性，而雄激素可能是誘導(dǎo)這一結(jié)果的重要因素［2］。因此，雄激素及其受體受到了廣泛的關(guān)注。雄激素受體（androgen receptors，AR）屬于核受體超家族［3-4］，其在人體中廣泛分布［5-6］。AR 信號通路可能作為表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）促進(jìn)膀胱癌進(jìn)展的一個重要中介路徑，而雄激素也可以通過AR信號通路調(diào)節(jié)Slug的轉(zhuǎn)錄以促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而促進(jìn)膀胱癌的發(fā)展［7］。然而，AR作為膀胱癌患者分層或輔助診療的指示作用尚未清楚。本研究利用TCGA-BLCA 隊列構(gòu)建膀胱癌AR 相關(guān)基因評分系統(tǒng)，同時通過全轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)和高通量的單細(xì)胞質(zhì)譜流式技術(shù)探討不同AR評分患者的分子特征、腫瘤微環(huán)境的異質(zhì)性特征，以及特征細(xì)胞亞群的潛在作用機制，為膀胱癌個性化治療方法的開發(fā)提供了潛在靶點和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 臨床樣本收集 收集2018年1月至2019年12月在廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科收治的29 例膀胱癌患者的膀胱癌組織樣本。納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴年齡≥18 歲；⑵符合手術(shù)指征，首診膀胱癌且術(shù)前未經(jīng)過放化療或經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切等治療；⑶隨訪資料完整；⑷術(shù)后經(jīng)病理組織學(xué)確診為膀胱癌。排除膀胱腫瘤組織壞死嚴(yán)重或因膀胱腫瘤組織過少而未能取得癌組織者，以及無相關(guān)知情同意書者。總生存期（overall survival，OS）定義為患者從手術(shù)日期到診斷死亡或者最后1次有效隨訪日期。隨訪時間以月為單位，所有患者自出院后6 個月開始采取電話聯(lián)系的方式進(jìn)行隨訪，之后每6個月隨訪一次，最近一次隨訪時間為2023年4月。所有未發(fā)生陽性結(jié)局（死亡）的患者均成功隨訪，無失訪例數(shù)。每個樣本均進(jìn)行質(zhì)譜流式、RNA測序和免疫組織化學(xué)染色檢測。所有患者均已提供書面知情同意書。本研究通過廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理審查委員會批準(zhǔn)（倫理編號：2023-E359-01）。

1.1.2 生物信息學(xué)數(shù)據(jù) 從TCGA 數(shù)據(jù)庫（https：//gdc.cancer.gov/）獲取403例肌層浸潤性膀胱癌（muscleinvasive bladder cancer，MIBC）患者的AR 表達(dá)數(shù)據(jù)及臨床資料。根據(jù)AR表達(dá)量的最優(yōu)截斷值將患者分為高AR 表達(dá)組（277 例）和低AR 表達(dá)組（126 例），采用Log-rank 法比較兩組OS 差異并選擇Wilcoxon 秩和檢驗對兩組的病理分級進(jìn)行比較。從GEO 數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）獲取GSE-13507隊列患者（165 例）的AR 表達(dá)數(shù)據(jù)及臨床資料，同時按照上述TCGA-BLCA 隊列的處理方法比較兩組患者的OS。

