閆惠鈴 張?chǎng)析?趙曦陽 曲冠證 王兆寧 韓 銳*

（1.林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱 150040； 2.林學(xué)與草學(xué)學(xué)院，吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，長(zhǎng)春 130118）

花青素（anthocyanin）又稱花色苷，廣泛存在于植物的花、葉、莖、果實(shí)等器官中，是重要的植物類黃酮化合物，也是重要的水溶性植物色素。已知的花青素有600 多種，超過80%是由天竺葵素（pelargonidin，Pg）、芍藥花素（peonidin，Pn）、矢車菊素（cyanidin，Cy）、錦葵素（malvidin，Mv）、矮牽牛素（petunidin，Pt）和飛燕草素（delphinidin，Dp）6 種常見的花青素衍生而來的［1］。不同種類的花青素使植物呈現(xiàn)出不同的顏色，例如，天竺葵素及其衍生物使植物組織或器官呈現(xiàn)紅色或橙色，矢車菊素及其衍生物主要呈現(xiàn)紅色或紫色，飛燕草素及其衍生物主要呈現(xiàn)藍(lán)色或紫色［1-2］。

花青素合成通路在高等植物中較為保守，主要分為花青素基本骨架的形成、花青素前體的形成及花青素前體修飾，屬于黃酮類化合物。由苯丙氨酸（phenylalanine）為起點(diǎn)，經(jīng)過苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia lyase，PAL）、肉桂酸羥化酶（cinnamate 4-hydroxylase，C4H）和4-香豆酰CoA 連接酶（4-coumarate CoA ligase，4CL）修飾合成柚皮素（naringenin），以此為節(jié)點(diǎn)，形成3 個(gè)分支，其一是通過異黃酮7-O-葡糖苷-6″-O-丙醇基轉(zhuǎn)移 酶（isoflavone 7-O-glucoside-6″-O-malonyltransferase，IF7MAT）合成異黃酮化合物，其二經(jīng)過黃酮醇-3-O-葡萄糖苷L-鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶（flavonol-3-Oglucoside L-rhamnosyltransferase，F(xiàn)G2）合成黃酮化合物，其三經(jīng)過二氫黃酮醇-4-還原酶（dihydroflavonol 4-reductase，DFR）、花青素合成酶（anthocyanidin synthase，ANS）、糖基轉(zhuǎn)移酶（3-O-glucosyltransferase，UFGT/BZ1）合成花青素［1］。每個(gè)階段涉及了多種酶促反應(yīng)，需要多條編碼相關(guān)酶的結(jié)構(gòu)基因參與其中，根據(jù)參與時(shí)間的先后，這些結(jié)構(gòu)基因分為早期生物合成基因（early biosynthetic genes，EBGs）：CHS、CHI、F3H和F3′H等；晚期生物合成基因（late biosynthetic genes，LBGs）：DFR、ANS和UFGT等，其中晚期生物合成基因的表達(dá)受MYB-bHLH-WD40三元復(fù)合物調(diào)控［3］。

光照是影響花青素積累的主要環(huán)境因子之一，研究表明，光強(qiáng)和光質(zhì)的變化均可以激活花青素合成通路中的相關(guān)基因，從而對(duì)植物體中花青素含量產(chǎn)生影響。例如，強(qiáng)光可以激活結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，使擬南芥（Arabidopsis thaliana）更容易合成花青素，而弱光或者黑暗會(huì)抑制結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，從而減少花青素的合成［4］；光照條件下，與普通綠豆（Vigna radiata）相比，黑綠豆中花青素大量積累，飛燕草素和矢車菊素含量較高，VrDFR、VrLDOX等11 條結(jié)構(gòu)基因表達(dá)量顯著上調(diào)，PAL、CHI和UFGT 活性較高；遮光條件下，普通綠豆和黑綠豆種皮明顯失綠，花青素各組分含量、花青素合成結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)量和花青素合成相關(guān)酶活性均明顯減低［5］。此外，對(duì)于園藝作物來說，藍(lán)光照射可以促使草莓（Fragaria×ananassa）果實(shí)、葡萄（Vitis vinifera）果皮、矮牽牛花（Petunia hybrida）中花青素積 累［6-8］，激 活 彩 椒（Capsicum annuum）中PAL、4CL、F3H、ANS等基因的表達(dá)［9］。而植物中合成的可溶性糖為植物提供呼吸底物同時(shí)也維持植物的滲透壓，也以糖信號(hào)的形式影響花青素的生物合成?；ㄇ嗨刈鳛榭寡趸x物之一，可以有效的清除葉片的自由基。過氧化物（POD）作為植物的氧化還原酶之一，同樣能夠清除植物體內(nèi)的自由基，檢測(cè)植物內(nèi)POD 酶的活性，可以確定植物內(nèi)的抗氧化狀態(tài)［9］。

