王春瑤 雷曉錦 劉中原

（林木遺傳育種國家重點實驗室，東北林業(yè)大學，哈爾濱 150040）

1973 年，在牛胸腺細胞中第一次發(fā)現(xiàn)了1 種在聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）中泳動速度很快的蛋白——高遷移率族蛋白（high mobility group，HMG）［1］。HMG 蛋白根據(jù)其DNA 結(jié)構(gòu)特點分成3 組：HMGA、HMGB 和HMGN［2］。其中，HMGB 存在數(shù)量最多，平均每10～15 個核小體中含有1 個HMGB 分子［3］，HMGA 主要分布在早期胚胎組織中，HMGN廣泛分布于細胞核［4］。

HMGB 是一類存在于真核生物中且包含1 個由70～80 個氨基酸組成的高度保守結(jié)構(gòu)域（HMGbox）的功能蛋白。通常HMGB 可以通過修飾或改變?nèi)旧|(zhì)或DNA 的結(jié)構(gòu)，使不同種類的蛋白質(zhì)分子形成大分子復合物來調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，從而在動、植物中參與多種生物途徑發(fā)揮不同生物學功能［5］。

已有報道發(fā)現(xiàn)，在動物中存在與腫瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移相關(guān)的HMGB基因。當小鼠HMGB1基因被敲除后，會導致其生命力急速衰退，在出生后不久就死亡，說明HMGB 蛋白在維持小鼠的生命活動中發(fā)揮重要作用［6］。與此同時，發(fā)現(xiàn)HMGB與肝癌的形成和發(fā)展有關(guān)，當小鼠HMGB1的表達量降低時，會抑制肝癌細胞的增殖能力［7］。

植物中，HMGB 蛋白已陸續(xù)在擬南芥（Arabidopsis thaliana）［8］、水稻（Oryza sativa）［9］、玉米（Zea mays）［10］、裂葉牽牛（Ipomoea nil）［10］、黃瓜（Cucumis sativus）［10］和豌豆（Pisum sativum）［11］等中被鑒定與分離，隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)HMGB 是植物生命活動中必不可少的一類功能蛋白。如擬南芥AtHMGB15 可通過與花粉轉(zhuǎn)錄因子AGL66 和AGL104 發(fā)生作用，進而調(diào)控花粉管的生長發(fā)育［12］。在牽?；ㄖ?，PnHMG1基因的表達與光周期的變化息息相關(guān)，主要在牽牛花的開花過程中發(fā)揮作用［10］。此外，HMGB基因在植物抵御逆境脅迫的過程中同樣扮演著關(guān)鍵的角色。如在擬南芥中，當受到干旱和鹽脅迫時，AtHMGB2和AtHMGB3的 表 達 量 顯 著下 調(diào)［13］。AtHMGB1和AtHMGB2的過表達都能使高鹽環(huán)境下的種子萌發(fā)及生長受阻；在冷處理下，AtHMGB2、AtHMGB3和AtHMGB4的表達量顯著上調(diào)［14］。在高溫和干旱等非生物脅迫下，水稻OsHMGB3基因的表達被顯著誘導，OsHMGB3的過表達極大地提高了水稻對滲透脅迫的抵抗能力［9］。在木本植物中僅對白樺（Betula platyphylla）進行了研究，如過表達BpHMG6能顯著增強白樺對高鹽環(huán)境的耐受性［15］。

林木具有保持水土、減輕溫室效應和凈化空氣等生態(tài)功能，在保持陸地生態(tài)平衡中起著關(guān)鍵的作用。楊樹是我國減少土地荒漠化，退耕還林的優(yōu)良樹種之一［16］，而山新楊（Populus davidiana×P.bolleana）作為山楊（P.davidiana）與新疆楊（P.albavar.pyramidalis）的雜交后代，憑借生長迅速，適應能力強，抗逆性好，防風固沙等性狀，成為了我國優(yōu)良的速生造林樹種［17-18］。本研究從山新楊中通過對其序列特征的分析鑒定了 7 條PdbHMGs基因，并對這7個基因逆境脅迫后的表達模式進行了分析，為研究該家族在非生物脅迫下的功能奠定基礎(chǔ)。同時，為楊樹抗逆基因工程育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料及處理方法

