李 恒, 張祥琴,2, 田厚軍, 陳藝欣, 林 碩, 魏 輝,2, 陳 勇,2

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/福建省作物有害生物監(jiān)測(cè)與治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部福州作物有害生物科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站,福建福州 350013;2.福建農(nóng)林大學(xué)閩臺(tái)作物有害生物生態(tài)防控國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建福州 350002)

黃胸薊馬(ThripshawaiiensisMorgan)別稱(chēng)香蕉花薊馬、夏威夷薊馬,隸屬纓翅目(Thysanoptera)鋸尾亞目(Terebrantia)薊馬科(Thripidae),是一種重要的棲花害蟲(chóng)[1]。該薊馬起源于環(huán)太平洋地區(qū),當(dāng)前廣泛分布于亞洲熱帶、亞熱帶和北美南部[2],在我國(guó)的福建、海南、廣西、臺(tái)灣、云南、廣東等多個(gè)省均有分布[3]。黃胸薊馬環(huán)境適應(yīng)性較強(qiáng),寄主范圍廣泛,能危害香蕉、芒果等多種經(jīng)濟(jì)作物[4-8]。該蟲(chóng)主要取食寄主嫩葉、嫩果并產(chǎn)卵于花蕾和幼果中[9-10],危害后的果皮呈現(xiàn)黑色斑點(diǎn),影響坐果率和品質(zhì)[11]。由于黃胸薊馬世代周期短、隱匿性強(qiáng),危害初期很難被察覺(jué)[12-13],當(dāng)前國(guó)內(nèi)外防治黃胸薊馬最有效的方法是使用化學(xué)藥劑。但伴隨著農(nóng)藥的長(zhǎng)期使用,該蟲(chóng)的抗藥性也逐漸增強(qiáng),很難達(dá)到理想的防治效果[14-17]。

嗅覺(jué)系統(tǒng)在昆蟲(chóng)選擇寄主、捕食、產(chǎn)卵、避敵等生命活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用,嗅覺(jué)識(shí)別過(guò)程中需要化學(xué)感受蛋白(chemosensory proteins,簡(jiǎn)稱(chēng)CSPs)、氣味結(jié)合蛋白(odorant binding proteins,簡(jiǎn)稱(chēng)OBPs)、氣味受體(olfactory receptors,簡(jiǎn)稱(chēng)ORs)、氣味降解酶(odorant degrading enzymes,簡(jiǎn)稱(chēng)ODEs)等嗅覺(jué)蛋白的參與[18-21]。CSPs別稱(chēng)感受器官蛋白,是一類(lèi)可溶性結(jié)合蛋白,主要存在于昆蟲(chóng)化學(xué)感受器官中,承擔(dān)篩選、識(shí)別、運(yùn)載氣味化合物或信息素分子,并傳遞給嗅覺(jué)受體的角色,在嗅覺(jué)識(shí)別的第1步生理反應(yīng)中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[22]。1994年CSPs首次被發(fā)現(xiàn)鑒定于黑腹果蠅(DrosophilamelanogasterMeigen)的觸角中,這些可溶性的蛋白分別被命名為A-10和OS-D (olfactory specific-D)[23]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展,許多昆蟲(chóng)CSPs相繼被克隆鑒定,發(fā)現(xiàn)其都具有4個(gè)半胱氨酸殘基的典型特征[24]。CSPs廣泛存在于昆蟲(chóng)的各個(gè)組織部位,如MbraCSPA6在甘藍(lán)夜蛾的觸角、下顎須及喙中均有表達(dá)[25]。昆蟲(chóng)的CSPs除了識(shí)別、運(yùn)輸化學(xué)感受器周?chē)h(huán)境中具有親脂性的配體,也參與調(diào)節(jié)昆蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育[26]、免疫作用[27-28]、種群識(shí)別[29]等。