AmRosea1是從金魚草（Antirrhinum majus）中分離出來的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子，同時(shí)過表達(dá)Am-Rosea1和AmDelila基因，可以使橙色的胡蘿卜（Daucus carota）或番茄（Solanum lycopersicum）變?yōu)樽仙?0］。因此對(duì)Rosea1基因及黃酮類代謝物合成途徑的節(jié)點(diǎn)酶基因IF7MAT、FG2、DFR、ANS、BZ1進(jìn)行定量檢測(cè)，可以進(jìn)一步確定Rosea1基因在不同光信號(hào)下對(duì)轉(zhuǎn)基因楊樹的花青素合成的調(diào)控機(jī)理。本研究團(tuán)隊(duì)前期在84K 楊（Populus alba×P.glandulosa‘84K’）中過量表達(dá)AmRosea1基因，共獲得13 個(gè)轉(zhuǎn)基因株系，且生長(zhǎng)在自然光下的高表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系植株呈現(xiàn)紅色，矢車菊素、飛燕草素、芍藥花素和天竺葵素相關(guān)代謝產(chǎn)物和總花青素含量較高［11］。然而，光信號(hào)引起AmRosea1過表達(dá)84K 楊植株顏色變化的原因還尚不清晰。因此，本研究以野生型和AmRosea1過表達(dá)84K 楊為試驗(yàn)材料，開展不同光強(qiáng)和光質(zhì)下野生型和轉(zhuǎn)基因株系生理特性和基因表達(dá)分析，研究結(jié)果為解析光信號(hào)激活A(yù)mRosea1過表達(dá)84K楊花青素生物合成通路的機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)，也為其他彩葉木本植物的創(chuàng)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

光強(qiáng)處理試驗(yàn)材料：東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室獲得的野生型84K 楊（命名為WT）和3 個(gè)過表達(dá)AmRosea184K 楊（命名分別為A-3、A-10 和A-24）。將在生根培養(yǎng)基（1/2 MS+0.10 mg·L-1IBA+0.01 mg·L-1NAA+20.00 g·L-1蔗糖，pH=5.8）中培養(yǎng)30 d 左右的無菌苗轉(zhuǎn)移至土壤基質(zhì)（V（營(yíng)養(yǎng)土）∶V（蛭石）∶V（珍珠巖）=3∶2∶1）中培養(yǎng)30 d，培養(yǎng)條件為16 h 光照/8 h 黑暗，溫度約為22 ℃，空氣濕度為50%～60%，光量子通量密度約為110 μmol·m-2·s-1。而后轉(zhuǎn)移至自然光下培養(yǎng)30 d，此時(shí)日平均光量子通量密度約為1 000 μmol·m-2·s-1。每個(gè)株系15 株苗，取功能葉為試驗(yàn)材料。

光質(zhì)處理試驗(yàn)材料：將在生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)30 d 左右的WT、A-3、A-10 和A-24 無菌苗轉(zhuǎn)移至土壤基質(zhì)中，分別在LED 紅光、藍(lán)光、紅藍(lán)光照射下培養(yǎng)30 d，培養(yǎng)條件為16 h 光照/8 h 黑暗，溫度約為22 ℃，空氣濕度為50%～60%。其中，LED 紅光波長(zhǎng)為610～650 nm，光量子通量密度為28 μmol·m-2·s-1；LED 藍(lán)光波長(zhǎng)為460～490 nm，光量子通量密度為83 μmol·m-2·s-1；紅藍(lán)光的光量子通量密度為53 μmol·m-2·s-1。每個(gè)株系15 株苗，取功能葉為試驗(yàn)材料。

