張秀文 魏明清 倪敬年 李 婷 時 晶 田金洲

(北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院,北京,100700)

阿爾茨海默病(Alzheimer′s Disease,AD)是一種慢性進(jìn)行性的神經(jīng)退行性疾病,是導(dǎo)致癡呆的最常見的原因,占癡呆患者總數(shù)的60%～80%[1]。2019年國際阿爾茨海默病協(xié)會估計:全世界有超過5 000萬的癡呆癥患者,到2050年將增加到1.52億[2]。隨著老齡化社會的到來,預(yù)測2030年我國的患病人數(shù)將超過2 000萬[3]。這將給社會、醫(yī)療和家庭帶來沉重的負(fù)擔(dān)。同時,AD的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確,目前已知的發(fā)病機(jī)制有β淀粉樣蛋白(Amyloid β-protein,Aβ)異常沉積、tau蛋白過度磷酸化導(dǎo)致的神經(jīng)纖維纏結(jié)(Neurofibrillary Tangles,NFTs)、神經(jīng)炎癥反應(yīng)、線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激以及細(xì)胞凋亡等[4]。但不幸的是,針對單一發(fā)病機(jī)制的一系列藥物研究在臨床試驗階段都沒有獲得很好的臨床效果[5-7]。故而目前認(rèn)為AD是由多因素共同作用引起的,治療也應(yīng)當(dāng)針對多種因素進(jìn)行多靶點治療。

中醫(yī)以整體觀念和辨證論治為基本特點,是一種多靶點治療的方法,隨著近年來國外藥物研究的失敗,中醫(yī)療法受到了廣大醫(yī)務(wù)工作者的關(guān)注。阿爾茨海默病是由髓減腦消、神機(jī)失用所導(dǎo)致的神智異常疾病,屬于中醫(yī)學(xué)的“癡呆病”,臨床以呆傻愚笨、智力低下、善忘等為主要表現(xiàn)[8],病性為本虛標(biāo)實,本虛在于腎精不足,標(biāo)實在于痰濁、瘀血蒙蔽腦竅[9]。《阿爾茨海默病的中醫(yī)診療共識》指出AD早期以腎虛為主;中期痰、瘀、火并現(xiàn);晚期為痰、瘀、火日久而化生毒濁所致,治療方面當(dāng)遵循補(bǔ)腎原則,分期辨證治療[10]。四物湯,出自宋代的《太平惠民和劑局方》,主要記載用于婦產(chǎn)科疾病,主要作用為補(bǔ)血和活血,由熟地黃、白芍、當(dāng)歸、川芎等中藥組成,逐漸被后世醫(yī)家認(rèn)為“可治一切血證”“血證立法”?；诂F(xiàn)代藥理研究和臨床應(yīng)用研究,基于“虛”“瘀”的病機(jī),四物湯被認(rèn)為可用于多類病的治療[11]。

本文探析從“血”論治AD的理論依據(jù),并利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對“調(diào)理一切血證”的四物湯用于AD的作用機(jī)制進(jìn)行全面研究[12],為后續(xù)研究的開展提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系(SH-SY5Y細(xì)胞株)(由北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院實驗室提供)。

1.1.2 藥品 四物顆粒(吉泰安,批號:Z20020016);鹽酸多奈哌齊片(安理申,批號:H20050978)。

1.1.3 試劑與儀器 人工合成Amyloid Peptide 25-35(Aβ25-35)(萬生昊天,型號:C-PT0104220301),高糖培養(yǎng)基(Dulbecco′s Modification of Eagle′s Medium,DMEM)(HyClone,美國,貨號:SH40007.01),澳洲胎牛血清(Gibco,美國,貨號:10099-141),青-鏈霉素溶液(Gibco,美國,貨號:15140-122),BCA試劑盒(碧云天,貨號:P0012),CCK-8檢測試劑盒(日本同仁化工,日本,貨號:CK04),聚偏二氟乙烯膜(Polyvinylidene Fluoride,PVDF)(Millipore,美國,貨號:IPFL00010),B細(xì)胞淋巴瘤-2(B-cell Lymphoma-2,Bcl-2)抗體(ABclonal,貨號:WH260030),二抗(Abcam,美國,貨號:ab6702),CO2恒濕培養(yǎng)箱(Esco,新加坡,型號:170L),離心機(jī)(Eppendorf,德國,型號:5804),倒置顯微鏡(Olympus,日本,型號:CKX41),多功能酶標(biāo)儀(BioTek,美國,型號:SYNERGY H1)。

1.2 方法

1.2.1 四物湯活性成分篩選 使用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP)檢索四物湯中白芍、熟地黃、當(dāng)歸、川芎四味中藥的所有活性成分。篩選標(biāo)準(zhǔn)為口服生物利用度(Oral Bioavailability,OB)≥30和類藥性(Drug Likeness,DL)≥0.18[13],同時查閱文獻(xiàn),對四物湯的活性成分進(jìn)行補(bǔ)充。

1.2.2 四物湯“成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 TCMSP數(shù)據(jù)庫獲取四物湯中各個中藥的活性成分對應(yīng)的作用靶點信息。通過Pubchem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)得到四味中藥的有效活性成分的標(biāo)準(zhǔn)SMILE號,導(dǎo)入Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(http://www.swisstargetprediction.ch/index.php)進(jìn)行靶點預(yù)測,選取Probability≥50%的作用靶點。整合2個數(shù)據(jù)庫所收集到的所有靶點信息并進(jìn)行去重。通過Uniprot數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)查詢標(biāo)準(zhǔn)化靶點蛋白名稱及對應(yīng)的人類基因名稱,物種選擇為“human”。將活性成分和靶點導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件,構(gòu)建藥物-活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)。