本研究在分析黃胸薊馬觸角轉(zhuǎn)錄組的基礎(chǔ)上,對(duì)黃胸薊馬化學(xué)感受蛋白基因ThawCSP1進(jìn)行克隆、鑒定,然后利用MEGA 7.0軟件以鄰接法構(gòu)建ThawCSP1系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),最后利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法明確該基因在黃胸薊馬不同組織和各個(gè)發(fā)育階段mRNA水平的表達(dá)模式,并利用免疫熒光標(biāo)記和免疫電鏡技術(shù)觀察ThawCSP1蛋白在黃胸薊馬觸角的表達(dá)情況,研究結(jié)果為進(jìn)一步探討黃胸薊馬ThawCSP1的生理功能提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx(chóng)

黃胸薊馬來(lái)源于福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所蔬菜種植大棚,以四季豆飼養(yǎng)在人工氣候箱(MGC-350HP-2,上海一恒科技儀器有限公司)中。飼養(yǎng)條件為光—暗周期14 h—10 h,溫度為 (25±1) ℃,相對(duì)濕度為(65±5)%。

1.2 ThawCSP1開(kāi)放閱讀框的克隆與鑒定

在分析黃胸薊馬轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上,通過(guò)生物信息學(xué)分析,獲得ThawCSP1開(kāi)放閱讀框(open reading frame,ORF)序列。采用Trizol(Ambion)法提取黃胸薊馬總RNA,然后利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京全式金生物科技有限公司)將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)黃胸薊馬ThawCSP1基因開(kāi)放閱讀框序列,利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物(表1),以反轉(zhuǎn)錄成的cDNA為模板擴(kuò)增目的片段。PCR反應(yīng)體系：cDNA模板1 μL,2×PCR buffer 12.5 μL,dNTPs(2.0 mmol/L)5 μL,正反向引物各 1 μL,KOD FX 0.5 μL,ddH2O 4 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 預(yù)變性 2 min;98 ℃變性10 s,55 ℃退火30 s,68 ℃延伸30 s,反應(yīng)30個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸 10 min(Toyobo code：KFX-101)。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)獲得的PCR產(chǎn)物,利用凝膠回收試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]回收純化檢測(cè)正確的目的條帶,再將純化的PCR產(chǎn)物連接pEASY-T1載體并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5α中,挑選陽(yáng)性克隆菌落送福州鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司測(cè)序。

表1 本試驗(yàn)所用引物

1.3 ThawCSP1序列特性及系統(tǒng)進(jìn)化分析

使用DNAMAN軟件將黃胸薊馬ThawCSP1基因核苷酸序列翻譯成氨基酸序列;采用Expasy在線工具(http://web.Expasy.org/protparam)預(yù)測(cè)該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)、分子量等信息,使用SignalP 5.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測(cè)ThawCSP1的信號(hào)肽,使用Conserved domains預(yù)測(cè)ThawCSP1序列的保守結(jié)構(gòu)域。

利用NCBI(national center for biotechnology information)的Blastp工具對(duì)ThawCSP1氨基酸序列進(jìn)行同源相似性比對(duì),選取除ThawCSP1外,來(lái)自纓翅目、蜚蠊目、直翅目、半翅目、鞘翅目29個(gè)昆蟲(chóng)的化學(xué)感受蛋白,利用MEGA 7.0軟件對(duì)序列進(jìn)行多重比對(duì),選用鄰接法(neighbor joining)構(gòu)建ThawCSP1系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.4 ThawCSP1表達(dá)譜分析

選取300頭初羽化1 d的黃胸薊馬成蟲(chóng),用CO2將其麻醉并置于PBS緩沖液中,分別收集解剖鏡下取出的頭、胸、腹、足、觸角組織,RT-qPCR分析ThawCSP1在不同組織中的表達(dá)譜;同時(shí)挑選1齡若蟲(chóng)、2齡若蟲(chóng)、蛹和羽化1、5、10、15 d的黃胸薊馬成蟲(chóng)各100頭,分析ThawCSP1在各個(gè)發(fā)育階段mRNA水平的相對(duì)表達(dá)量。樣品總RNA的提取采用Trizol法,然后利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京全式金生物科技有限公司)將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,保存于-80 ℃冰箱備用。