試劑：無水乙醇、甲醇、鹽酸、蒽酮、PBS 粉末、過氧化氫均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。無水葡萄糖購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，愈創(chuàng)木酚購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，RNA 提取試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光染料購(gòu)自北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 光強(qiáng)及光量子通量密度測(cè)定

光強(qiáng)及光量子通量密度測(cè)定分別應(yīng)用得力照度計(jì)（DL333204，中國(guó)）和LI-COR 便攜式光合作用測(cè)定系統(tǒng)（Li-6400，美國(guó)）進(jìn)行測(cè)定。

1.2.2 花青素含量的測(cè)定

花青素的提取在Wang 等［12］的方法上進(jìn)行改良：稱取0.1 g樣品，液氮研磨后加入1 mL 1%鹽酸-甲醇溶液，32 ℃震蕩5 h（100 r·min-1，避光），10 000 r·min-1離心5 min，稀釋5 倍后測(cè)定530、657 nm 下的吸光值，每種測(cè)定重復(fù)3 次，則花色苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)（ω（CA），mg·g-1）為：

式中：A為各波長(zhǎng)下的吸光值，V為提取液體積（mL），D為稀釋倍數(shù)，W為樣品鮮質(zhì)量（g）。

1.2.3 葉綠素含量的測(cè)定

葉綠素的提取在國(guó)慶［13］的方法上進(jìn)行改良：稱取0.1 g 樣品，液氮研磨后加入1.8 mL 無水乙醇混勻，25 ℃浸提24 h（100 r·min-1，避光），10 000 r·min-1離心10 min，取200 μL 測(cè)定645、663 nm 處的吸光值，每種測(cè)定重復(fù)3 次，則葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)（ω（Chl），mg·g-1）為：

式中：A為各波長(zhǎng)下的吸光值，V為提取液體積（mL），D為稀釋倍數(shù)，W為樣品鮮質(zhì)量（g）。

1.2.4 可溶性糖含量的測(cè)定

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：稱取0.1 g 無水葡萄糖溶于蒸餾水中，定容至100 mL，稀釋10 倍（100 mg·L-1）備用；稱取0.1 g 蒽酮溶于100 mL 80%濃硫酸，備用。取1mL 20、40、60、80、100 mg·L-1的葡萄糖溶液，各加入5 mL 蒽酮試劑，沸水水浴10 min，冷卻后測(cè)定620 nm處的吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線［14］。

采用改良后的蒽酮比色法測(cè)定可溶性糖含量［14］：稱取0.08 g 樣品加入0.8 mL 去離子水，沸水浴20 min，冷卻至室溫后8 000 r·min-1離心3 min備用。取20.0 μL 添加980.0 μL 去離子水和5 mL蒽酮試劑，沸水浴10 min，冷卻后測(cè)定620 nm 處的吸光值，則可溶性糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（ω（Ss），%）為：

式中：C為標(biāo)準(zhǔn)曲線中查到的可溶性糖含量（μg），D為稀釋倍數(shù)，W為樣品鮮質(zhì)量（g）。

1.2.5 過氧化物酶活性的測(cè)定

采用改良后的愈創(chuàng)木酚法測(cè)定過氧化物酶的活性［15］：稱取0.2 g 樣品，加入5 mL 預(yù)冷的PBS（0.01 mol·L-1，pH=7.8），旋渦振蕩后4 ℃下12 000g離心10 min 備用。取400 μL 上清液依次加入400 μL 0.1 mol·L-1愈創(chuàng)木酚、400 μL 0.1 mol·L-1PBS 和400 μL 0.8% H2O2，充分混勻后30 ℃水浴10 min，取200 μL 測(cè)定470 nm 處的吸光值（A470），則超氧化物歧化酶（POD）（U·mg-1）為：

式中：D為稀釋倍數(shù)，T為反應(yīng)時(shí)間（min），W為樣品鮮質(zhì)量（g）。

1.2.6 總RNA的提取和基因表達(dá)量檢測(cè)