選取長勢一致、狀態(tài)優(yōu)良的山新楊組培苗，待其生長至5 cm 左右時移栽到V（泥炭土）∶V（蛭石）=3∶1 的混合基質(zhì)中，花盆規(guī)格為11 cm×10 cm，環(huán)境條件為光照14 h/黑暗10 h，平均溫度為（23±1）℃、相對濕度為60%～70%、光照強度為400 μmol·m-2·s-1的溫室中培養(yǎng)。待株高約為10 cm 時進行脅迫處理。分別用200 mmol·L-1NaCl、20%PEG6000、150 μmol·L-1CdCl2和100 μmol·L-1ABA 進行根部澆灌處理，每個托盤中澆2 L處理液，每2天處理1次。以清水澆灌的山新楊苗為對照，每個處理重復3次。在處理3、6、9、12、24、48 h后，分別取地上部分葉和地下部分根，經(jīng)液氮速凍后，保存在-80 ℃用于后續(xù)試驗。

1.2 山新楊PdbHMGs基因生物信息學分析

在山新楊基因組中通過擬南芥同源比對找到7條PdbHMGs基因的氨基酸序列；利用在線軟件GSDS2.0（http：//gsds.gao-lab.org/）分析PdbHMGs基因的內(nèi)含子-外顯子結(jié)構(gòu)［19］；利用Protparam（http：//web/expasy/org/protparam/）分析獲得山新楊PdbHMGs基因編碼蛋白的相對分子質(zhì)量和理論等電點等［20］。使用Expasy-Protscale（http：//web.expasy.org/cgi-bin/protscale/）預測PdbHMG 蛋白的親水性［21］。通過在線 軟 件CELLO（http：//cello.life.nctu.edu.tw/）對PdbHMG蛋白進行亞細胞定位預測［22］。利用MEME（https：//meme-suite.org/meme/tools/meme）在線軟件分析了PdbHMG蛋白的保守基序，并通過TBtools進行可視化處理［23］。通過擬南芥信息資源數(shù)據(jù)庫TAIR網(wǎng)站（http：//www.arabidopsis.org/）［24］查找出17條擬南芥AtHMGs蛋白序列，白樺中報道有11條BpHMGs 蛋白［15］，BpHMGs 蛋白序列下載自Phytozome（https：//phytozome-next.jgi.doe.gov/，Betula platyphylla v1.1），通過MEGA 6.0將這17個AtHMGs蛋白序列和11個BpHMGs蛋白與山新楊PdbHMGs蛋白序列進行系統(tǒng)進化分析，使用鄰接法Neighbor-Joining（NJ）構(gòu)建進化樹，Bootstrap參數(shù)設置為1 000［25］。利用NCBI 的Conserve Domains（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）預測PdbHMG蛋白的保守結(jié)構(gòu)域［25］，并運用BioEdit 軟件將山新楊PdbHMGs蛋白進行多序列比對分析。

1.3 山新楊PdbHMGs基因啟動子區(qū)順式作用元件分析

在山新楊基因組中查找獲得PdbHMG家族基因起始密碼子上游約2 000 bp 的序列作為啟動子區(qū)。利用Plantcare 網(wǎng)站（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html）進行順式作用元件預測分析［26］。

1.4 實時熒光定量RT-PCR

使用CTAB 法提取不同脅迫處理下山新楊葉和根的總RNA。取1 μg 總RNA 進行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄反應體系和操作參照李亞博［27］的方法。將所有反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA 用作實時熒光定量RT-PCR 反應模板。選擇內(nèi)參基因Pdbactin（基因登錄號：ON357379）作為對照，定量引物序列如下（表1）。使用伯樂公司生產(chǎn)的OpticonMonitor 2 熒光定量PCR 儀進行qRT-PCR 實驗，qRT-PCR 的反應體系及程序同李亞博［27］。為確保實驗結(jié)果的重現(xiàn)性，qRT-PCR 進行3次重復。利用2-△△Ct方法［28］對基因的相對表達量進行分析，圖中所有基因的表達水平都進行了log2轉(zhuǎn)化。