使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)黃胸薊馬ThawCSP1基因和ThawActin基因(OQ715282)的 RT-qPCR 引物(表1)。RT-qPCR反應(yīng)體系：cDNA模板1 μL,正反向引物各0.5 μL,SYBR預(yù)混液(TakaRa Code：RR820)10 μL,ddH2O 8 μL。反應(yīng)采用標(biāo)準(zhǔn)兩步法：95 ℃ 預(yù)變性30 s;95 ℃變性 5 s,62 ℃退火 15 s,40個(gè)循環(huán)。

使用2-ΔΔCT法計(jì)算黃胸薊馬各個(gè)發(fā)育階段和不同組織中ThawCSP1的相對(duì)表達(dá)量。各個(gè)發(fā)育階段ThawCSP1的相對(duì)表達(dá)量以羽化10 d黃胸薊馬的ThawCSP1表達(dá)量為標(biāo)準(zhǔn)參量,不同組織ThawCSP1的相對(duì)表達(dá)量以該基因在黃胸薊馬腹部中的表達(dá)量為標(biāo)準(zhǔn)參量。

1.5 免疫熒光觀察ThawCSP1在黃胸薊馬觸角中的表達(dá)

為從蛋白水平定性分析ThawCSP1在黃胸薊馬觸角中的表達(dá)情況,首先在室溫條件下,將黃胸薊馬成蟲(chóng)放入4%多聚甲醛中固定2 h,然后用 0.01 mol/L PBS漂洗2次,每次5 min;2% Triton X-100 滲透24 h,0.01 mol/L PBS漂洗2次,每次 5 min;轉(zhuǎn)入脫色液[100%乙醇 ∶30% H2O2=2 ∶1(體積比)]脫色2 h,0.01 mol/L PBS漂洗2次,每次 5 min;加入異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)偶聯(lián)的ThawCSP1抗體(筆者所在實(shí)驗(yàn)室制備的多克隆抗體),37 ℃條件下避光放置2 h;0.01 mol/L PBS漂洗3次,每次5 min;甘油封片后,共聚焦顯微鏡(Leica SP8)下觀察結(jié)果。

1.6 免疫電鏡觀察ThawCSP1在黃胸薊馬觸角的表達(dá)

取黃胸薊馬成蟲(chóng)觸角組織放入2%多聚甲醛和2%戊二醛溶液中固定2 h,用0.1 mol/L PBS(pH值7.2)漂洗樣品4次,每次10 min;隨后于4 ℃進(jìn)行乙醇梯度脫水,濃度分別為30%、50%,每個(gè)梯度各處理30 min,接著于-20 ℃低溫脫水,乙醇濃度分別為50%、70%、90%,每個(gè)梯度脫水1 h;在-20 ℃下,分別用含有30%、70%、100% LR GLOD包埋劑的乙醇溶液進(jìn)行滲透,每個(gè)濃度處理2 h,最后用0.1% BENZIL催化的LR GOLD包埋劑繼續(xù)滲透 6 h;隨后于-20 ℃條件下紫外聚合96 h,超薄切片機(jī)切片并收集在鎳網(wǎng)上;以實(shí)驗(yàn)室制備的黃胸薊馬ThawCSP1多克隆抗體為一抗,二抗為膠體金(12 nm)偶聯(lián)羊抗鼠IgG,標(biāo)記后用透射電子顯微鏡(HitachiH-7700,日本)觀察、拍照。從蛋白水平定性分析ThawCSP1在黃胸薊馬觸角的表達(dá)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃胸薊馬ThawCSP1的克隆鑒定與分析

通過(guò)分析黃胸薊馬觸角轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)黃胸薊馬ThawCSP1-ORF引物,以黃胸薊馬總RNA反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板,擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物大小在400 bp與500 bp之間(圖1)。測(cè)序結(jié)果顯示,擴(kuò)增的序列為405 bp(GenBank登錄號(hào)：OQ730210)(圖2)。利用DNAMAN軟件分析可知,ThawCSP1-ORF基因編碼134個(gè)氨基酸,預(yù)測(cè)蛋白分子量為15.181 ku,N末端的1～19位氨基酸為信號(hào)肽區(qū)域,等電點(diǎn)為8.50,含有4個(gè)保守的半胱氨酸,符合CSP蛋白的典型特征C1-X6-8-C2-X16-21-C3-X2-C4(圖2)。