提取野生型和轉(zhuǎn)基因株系A(chǔ)-3 的總RNA，使用2%瓊脂糖凝膠分離，檢測(cè)樣品完整性。取1 μg樣品反轉(zhuǎn)錄成cDNA，稀釋10 倍后，使用ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增。其中總RNA 的提取和反轉(zhuǎn)錄嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行，qRT-PCR 的體系、程序及計(jì)算參見國(guó)慶［13］的方法。qRT-PCR引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 qRT-PCR primer sequences

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 和SPSS 16.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。使用鄧肯（Duncan）法進(jìn)行多重比較，所有數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，不同字母和*代表差異達(dá)到顯著水平（P＜0.05），**代表差異達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同光強(qiáng)下AmRosea1過表達(dá)84K楊生理特性分析

不同光強(qiáng)下AmRosea1過表達(dá)84K楊表型觀察發(fā)現(xiàn)，與LED 光相比，自然光下的AmRosea1過表達(dá)84K楊植株呈現(xiàn)紅色（圖1）。

圖1 不同光強(qiáng)下AmRosea1過表達(dá)84K楊表型A.LED光下野生型和轉(zhuǎn)基因株系的表型；B.自然光下野生型和轉(zhuǎn)基因株系的表型Fig.1 Phenotypes of AmRosea1 overexpression 84K poplar under different light intensity A.Phenotypes of wild type and transgenic lines under LED light；B.Phenotypes of wild type and transgenic lines under natural light

生理特性分析顯示，無論是LED 光還是自然光條件，轉(zhuǎn)基因株系A(chǔ)-3、A-10 和A-24 花青素含量均高于野生型WT，且自然光下的差異達(dá)到顯著水平（P＜0.05），其分別為L(zhǎng)ED 光的12.00、8.39、11.47倍（見圖2A）。LED光下野生型和轉(zhuǎn)基因株系的葉綠素含量沒有明顯差異，但是在自然光下，野生型和轉(zhuǎn)基因株系的葉綠素含量降低，各株系間的差異未達(dá)到顯著水平（見圖2B）。POD活性和可溶性糖含量結(jié)果顯示，與LED 光相比，自然光下3 個(gè)轉(zhuǎn)基因株系POD 活性降低，可溶性糖含量升高，分別為L(zhǎng)ED 光的0.78、0.49、0.65 倍和1.44、1.68、1.44 倍（見圖2C～D）。綜上所述，光照強(qiáng)度的增強(qiáng)，使轉(zhuǎn)基因株系葉片變紅，花青素含量和可溶性糖含量明顯增多，但葉綠素含量和POD活性明顯降低。

圖2 不同光強(qiáng)下AmRosea1過表達(dá)84K楊生理特性Fig.2 Physiological characteristics of AmRosea1 overexpression 84K poplar under different light intensity

2.2 不同光強(qiáng)下AmRosea1過表達(dá)84K楊基因表達(dá)分析

不同光強(qiáng)下AmRosea1過表達(dá)84K楊基因表達(dá)分析顯示，LED 光下，轉(zhuǎn)基因株系A(chǔ)-3 中AmRosea1、IF7MAT、FG2、DFR、ANS和BZ1.1基因的表達(dá)量均明顯高于野生型WT，分別為WT 株系的351.8、4.2、14.8、3.38、1.36、20.8倍（見圖3A～F）。

在自然光下，DFR基因表達(dá)量極顯著低于野生型WT（P＜0.01）（見圖3），其他基因的表達(dá)量均極顯著高于WT 株系（P＜0.01），分別為WT 株系的404.60、4.29、77.70、3.37、101.10 倍，（圖3：A～C，E～F）。同時(shí)，除DFR 基因外，自然光下的基因表達(dá)量均高于LED 光下。綜上所述，光照強(qiáng)度的增強(qiáng)顯著增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因株系中AmRosea1、IF7MAT、FG2、ANS和BZ1.1基因的表達(dá)。