表1 實時熒光定量RT-PCR引物序列Table 1 The primer sequences of real-time quantitative RT-PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 山新楊PdbHMGs基因的獲得

通過擬南芥同源查找得到7 條山新楊PdbHMGs基因（命名為PdbHMG1～7），進一步序列比對發(fā)現(xiàn)這7 個基因具有完整的開放讀碼框（ORF）。開放讀碼框長度為456～2 004 bp，編碼的氨基酸數(shù)量在151～667。預測蛋白相對分子質(zhì)量為16.72～75.54 kDa，理論等電點（pI）為5.35～9.36。亞細胞定位的預測結(jié)果顯示7 個PdbHMGs 蛋白除PbdHMG6 預測定位于細胞質(zhì)，其余6 個蛋白均定位在細胞核（表2）。分析PdbHMGs基因的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)7 個PdbHMGs基因都包含多個內(nèi)含子。其中，PdbHMG6包含的內(nèi)含子數(shù)最多（18 個），其余幾個PdbHMGs基因包含的內(nèi)含子數(shù)在5～7 個（圖1）。對PdbHMG 蛋白的親疏水性進行了預測分析，由圖2 可知，所有PdbHMG 蛋白均為親水性蛋白。

圖1 山新楊PdbHMGs家族基因內(nèi)含子-外顯子結(jié)構(gòu)Fig.1 Exon-intron structure of PdbHMGs genes

圖2 山新楊PdbHMG蛋白親水性Fig.2 Hydrophilic analysis of PdbHMG proteins

表2 山新楊7個PdbHMGs基因序列特征Table 2 Sequence characteristics of 7 PdbHMGs in Populus davidiana×P. bolleana

2.2 PdbHMG 蛋白多序列比對和系統(tǒng)進化樹分析

擬南芥AtHMGs 分為HMGA 和HMGB 2 個亞家族，所有山新楊PbdHMGs基因均與擬南芥的HMGB親緣關(guān)系更近，均聚在HMGB亞家族（圖3）。保守結(jié)構(gòu)域分析和多序列比對結(jié)果顯示，所有PbdHMG 蛋白均含有1 個HMG-box 保守結(jié)構(gòu)域（圖4），其中PdbHMG1和PdbHMG2相似度更高（圖5）。

圖3 山新楊PdbHMGs與擬南芥AtHMGs、白樺BpHMGs成員的系統(tǒng)進化關(guān)系Fig.3 Phylogenetic relationship among PdbHMGs，AtHMGs with BpHMGs

圖4 山新楊PdbHMGs蛋白保守結(jié)構(gòu)域Fig.4 Conserved domain of PdbHMGs protein

圖5 PdbHMGs蛋白HMG-box結(jié)構(gòu)域Fig.5 HMG-box domain of PdbHMGs protein

利用在線網(wǎng)站MEME［23］對山新楊PdbHMG 家族蛋白的保守基序進行分析。結(jié)果顯示，7個PdbHMG 蛋白的HMG-box 保守結(jié)構(gòu)域均包含Motif1 和Motif2。此外，PdbHMG3、PdbHMG4 和PdbHMG5除包含Motif1 和Motif2 外，還包含Motif 3、4、6、8，且Motif 位置分布相似，推測PdbHMG家族基因編碼的蛋白在具有保守性的同時，也會在功能上存在多樣性（圖6）。

圖6 PdbHMG家族蛋白保守基序分析Motif 1～10用不同的顏色表示，Motif 1～10序列展示在下方Fig.6 The protein conserved motif analysis of PdbHMG family Motif 1-10 indicated by different colors.The sequences of the motifs 1-10 were shown below