1.2 質(zhì)譜流式樣本染色與數(shù)據(jù)分析

膀胱癌組織經(jīng)修剪、解離、切割、過濾、紅細(xì)胞裂解后，制備成單細(xì)胞懸液。取150 萬個細(xì)胞，用順鉑進(jìn)行死細(xì)胞染色、Fc 受體阻斷封閉、胞膜表面標(biāo)志物染色、胞質(zhì)/核標(biāo)志物染色、甲醛固定及細(xì)胞嵌入劑Ir染色，最后經(jīng)清洗后，加入10%的EQ?校準(zhǔn)珠溶液重懸細(xì)胞，于4 ℃條件下保存，待上機檢測。本實驗所用質(zhì)譜流式細(xì)胞儀為美國Fluidigm 公司所生產(chǎn)（型號：Helios 2），檢測指標(biāo)分別為免疫系統(tǒng)指標(biāo)及腫瘤微環(huán)境指標(biāo)。其中免疫系統(tǒng)指標(biāo)包括CD3、CD4、CD7、CD8a、CD11b、CD11c、CD14、CD19、CD20、CD27、CD28、CD33、CD45、CD45RA、CD45RO、CD56、CEACAM-6、CD68、CD95、CD127、CD137、CD152（CTLA-4）、CD163、CD274（PD-L1）、CD278（ICOS）、CD279（PD-1）、TIM-3、EOMES、Foxp3、Granzyme B、HLA-DR、T-bet、TCR、TNF-α。腫瘤微環(huán)境指標(biāo)包括CD13、CD24、CD34、CD44、CD47、CD54、CD90、CD104、CD133、CD166、CD274（PD-L1）、CD326（EpCAM）、CD333（FGFR3）、ALDH、c-Myc、CK6、CK5、ERα、ERβ、Ki67、KLF4、LGR5、MET、MUC1、Nanog、Notch2、OV6、p21、p53、Sox2、Vimentin、CD45。

將質(zhì)譜流式檢測數(shù)據(jù)上傳到Cytobank 網(wǎng)站（http：//www.cytobank.org/），進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘和分析。對上傳的數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控分析和預(yù)處理，設(shè)置所用抗體及金屬標(biāo)簽名稱。在獲取FCS 文件后，用R 軟件對其進(jìn)行降維、歸一化，并導(dǎo)入R 軟件程序包（FlowSOM、cytofexplorer等）對上述檢測指標(biāo)進(jìn)行個性化分析。

1.3 RNA測序

首先，使用TRIzol 試劑盒從組織中提取總RNA，并使用Ribo-Zero rRNA 試劑盒將核糖體RNA（rRNA）從總RNA 中去除。然后，通過對純化的信使RNA（mRNA）逆轉(zhuǎn)錄，構(gòu)建互補DNA（cDNA）文庫并通過PCR 擴增文庫。在Illumina HiSeq 4000 測序儀上測序150 個周期后使用FastQC 軟件對原始測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量進(jìn)行評估。最后，使用Fastp 對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理［8］，使用HISAT2 和StringTie 將處理后的數(shù)據(jù)映射到人類基因組（hg19）［9-10］。本課題的測序工作由北京諾禾致源科技股份有限公司完成，每個樣本的測序深度為8 G。

1.4 基因集富集分析及AR評分的計算

基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）所用軟件版本為GSEA-4.1.0，數(shù)據(jù)集為c5.all.v7.5.1.symbols（https：//www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/index.jsp）。根據(jù)文獻(xiàn)［11］報道中的一個含有8 個AR 相關(guān)基因（AR、NKX3-1、KLK3、CHRNA2、SLC45A3、TARP、NAP1L2 和S100A14）的基因集，利用R 語言軟件（版本號3.6.1）中的基因集變異分析（Gene Set Variation Analysis，GSVA）包計算AR評分（GSVA 包版本號1.42.0），然后將每個患者所得AR 評分?jǐn)?shù)據(jù)及臨床生存數(shù)據(jù)上傳至網(wǎng)絡(luò)在線分析平臺Sangerbox（http：//sangerbox.com/），利用“surv_cutpoint”函數(shù)進(jìn)行最優(yōu)截斷值的計算，并根據(jù)最優(yōu)截斷值將患者分為高AR 評分組及低AR 評分組進(jìn)行后續(xù)分析［12］。

1.5 免疫浸潤分析

通過R 軟件包“IOBR”（版本號：0.99.9）中的CIBERSORT 和EPIC 算法結(jié)合TCGA-BLCA 隊列中的每個樣本的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對其進(jìn)行免疫細(xì)胞浸潤分析，比較高AR評分組和低AR評分組各類免疫細(xì)胞的比例。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

運用R 軟件（3.6.1 版本）及GraphPad Prism 軟件（8.0.1版本）進(jìn)行分析。生存分析采用Kaplan-Meier 法構(gòu)建MIBC 患者的生存曲線，并應(yīng)用log-rank 檢驗進(jìn)行比較。鑒于本研究中的數(shù)據(jù)為非正態(tài)性連續(xù)變量，根據(jù)數(shù)據(jù)分布特點，選擇Wilcoxon 秩和檢驗對兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同AR評分與膀胱癌患者預(yù)后的關(guān)系