2.3 不同光質(zhì)下AmRosea1過表達(dá)84K楊生理特性分析

本研究對(duì)A-24、A-10、A-3 轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行LED 紅光、藍(lán)光、紅藍(lán)光處理。均取同一部位的功能葉（第3片葉片）進(jìn)行表型觀察發(fā)現(xiàn)，LED紅藍(lán)光處理30 d后轉(zhuǎn)基因株系葉片呈現(xiàn)紅色（見圖4）。

生理特性分析顯示，無論LED 紅光、藍(lán)光、紅藍(lán)光處理10 d 還是30 d，轉(zhuǎn)基因株系花青素含量均高于野生型株系，且除LED 紅光處理30 d外，其他處理間差異均達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。LED 紅藍(lán)光處理后30 d 后，轉(zhuǎn)基因株系A(chǔ)-3、A-10 和A-24花青素含量升高最為明顯，其分別為L(zhǎng)ED 紅光處理的4.58、3.62、2.42 倍，為L(zhǎng)ED 藍(lán)光處理的3.53、2.41、1.84 倍，為L(zhǎng)ED 紅 藍(lán) 光 處 理10 d 的3.80、2.56、1.94 倍（見圖5A）。LED 紅光、藍(lán)光處理10 d的各轉(zhuǎn)基因株系和野生型間葉綠素含量變化差異不顯著，處理30 d 后各轉(zhuǎn)基因株系和野生型葉綠素含量變化無明顯規(guī)律，且處理10 d 和30 d 相比，各株系葉綠素含量也無明顯變化；但LED 紅藍(lán)光處理30 d 后，轉(zhuǎn)基因株系葉綠素的含量微量降低，分別為處理10 d 的0.83、0.90 和0.88 倍（見圖5B）。POD 活性結(jié)果顯示，與LED 紅光、藍(lán)光和紅藍(lán)光處理10 d 相比，處理30 d 后各株系POD 活性明顯降低（LED 藍(lán)光處理30 d的WT株系除外），且轉(zhuǎn)基因株系的POD 活性均低于野生型株系，其中，LED 紅藍(lán)光處理30 d 后，各株系POD 活性下降最為明顯（見圖5C）?？扇苄蕴呛拷Y(jié)果顯示，與LED 紅光、藍(lán)光和紅藍(lán)光處理10 d 相比，處理30 d 后各株系可溶性糖含量明顯降低，LED 紅光和藍(lán)光處理30 d 后，各轉(zhuǎn)基因株系的可溶性糖含量均低于野生型株系，而LED 紅藍(lán)光處理30 d 后各轉(zhuǎn)基因株系的可溶性糖含量高于野生型，與LED 紅藍(lán)光處理10 d 時(shí)表現(xiàn)出相反的趨勢(shì)（見圖5D）。綜上所述，與LED 紅光和藍(lán)光相比，LED 紅藍(lán)光誘導(dǎo)下，轉(zhuǎn)基因株系葉片變紅，且其花青素含量升高，可溶性糖含量和POD 活性下降，葉綠素含量微量降低。

圖5 不同光質(zhì)下AmRosea1過表達(dá)84K楊生理特性次坐標(biāo)軸指示培養(yǎng)30 d時(shí)各株系的變化Fig.5 Physiological characteristics of AmRosea1 overexpression 84K poplar under different light quality

2.4 不同光質(zhì)下AmRosea1過表達(dá)84K楊基因表達(dá)分析

不同光質(zhì)下AmRosea1過表達(dá)84K楊基因表達(dá)分析顯示，LED 紅光處理10 、30 d 后，轉(zhuǎn)基因株系A(chǔ)-3 中AmRosea1、IF7MAT、FG2、DFR、ANS、和BZ1.1的基因表達(dá)量均高于野生型WT，處理10 d后A-3 中各基因表達(dá)量分別為WT 的1 219.70、3.51、122.15、2.29、1.67、33.26 倍；處理30 d 后A-3中各基因表達(dá)量分別為WT 株系的2 311.90、3.37、1 879.81、2.81、3.59、206.30 倍，但AmRosea1和IF7MAT的基因表達(dá)量低于處理10 d（見圖6）。