2.3 山新楊PdbHMGs基因啟動子特征分析

通過Plantcare數(shù)據(jù)庫，分析了PdbHMGs基因啟動子區(qū)的順式作用元件［26］。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在PdbHMGs的啟動子區(qū)包含了大量的響應植物激素和非生物脅迫的元件。包括與脫落酸、生長素、水楊酸、茉莉酸甲酯、赤霉素和乙烯相關(guān)的激素響應元件；以及與非生物脅迫響應相關(guān)的脅迫響應元件、損傷反應元件、厭氧誘導元件和MYB干旱誘導性結(jié)合位點（表3）。上述結(jié)果表明，PdbHMGs可能在植物生長發(fā)育及對逆境脅迫的應答過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

表3 PdbHMGs基因啟動子區(qū)順式作用元件Table 3 Analysis of cis acting elements in promoter region of PdbHMGs

2.4 山新楊PdbHMGs基因應答逆境脅迫表達模式分析

為了解PdbHMG1～7基因是否能對非生物脅迫做出應答，分別用NaCl、PEG6000、CdCl2和ABA 處理山新楊，利用qRT-PCR 分析根和葉中7 個PdbHMGs基因的表達模式。

2.4.1 NaCl 處理下山新楊PdbHMGs基因表達模式分析

在根中，PdbHMG3、PdbHMG5的表達在所有時間點均顯著上調(diào)，其他基因在大部分時間點表現(xiàn)為下調(diào)表達趨勢，但PdbHMG2在12 h 時表達明顯上調(diào)（210.47倍）。PdbHMG7在12 h時表達也被明顯誘導，為對照的29.87 倍，其他時間點表達量顯著下調(diào)。PdbHMG1和PdbHMG6在4 個脅迫時間點表達顯著下調(diào)，在其他時間點表達顯著上調(diào)或無顯著變化。PdbHMG4在除3 h 外的其他脅迫時間點表達顯著下調(diào)或無顯著變化（＜2倍）（圖7a）。

圖7 NaCl脅迫處理下山新楊PdbHMGs基因表達模式a.根；b.葉；圖中所有基因的表達水平都進行了log2轉(zhuǎn)化Fig.7 Expression analysis of PdbHMGs under NaCl stress.a.Roots；b.Leaves；All relative transcription levels of genes were log2 transformed

在葉中，大部分的PdbHMGs基因，包括PdbHMG1、PdbHMG2、PdbHMG3和PdbHMG6的表達在所有脅迫時間點上均有不同程度的上調(diào)或無顯著變化。而PdbHMG4和PdbHMG7的表達則表現(xiàn)在全部時間點顯著下調(diào)或無明顯變化。PdbHMG5的表達在9 h 時顯著上調(diào)，為對照的26.02 倍，在其他時間點呈下調(diào)表達或無顯著變化（圖7b）。

2.4.2 PEG6000處理下山新楊PdbHMGs基因表達模式分析

在 根 中，PdbHMG1、PdbHMG3、PdbHMG4、PdbHMG5在大部分脅迫時間點顯著上調(diào)，但PdbHMG4在48 h 表達顯著下調(diào)，僅為對照的2.06%，PdbHMG1和PdbHMG2在脅迫12 h 時被明顯下調(diào)，分別為對照的17.29%和1.47%，PdbHMG3在脅迫9 h 時被明顯下調(diào)，為對照的8.55%。而PdbHMG6和PdbHMG7則在全部時間點表達量顯著降低或無明顯變化（圖8a）。

圖8 PEG6000脅迫處理下山新楊PdbHMGs基因表達模式a.根；b.葉Fig.8 Expression analysis of PdbHMGs under PEG6000.a.Roots；b.Leaves