TCGA-BLCA 隊列的數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，高AR 表達(dá)患者的OS較AR 低表達(dá)患者差，但差異無顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.104；圖1A）。此外，AR 表達(dá)與膀胱癌的病理分級也無明顯相關(guān)性（P＞0.05；圖1B）。本研究利用GSVA 算法對TCGA-BLCA 隊列進(jìn)行AR 評分，根據(jù)最優(yōu)截斷值（AR 評分≥-0.066 分）將這403 例患者分為高AR 評分組（n=207）和低AR 評分組（n=196），結(jié)果發(fā)現(xiàn)高AR評分組患者的OS明顯低于低AR評分組（P=0.009；圖1C）。

圖1 高AR評分組與低AR評分組組患者的預(yù)后Fig.1 Prognosis of patients in the high AR score group versus the low AR score group

進(jìn)一步利用GEO數(shù)據(jù)庫GSE-13507隊列的165 例膀胱癌患者作為驗證組并對其進(jìn)行AR評分。根據(jù)最優(yōu)截斷值（AR 評分≥0.200分），將患者分為高AR 評分組（n=47）及低AR 評分組（n=118），高AR 評分組患者的OS 明顯比低AR 評分組患者差（P=0.010；圖1D）。將本課題組收集的29 例膀胱癌樣本進(jìn)行AR 評分，并根據(jù)最優(yōu)截斷值（AR 評分≥0.203 分）進(jìn)行分組。結(jié)果顯示，高AR 評分組（n=11）患者的OS 較低AR 評分組（n=18）差，但差異無顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.180；圖1E）。進(jìn)一步分析不同AR 評分與臨床病理特征的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高AR 評分組患者中分期為T3 期及以上的比例更高，而低AR 評分組的患者其臨床分期主要為T2 期，且高AR 評分組患者的膀胱癌分級均為高級別尿路上皮癌。從年齡上看，相比于低AR評分組，高AR 評分組患者的年齡都在55 歲以上，更傾向于年老患者（表1）。

表1 29例膀胱癌患者的臨床信息表Tab.1 Clinical information sheet of 29 bladder cancer patients

2.2 不同AR評分膀胱癌患者的GSEA富集分析

對TCGA-BLCA 隊列進(jìn)行GSEA 分析，結(jié)果顯示，ERBB、VEGF 信、MAPK、WNT 及NF-κB 等信號通路主要在高AR 評分組富集（圖2A）。DNA 分解代謝、mRNA 剪切、卡哈爾體、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶等通路主要在低AR評分組富集（圖2B）。

圖2 TCGA隊列中高AR評分組組及低AR評分組組GSEA富集分析結(jié)果Fig.2 GSEA enrichment analysis for the high AR score group and low AR score group in the TCGA cohort

2.3 不同AR 評分對膀胱癌患者腫瘤免疫微環(huán)境多樣性的影響

為分析高AR 評分組與低AR 評分組患者的腫瘤免疫微環(huán)境異質(zhì)性，利用CIBERSORT 和EPIC 算法對TCGA-BLCA 隊列中的每個樣本進(jìn)行免疫細(xì)胞浸潤分析，結(jié)果顯示，CD4+T 細(xì)胞（P=0.001）、樹突狀細(xì)胞（P＜0.001）和記憶性CD4+T 細(xì)胞（P=0.028）在高AR 評分組中的比例顯著高于低AR評分組（圖3A～C），表明不同AR評分膀胱癌患者的腫瘤微環(huán)境可能存在較大的異質(zhì)性。

圖3 高低AR評分組患者的免疫細(xì)胞亞群多樣性及異質(zhì)性表型Fig.3 Immune cell subpopulation diversity and heterogeneous phenotypes in patients in high and low AR score groups