將黃胸薊馬ThawCSP1氨基酸序列與其他12種昆蟲(chóng)29個(gè)CSPs通過(guò)MEGA 7.0鄰接法,以步長(zhǎng)值1 000構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。由圖3可知, 該系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可分為兩大支,第1支有27個(gè)CSPs,分布在10個(gè)物種中,第2支有3個(gè)CSPs,分布在3個(gè)物種中,其中ThawCSP1聚在第1支上,與纓翅目西花薊馬CSP(AEP27186.1)、花薊馬CSP1和牛角花齒薊馬CSP1親緣關(guān)系最近,氨基酸序列相似性分別為79.55%、80.30%和76.52%。

2.2 黃胸薊馬ThawCSP1基因表達(dá)譜分析

以黃胸薊馬羽化10 d成蟲(chóng)的ThawCSP1表達(dá)量為標(biāo)準(zhǔn)參量,比較ThawCSP1基因在各個(gè)發(fā)育階段的相對(duì)表達(dá)量,結(jié)果顯示ThawCSP1在成蟲(chóng)1、5、10 d的相對(duì)表達(dá)量最高,其次是1齡若蟲(chóng)、2齡若蟲(chóng)和成蟲(chóng)15 d,其相對(duì)表達(dá)量為標(biāo)準(zhǔn)參量的0.55～0.59倍;蛹期ThawCSP1基因表達(dá)量最低,僅為標(biāo)準(zhǔn)參量的0.11倍(圖4-A)。

以黃胸薊馬腹部ThawCSP1表達(dá)量為標(biāo)準(zhǔn)參量,比較ThawCSP1基因在黃胸薊馬不同組織部位的相對(duì)表達(dá)量,結(jié)果顯示ThawCSP1基因在黃胸薊馬觸角和足部的相對(duì)表達(dá)量最高,是腹部表達(dá)量的222.33倍和181.60倍;頭部的相對(duì)表達(dá)量為腹部的79.03倍;腹部的相對(duì)表達(dá)量最低(圖4-B)。

2.3 黃胸薊馬ThawCSP1蛋白在觸角的表達(dá)

利用免疫熒光標(biāo)記技術(shù)觀察ThawCSP1在黃胸薊馬觸角中的表達(dá),由圖5-A可知,在觸角鞭節(jié) Ⅰ～Ⅲ節(jié)均能觀察到較強(qiáng)的熒光信號(hào),表明ThawCSP1蛋白在黃胸薊馬觸角中高表達(dá)。進(jìn)一步通過(guò)免疫電鏡技術(shù)觀察ThawCSP1在觸角感器的表達(dá),由圖 5-B 可知,在黃胸薊馬觸角錐形感器上分布大量的膠體金顆粒(白色箭頭),表明ThawCSP1蛋白在黃胸薊馬觸角錐形感器上大量表達(dá)。