在葉中，PdbHMG2的表達，除48 h表達量變化不明顯外，其他脅迫時間點均顯著上調(diào)，最高表達水平出現(xiàn)在脅迫初期（6 h），達到對照的33.63 倍。PdbHMG4、PdbHMG6在6 h 時顯著下調(diào)（分別為對照的46.22%、20.31%），在9 h 時被顯著誘導（分別為對照的9.98 倍、3.52 倍），其他時間的表達量無明顯變化。而其他基因在大部分時間點表現(xiàn)為下調(diào)表達趨勢，但PdbHMG5在9 h 時被顯著誘導，為對照的3.42倍（圖8b）。

2.4.3 CdCl2處理下山新楊PdbHMGs基因表達模式分析

在根中，PdbHMG1和PdbHMG7的表達在大部分的脅迫時間點顯著下調(diào)或無顯著變化（除PdbHMG1在24 h 顯 著 上 調(diào)，PdbHMG7在12 h 顯 著 上調(diào)）。其他基因主要表現(xiàn)為上調(diào)表達趨勢。特別的是，PdbHMG3、PdbHMG5在脅迫9 h 表達顯著下調(diào)，分別為對照的21.14%、29.80%。PdbHMG2在脅迫中期表達顯著上調(diào)，其他時間點表達量變化小。PdbHMG6大部分脅迫時間點顯著上調(diào)或無顯著變化且在脅迫初期（3～6 h）就被明顯誘導（圖9a）。

圖9 CdCl2脅迫處理下山新楊PdbHMGs基因表達模式a.根；b.葉Fig.9 Expression analysis of PdbHMGs under CdCl2.a.Roots；b.Leaves

有趣的是，在葉中，除PdbHMG3在脅迫48 h時的表達無明顯變化外，PdbHMG1～6基因的表達均被鎘脅迫明顯誘導呈上調(diào)表達趨勢。而PdbHMG7在所有時間點的表達均呈現(xiàn)下調(diào)趨勢，在9 h時達到最低水平，為對照的2.70%（圖9b）。

2.4.4 ABA 處理下山新楊PdbHMGs基因表達模式分析

在根中，7 個PdbHMG基因的表達分為3 種明顯不同的模式。第1 種，由PdbHMG1和PdbHMG5組成，其表達主要表現(xiàn)為上調(diào)，其中，PdbHMG1在所有時間點均被顯著誘導，12 h 的表達量達到最高，為對照的176.07 倍。PdbHMG5的表達量在3個脅迫時間點明顯升高，在12 h達到最高表達水平（為對照的7.06 倍）。而第2 種表達模式主要是下調(diào)表達，如PdbHMG4、PdbHMG6和PdbHMG7的表達大部分時間點呈現(xiàn)顯著下調(diào)趨勢，PdbHMG3的表達在3個脅迫時間點也被明顯下調(diào)，在48 h時表達量最低，為對照的6.49%。第3種是PdbHMG2基因，其表達在所研究的6個時間點都無顯著變化（圖10a）。

圖10 ABA處理下山新楊PdbHMGs基因表達模式a.根；b.葉Fig.10 Expression analysis of PdbHMGs in response to ABA.a.Roots；b.Leaves

在葉中，PdbHMG2在全部脅迫時間點都被顯著誘導，其中24 h 表達量最高（為對照的35.38倍）。而其他基因的表達均與之不同，PdbHMG3、PdbHMG5、PdbHMG6和PdbHMG7在全部脅迫時間點顯著下調(diào)或無明顯變化。PdbHMG1的表達除在24 h 被顯著誘導，其他時間的表達無明顯變化。PdbHMG4在除脅迫3 h時的表達量明顯下調(diào)，其他時間的表達呈上調(diào)或無明顯變化（圖10b）。