LED 藍(lán)光處理10 d 后，除ANS基因外（見圖7E），A-3 中其他各基因的表達(dá)量均極顯著高于WT 株 系（P＜0.01），分 別 為WT 株 系 的748.19、8.33、50.46、8.01、652.91 倍。LED 藍(lán)光處理30 d后，與WT 株系相比，A-3 株系中DFR基因表達(dá)量下調(diào)，為其0.66 倍（見圖7D），其余各基因表達(dá)量均極顯著高于WT 株系（P＜0.01），分別為WT 株系的3059.52、1.44、219.0、4.10、630.86 倍（見圖7：A～C，E～F）。

LED 紅藍(lán)光處理10 d 后，轉(zhuǎn)基因株系A(chǔ)-3 中AmRosea1、IF7MAT、FG2和BZ1.1基因的表達(dá)量均高于WT 株系，分別為WT 株系的1 261.30、2.28、125.72、282.69 倍（見圖8：A～C，F(xiàn)），而DFR和ANS基因的表達(dá)量則低于WT，分別為其0.05 倍和0.51倍（圖8D～E）。LED 紅藍(lán)光處理30 d 后，除ANS基因表達(dá)量略低于WT 株系外（圖8E），A-3株系中其余基因的表達(dá)量均高于WT株系，分別為WT株系的2 311.90、2.78、65.13、345.37、653.59 倍（圖8A～D，F(xiàn)）。綜上所述，LED 紅光促進(jìn)A-3 株系中FG2、DFR、ANS和BZ1.1基因的表達(dá)，抑制AmRosea1和IF7MAT基因 的表 達(dá)；LED 藍(lán) 光 促進(jìn)A-3 株 系 中AmRosea1、FG2、ANS和BZ1.1基因的表達(dá)，抑制IF7MAT和DFR基因的表達(dá)；LED 紅藍(lán)光則能促進(jìn)A-3 株系中AmRosea1、IF7MAT、DFR、ANS和BZ1.1基因的表達(dá)，抑制了FG2基因的表達(dá)。

3 討論

花青素是一類廣泛存在植物中的水溶性色素物質(zhì)，種類繁多，能賦予植物豐富多彩的顏色，并能提高植物抗氧化能力［16］。花青素生物合成通路是研究的較為清楚的植物次生代謝產(chǎn)物之一，通路中的終產(chǎn)物、中間產(chǎn)物、結(jié)構(gòu)基因等已經(jīng)很好地被闡述，其中的轉(zhuǎn)錄因子參與的調(diào)控關(guān)系和分子機(jī)制也不斷被完善［17］。研究發(fā)現(xiàn)，低溫、細(xì)胞分裂素、生長(zhǎng)素、乙烯和茉莉酸等處理能促進(jìn)花色素的合成，褪黑素則能抑制花青素的合成［18］。光照作為常見的環(huán)境因子，不僅為植物生長(zhǎng)提供能量，也是調(diào)控植物花青素生物合成的重要因素之一。

光信號(hào)影響植物花青素的積累體現(xiàn)在光照強(qiáng)度上。強(qiáng)光能促進(jìn)綠豆、小麥（Triticum aestivum）等作物合成花色苷，也能促進(jìn)蘋果等樹木合成花色苷，進(jìn)而引起植物顏色變化［3，5］。強(qiáng)光能促進(jìn)紅葉大頭芥（Brassica juncea）花青素生物途徑中DFR和ANS基因的表達(dá)［19］。本研究發(fā)現(xiàn)，自然光下激活A(yù)mRosea1過 表 達(dá)84K 楊 中AmRosea1、ANS和BZ1.1基因的表達(dá)，促進(jìn)了轉(zhuǎn)基因株系中花青素的生物合成，致轉(zhuǎn)基因株系中花青素大量積累，植株葉片變紅（圖1B）。同時(shí)，自然光處理下IF7MAT和FG2基因也大量表達(dá)，這表明強(qiáng)光也同時(shí)激活了轉(zhuǎn)基因株系的黃酮和異黃酮生物合成通路。葉綠素含量和可溶性糖含量的測(cè)定結(jié)果顯示，花青素含量與葉綠素含量呈負(fù)相關(guān)，而與可溶性糖含量呈正相關(guān)，這些結(jié)果與大葉櫸樹（Zelkova schneideriana）的研究結(jié)果［20］一致，筆者推測(cè)，在強(qiáng)光的誘導(dǎo)下，花青素大量合成的同時(shí)伴隨著葉綠素的不斷分解，而可溶性糖作為花色苷合成的信號(hào)因子，對(duì)花青素的積累有明顯的促進(jìn)作用［21］。POD 是與植物次生代謝密切相關(guān)的一個(gè)重要的酶，能夠有效清除植物體內(nèi)堆積的活性氧［9］。目前已知，花青素作為植物體內(nèi)的抗氧化的代謝物之一，其同樣能夠清除植物體內(nèi)的活性氧。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著光強(qiáng)的升高，野生型株系POD 活性和花青素含量相差不大，但轉(zhuǎn)基因株系中花青素含量大量提高，POD 活性明顯下降，說明花青素的大量合成清除了植物體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧，降低了POD的作用，使POD活性下降［9］。