3 討論與結(jié)論

昆蟲(chóng)嗅覺(jué)相關(guān)蛋白基因廣泛分布于昆蟲(chóng)的不同組織和各個(gè)發(fā)育階段中,分析基因在昆蟲(chóng)不同發(fā)育階段和各個(gè)組織的表達(dá)模式是預(yù)測(cè)基因功能的一個(gè)重要手段[20]。CSPs目前僅在節(jié)肢類(lèi)動(dòng)物(arthropods)和多足類(lèi)動(dòng)物(myriapods)中有報(bào)道,一般100～120個(gè)氨基酸,蛋白可溶且未被報(bào)道有翻譯后修飾,在4個(gè)保守的半胱氨酸之間形成2個(gè)二硫鍵(C1-X6-8-C2-X16-21-C3-X2-C4)[30]。目前節(jié)肢動(dòng)物CSPs的研究較多,廣泛分布于昆蟲(chóng)體內(nèi)各個(gè)組織,除了嗅覺(jué)器官外,在頭、胸、腹部、足、睪丸、卵巢等非嗅覺(jué)組織中也有表達(dá)[18,30]。RT-qPCR 結(jié)果表明,ThawCSP1在黃胸薊馬觸角和足部表達(dá)量最高,在頭部也有較多表達(dá)(圖4-B)。由于觸角和足是昆蟲(chóng)最為重要的化學(xué)感受器官,在昆蟲(chóng)尋找寄主、產(chǎn)卵場(chǎng)所、配偶等多種生命活動(dòng)過(guò)程中發(fā)揮作用[30],據(jù)此筆者所在課題組推測(cè)ThawCSP1可能參與了黃胸薊馬對(duì)寄主植物的識(shí)別、定位以及感受化學(xué)機(jī)械刺激等生命活動(dòng)。此外,ThawCSP1在黃胸薊馬的若蟲(chóng)期和成蟲(chóng)期相對(duì)表達(dá)量較高,在蛹期表達(dá)量最低(圖4-A)。由于黃胸薊馬在蛹期無(wú)取食等生命活動(dòng),因此ThawCSP1基因在蛹期低表達(dá)進(jìn)一步證明ThawCSP1參與了黃胸薊馬多種生命活動(dòng),具體功能還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

比較分析近緣物種間的CSPs有助于了解昆蟲(chóng)對(duì)不同生態(tài)位的適應(yīng)及其進(jìn)化關(guān)系[30]。據(jù)報(bào)道,花薊馬、西花薊馬和牛角花齒薊馬分別有6、8、9個(gè)CSP基因[31-32],由于花薊馬和西花薊馬部分CSP基因序列數(shù)據(jù)暫未釋放,因此本研究選擇3個(gè)西花薊馬CSP、2個(gè)花薊馬CSP、9個(gè)牛角花齒薊馬CSP以及其他15個(gè)昆蟲(chóng)CSP蛋白序列開(kāi)展系統(tǒng)發(fā)育分析。ThawCSP1與西花薊馬CSP(AEP27186.1)、花薊馬CSP1和牛角花齒薊馬CSP1蛋白序列同源性在76%以上(圖3),推測(cè)這4個(gè)CSP基因可能具有類(lèi)似的構(gòu)象與功能。此外,ThawCSP1與其他11個(gè)薊馬CSPs的親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn),暗示薊馬CSPs蛋白功能的多樣性。

觸角作為昆蟲(chóng)主要的嗅覺(jué)器官,分布有大量的感受器,在昆蟲(chóng)識(shí)別過(guò)程中起著重要的作用[33]。免疫熒光技術(shù)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理,先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光基團(tuán),再用這種熒光抗體(或抗原)作為探針檢測(cè)細(xì)胞或組織內(nèi)相應(yīng)的抗原(或抗體),能直觀地了解相應(yīng)的蛋白在細(xì)胞或組織中的表達(dá)情況[34]。本研究利用實(shí)驗(yàn)室制備的黃胸薊馬ThawCSP1蛋白多克隆抗體,成功觀察到ThawCSP1蛋白在黃胸薊馬成蟲(chóng)觸角的表達(dá)情況(圖5-A)。此外,膠體金免疫電鏡技術(shù)是將膠體金標(biāo)記在抗原和抗體結(jié)合的各部位,在電鏡下根據(jù)黑色圓點(diǎn)狀金顆粒的分布情況,從而精確定位抗原(目的蛋白)[35]。免疫電鏡結(jié)果顯示ThawCSP1在黃胸薊馬成蟲(chóng)期的觸角錐形感器中大量表達(dá)(圖 5-B),這為進(jìn)一步研究ThawCSP1蛋白的功能提供了試驗(yàn)依據(jù)。

綜上所述,本研究首次克隆鑒定了黃胸薊馬的ThawCSP1基因,并研究了該基因在黃胸薊馬生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的時(shí)空表達(dá),為進(jìn)一步研究黃胸薊馬的CSPs功能提供數(shù)據(jù)參考,并為制定薊馬類(lèi)害蟲(chóng)防治策略提供理論依據(jù)。