3 討論

本研究在山新楊基因組中通過擬南芥同源查找獲得了7 條PdbHMGs基因，與擬南芥和白樺HMG 蛋白進化分析結(jié)果顯示山新楊7條PdbHMGs基因全屬于HMGB 亞家族。以往研究發(fā)現(xiàn)，HMGB 能夠參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控及DNA 合成相關(guān)的生物學過程［29］。植物HMGB 蛋白在植物的生命過程中具有至關(guān)重要的作用。在正常條件下，玉米ZmHMGB1在煙草（Nicotiana tabacum）中的異位表達能影響煙草幼苗的根部生長發(fā)育［30］。將黃瓜HMGB基因轉(zhuǎn)入擬南芥中，會使一部分萌發(fā)響應基因的表達受到影響［31］。在擬南芥中，AtHMGB12和AtHMGB15只在種子中表達，說明這兩個基因可能在種子的萌發(fā)和生長過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用［8］，山新楊PdbHMG5和PdbHMG3與擬南芥 中AtHMGB12和AtHMGB15的同源性較高，聚在同一分支，因此推測PdbHMG5和PdbHMG3也可能具有相似的功能。AtHMGB13僅在果莢中表達，說明該基因在花分化成果莢的生理過程中具有重要作用［8］，PdbHMG4與AtHMGB13的同源性較高，由此推測PdbHMG4可能也具有相似的功能。與野生型相比，atssrp1/spt16突變體的花青素合成量減少，說明AtSSRP1（AtHMGB7）可能參與了植物花青素的合成過程［32］，而PdbHMG6與AtHMGB7的同源性較高，由此推測PdbHMG6可能也參與了山新楊的花青素合成過程。

此外，植物HMGB 蛋白還參與到植物抵抗逆境脅迫的生理過程中。如在NaCl 脅迫下，白樺BpHMG6莖中的表達量在所有研究時間點均顯著上調(diào)；進一步研究發(fā)現(xiàn)，過表達BpHMG6白樺增強了對活性氧的清除能力和鹽脅迫下保護酶的活性，減少了細胞的損傷和死亡，表明BpHMG6可能與白樺的耐鹽性有關(guān)［15］。對啟動子順式作用元件的分析發(fā)現(xiàn)，PdbHMGs各成員均含有與植物激素和逆境脅迫相關(guān)的元件，如脅迫響應元件（STRE）、脫落酸響應元件（ABRE）等，由此推測PdbHMGs可能在植物抵御非生物脅迫的過程中發(fā)揮作用。在非生物脅迫和激素處理后，對PdbHMGs基因在山新楊根和葉中的表達模式進行了分析。結(jié)果顯示，PdbHMG1～7均能在至少一個器官中對鹽、干旱、重金屬以及ABA脅迫處理做出響應。

PdbHMG1在NaCl 和CdCl2脅迫下，在葉中的表達被顯著誘導，表明該基因可能在葉應對鹽和重金屬脅迫中發(fā)揮作用。在高鹽、干旱、激素和重金屬4 種脅迫下，PdbHMG2在葉中的表達被明顯誘導，說明該基因可能在葉中參與多種脅迫應答過 程。PdbHMG1、PdbHMG2分 別與AtHMGB1和AtHMGB2的同源性最高。在NaCl 脅迫下，過表達AtHMGB1的擬南芥種子的萌發(fā)受到阻礙［33］。鹽和干旱處理下，過表達AtHMGB2與野生型相比表現(xiàn)萌發(fā)及發(fā)育遲緩現(xiàn)象，說明AtHMGB2在脅迫條件下在擬南芥的早期生長發(fā)育階段發(fā)揮作用［14，33］。

NaCl、PEG6000、ABA 和CdCl2處理后，PdbHMG7在葉中的表達均呈現(xiàn)下調(diào)趨勢，表明其也可能參與這4 種脅迫應答。在高鹽和ABA 脅迫下，根中PdbHMG6在大部分脅迫時間點的表達顯著下調(diào)，由此推測其發(fā)揮功能的器官可能是根，PdbHMG6可能參與根中ABA 信號途徑相關(guān)的鹽脅迫應答。PdbHMG6基因能否調(diào)控ABA依賴的抗逆相關(guān)基因的表達仍有待進一步研究。在今后的研究中，可通過轉(zhuǎn)基因的方法對山新楊PdbHMGs基因在非生物脅迫應答過程中發(fā)揮的具體功能進行研究與分析。