光信號(hào)影響植物花青素的積累也體現(xiàn)在光質(zhì)上。藍(lán)光能激活芹菜（Apium graveolens）和桔梗（Platycodon grandiflorum）DFR、ANS等基因表達(dá)，促進(jìn)花青素合成與積累［22-23］；在不同品系馬鈴薯（Solanum tuberosum）的研究中，紅光提高了“黑金剛”的花青素含量，藍(lán)光則降低了“黑美人”的花青素含量［24］，這些結(jié)果表明光質(zhì)對(duì)花青素的影響多與植物種類或基因型有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，僅有LED 紅藍(lán)光處理30 d 后的葉片存在明顯的表型，且花青素的含量也高于LED 紅光及藍(lán)光的處理，說明LED 紅藍(lán)光處理增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因株系的花青素含量，同時(shí)影響了可溶糖含量及POD 活性含量，分別呈現(xiàn)上升及下降的趨勢(shì)，與光強(qiáng)試驗(yàn)的結(jié)果一致。此外，強(qiáng)光和紅藍(lán)光質(zhì)下，葉綠素/花青素含量的比值較小，也是導(dǎo)致植株葉片顏色變化的主要原因［25］。在基因表達(dá)量上，LED 紅藍(lán)光處理誘導(dǎo)了AmRosea1、IF7MAT、DFR、ANS和BZ1.1基因的表達(dá)，結(jié)合3 種光質(zhì)的處理結(jié)果，筆者推測(cè)，IF7MAT、BZ1.1基因?qū)ㄇ嗨氐姆e累起積極的調(diào)控作用。

綜上，本研究以野生型和AmRosea1過表達(dá)84K 楊為試驗(yàn)材料，探究了不同光強(qiáng)和光質(zhì)處理下轉(zhuǎn)基因株系的表型、生理特性和基因表達(dá)差異，證實(shí)了強(qiáng)光照和紅藍(lán)光能夠促進(jìn)AmRosea1過表達(dá)84K 楊花青素的積累并使植株葉片顏色變紅，為深入揭示光信號(hào)激活A(yù)mRosea1過表達(dá)84K楊花青素生物合成通路的機(jī)制提供了理論依據(jù)。后續(xù)將通過ChIP-seq、酵母單雜等試驗(yàn)，探究不同光強(qiáng)和光質(zhì)下AmRosea1下游靶基因的差異，解析光信號(hào)介導(dǎo)下AmRosea1 轉(zhuǎn)錄因子在84K 楊中的調(diào)控關(guān)系，進(jìn)一步闡明光信號(hào)調(diào)控花青素生物合成的分子機(jī)制，為其他彩葉木本植物的創(chuàng)制奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

光信號(hào)會(huì)激活A(yù)mRosea1過表達(dá)84K楊的花青素生物合成通路。自然光及紅藍(lán)光處理下，均能激活84K 楊花青素的生物合成，但由于自然光的光強(qiáng)及光通量密度都明顯高于其他光質(zhì)，說明紅藍(lán)光是花青素生物合成不可或缺的光質(zhì)，光強(qiáng)是影響花青素生物合成的重要因素。