應(yīng)用質(zhì)譜流式技術(shù)在單細(xì)胞水平精準(zhǔn)分析29 例不同AR評分膀胱癌患者的免疫細(xì)胞，經(jīng)過對高維數(shù)據(jù)的降維和聚類后（圖3D～E），結(jié)果顯示，29 例膀胱癌患者的免疫細(xì)胞可分成15 個免疫細(xì)胞亞群，包括4 個CD4+T 細(xì)胞亞群、4 個CD8+T 細(xì)胞亞群、2 個B 細(xì)胞亞群、1 個NK 細(xì)胞亞群、1 個巨噬細(xì)胞亞群、1 個Th 細(xì)胞亞群、1 個樹突狀細(xì)胞亞群及1 個無法準(zhǔn)確定義的免疫細(xì)胞亞群（圖3G）。在這些具有多樣性表型的免疫細(xì)胞亞群中，4 個CD4+T 細(xì)胞亞群不同程度地表達(dá)免疫檢查點，表現(xiàn)出免疫抑制的狀態(tài)。其中CD4+T 細(xì)胞亞群13 高表達(dá)FOXP3 和免疫檢查點CTLA-4、CD279（PD-1）、CD274（PD-L1），其在高AR評分組的比例顯著高于低AR 評分組（P=0.031）（圖3F），是兩組比較間唯一具有統(tǒng)計學(xué)意義的細(xì)胞亞群，提示CD4+T 細(xì)胞亞群13 可能是一群具有強免疫抑制表型的細(xì)胞亞群。

2.4 不同AR 評分膀胱癌患者腫瘤干樣細(xì)胞亞群的分布

為了精準(zhǔn)分析高AR 評分組和低AR 評分組腫瘤細(xì)胞的多樣性，本研究通過質(zhì)譜流式技術(shù)分析29 例膀胱癌患者癌組織細(xì)胞中32 個腫瘤微環(huán)境標(biāo)記物的表達(dá)情況，并通過數(shù)據(jù)降維和聚類后，發(fā)現(xiàn)癌組織中的249 389 個細(xì)胞可分成20 個不同的細(xì)胞亞群，且這些細(xì)胞亞群在高AR 評分組和低AR 評分組中的分布比例提示兩組的腫瘤微環(huán)境具有較大的異質(zhì)性（圖4A-B）。通過對各細(xì)胞亞群的標(biāo)志物進(jìn)行分析，結(jié)果（圖4C）發(fā)現(xiàn)20個細(xì)胞亞群包括8個腫瘤上皮細(xì)胞亞群（CD326+CD45-/low）、2個免疫細(xì)胞亞群（CD326-/lowCD45+）以及10 個同時具有腫瘤上皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞特征的細(xì)胞亞群（CD326+CD45+）。其中腫瘤干樣細(xì)胞亞群13 高表達(dá)免疫檢查點PD-L1、腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物OV6。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，腫瘤干樣細(xì)胞亞群13在高AR評分組中的比例顯著高于低AR 評分組（P=0.008）（圖4D），同時是兩組間最具統(tǒng)計學(xué)差異的細(xì)胞亞群，表明腫瘤干樣細(xì)胞亞群13 可能參與了腫瘤干性的維持及免疫抑制微環(huán)境的形成。

圖4 高AR評分組及低AR評分組患者的腫瘤微環(huán)境圖譜Fig.4 Tumour microenvironment mapping in patients in the high AR score group and low AR score group

3 討論

眾多證據(jù)表明，雄激素及其受體在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用［13-14］。但AR對膀胱癌患者的分層能力或輔助診療作用目前尚未明確。為了評估AR 對膀胱癌患者預(yù)后判斷的潛能，本研究分析了TCGA-BLCA 隊列中403 例MIBC 患者AR 的表達(dá)情況，結(jié)果與文獻(xiàn)［15］報道相一致，高AR 表達(dá)與低AR 表達(dá)患者的預(yù)后差異無統(tǒng)計學(xué)意義，且AR 的表達(dá)水平與膀胱癌的病理分級無明顯相關(guān)性。為了進(jìn)一步探究AR 與膀胱癌預(yù)后的相關(guān)性，本研究根據(jù)文獻(xiàn)［11］報道的一個與AR 相關(guān)的基因集，基于TCGA-BLCA隊列構(gòu)建了膀胱癌AR 相關(guān)基因評分系統(tǒng)，并在GSE-13507 隊列和29 例自有膀胱癌臨床樣本中進(jìn)行驗證，結(jié)果顯示，所有的隊列均呈現(xiàn)出高AR評分組患者較低AR 評分組患者預(yù)后更差的趨勢。雖然29 例膀胱癌臨床樣本中高AR 評分組和低AR 評分組患者的OS差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但高AR 評分組患者的臨床分期更晚，病理分級更高，提示高AR評分可能與膀胱癌患者不良預(yù)后密切相關(guān)。

為了探究高AR 評分組和低AR 評分組潛在的作用機制，本研究對TCGA-BLCA 隊列進(jìn)行GSEA 分析，結(jié)果高AR評分組主要被富集在WNT、TGF-β、MAPK及ERBB等信號通路，低AR評分組主要被富集在mRNA剪切、卡哈爾體、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶等信號通路。這表明高AR 評分組和低AR 評分組患者的腫瘤進(jìn)展分子機制不同。

腫瘤細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境之間不斷的相互作用在腫瘤的起始、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移和治療的反應(yīng)中起著關(guān)鍵性的作用［16-17］。單細(xì)胞質(zhì)譜流式技術(shù)是近年來備受關(guān)注的腫瘤異質(zhì)性及腫瘤微環(huán)境研究的“明星技術(shù)”，它可以實現(xiàn)同時對單細(xì)胞幾十種蛋白參數(shù)的檢測［18］，目前已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于腫瘤微環(huán)境的研究［19］。為了揭示兩組患者的腫瘤微環(huán)境的異質(zhì)性，本研究應(yīng)用質(zhì)譜流式技術(shù)在單細(xì)胞水平精準(zhǔn)分析這29 例膀胱癌患者的免疫細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境的多樣性表型及異質(zhì)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了一群高表達(dá)FOXP3，免疫檢查點CTLA4、CD279（PD-1）、CD274（PD-L1）的CD4+T細(xì)胞亞群在高AR 評分組中富集；同時還發(fā)現(xiàn)一群高表達(dá)腫瘤干性相關(guān)標(biāo)志物OV6、免疫檢查點PD-L1 的腫瘤干樣細(xì)胞亞群在高AR 評分組中富集，且該細(xì)胞亞群與不良預(yù)后密切相關(guān)。據(jù)文獻(xiàn)報道，PD-1以及PD-L1是非常重要的免疫檢查點，腫瘤細(xì)胞可以利用其進(jìn)行免疫逃逸［20］。而免疫檢查點抑制劑可以通過阻斷免疫檢查點信號通路來促進(jìn)腫瘤免疫細(xì)胞活化以消除腫瘤細(xì)胞［21］。在國內(nèi)的膀胱癌診斷治療指南中，免疫檢查點抑制劑也被推薦作為對于不適合順鉑且PD-L1 高表達(dá)患者的一線治療方案［22］。免疫抑制性CD4+T 細(xì)胞亞群13 以及具有免疫抑制表型的腫瘤干樣細(xì)胞亞群13 在高AR 評分組中的顯著富集表明高AR 評分組患者的腫瘤微環(huán)境免疫抑制狀態(tài)更嚴(yán)重，其免疫治療響應(yīng)可能更高，更適合進(jìn)行免疫治療，也提示AR 及其相關(guān)信號通路可能是未來膀胱癌個體化診療的一個重要靶點，值得我們繼續(xù)深入研究。

綜上所述，本研究基于一個8 個基因組成的AR基因集構(gòu)建了AR 評分系統(tǒng)，該評分系統(tǒng)可對不同預(yù)后的膀胱癌患者進(jìn)行分層，高AR 評分組患者的預(yù)后較低AR 評分組患者差。同時，本研究揭示了不同AR 評分患者的分子特征和腫瘤微環(huán)境異質(zhì)性，為膀胱癌個性化治療方案的開發(fā)提供了潛在的靶點和理論依據(jù)。但是本研究存在一定的局限性：⑴本研究的樣本量較小，需要后續(xù)多中心、大樣本進(jìn)行深入研究；⑵高AR 評分組的分子機制需要進(jìn)行細(xì)胞和動物實驗的驗證。