1.2.3 疾病靶點獲取及關(guān)鍵靶點篩選 在GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)和Omim數(shù)據(jù)庫(https://omim.org)中以“Alzheimer′s Disease”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索,在GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果中選擇關(guān)聯(lián)分?jǐn)?shù)(Relevance Score)>20的疾病靶點,對最終獲得2個數(shù)據(jù)庫中的疾病靶點進(jìn)行整合并去重。最后通過Uniprot數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)查詢標(biāo)準(zhǔn)化靶點蛋白名稱及對應(yīng)的人類基因名稱。通過微生信(http://www.bioinformatics.com.cn/)繪制四物湯活性成分靶點和阿爾茨海默病靶點的韋恩圖。

1.2.4 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用(Protein-Protein Interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將四物湯與AD的共同靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/),使用“Multiple Proteins”,物種選擇“Homo Sapiens”,最低相互作用評價閾值選擇“Medium Confidence(0.400)”,并隱藏網(wǎng)絡(luò)中沒有鏈接的節(jié)點,獲得潛在靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)。再將獲得結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析并構(gòu)建核心靶點(Degree值前20)的PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.2.5 基因本體(Gene Ontology,GO)與京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析 利用David(https://david.ncifcrf.gov/)對獲得的潛在靶點進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路富集分析,進(jìn)一步說明四物湯對應(yīng)的潛在靶點在基因功能和通路中的作用,導(dǎo)出富集分析結(jié)果并繪制barplot柱狀圖和dotplot點圖。

1.2.6 分組與模型制備 20 μmol/LAβ25-35干預(yù)24 h建立細(xì)胞損傷模型,分為對照組(DMEM)、模型組(20 μmol/LAβ25-35)、四物顆粒組(20 μmol/LAβ25-35+四物顆粒1 μg/mL)和多奈哌齊組(20 μmol/LAβ25-35+多奈哌齊100 ng/mL)4組。

1.2.7 干預(yù)方法 使用DMEM培養(yǎng)基將四物顆粒與鹽酸多奈哌齊片分別稀釋為1 μg/mL和100 ng/mL,細(xì)胞貼壁后更換為含四物顆?；螓}酸多奈哌齊+20 μmol/LAβ25-35的培養(yǎng)基,干預(yù)24 h。

1.2.8 檢測指標(biāo)與方法

1.2.8.1 CCK-8活力檢測 取對數(shù)生長期的細(xì)胞按6 000/孔接種于96孔板中,過夜貼壁后進(jìn)行分組干預(yù),24 h后每孔加入10 μL的CCK-8試劑,放置于37 ℃恒溫,5%CO2恒濕的培養(yǎng)箱中避光孵育1～2 h,使用酶標(biāo)儀于450 nm波長處讀取每孔的吸光度(Optical Density,OD)。

1.2.8.2 蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測 細(xì)胞中裂解得到的勻漿,置于4 ℃,18 800×g離心20 min,取上清,經(jīng)BCA試劑盒定量。用12.5%的凝膠電泳(160 V,60 min)分離蛋白,200 mA,80 min轉(zhuǎn)移至PVDF膜,使用快速封閉液封閉1 h,然后在4 ℃與特異性一抗孵育過夜:B細(xì)胞淋巴瘤(B cell Lymphoma Protein-2,Bcl-2,1∶1 000。隨后使用含吐溫1%的TBST清洗3次,10 min/次,然后與二抗(1∶5 000)室溫下孵育1 h,然后免疫反應(yīng)條帶可視化,使用分析軟件(Bio-Rad)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 四物湯活性成分篩選 借助TCMSP數(shù)據(jù)庫和查閱文獻(xiàn)共搜集白芍化合物13個,熟地黃化合物2個,當(dāng)歸化合物2個,川芎化合物7個,去重后共得19個。見表1。

表1 四物湯各藥物活性成分

2.2 藥物-活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 最終獲得活性成分靶點269個、白芍138個、熟地黃37個、當(dāng)歸59個、川芎35個,構(gòu)建藥物-活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò),主要活性成分有植物甾醇、山柰酚和β-谷甾醇等,節(jié)點面積越大,Degree值越大。見圖1。

圖1 四物湯-活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)注:BS-白芍,CX-川芎,SD-熟地黃,DG-當(dāng)歸;A1-白芍、川芎、熟地黃共有活性成分,A2-白芍、當(dāng)歸共有活性成分,D1-當(dāng)歸、熟地黃共有活性成分

2.3 疾病靶點獲取及與四物湯靶點交集預(yù)測 獲得四物湯靶點151個。獲得疾病靶點980個。其中,疾病靶點934個,四物湯作用靶點105個,共有靶點46個。見圖2。

圖2 四物湯靶點與疾病靶點的韋恩圖

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 共有相互作用連線306條,節(jié)點46個,其中淺藍(lán)色線表示從已知數(shù)據(jù)庫得來的,紫色線代表經(jīng)拓?fù)鋵W(xué)分析獲得Degree值前20的核心靶點信息。見圖3。其中蛋白激酶B1(V-akt Murine Thymoma Viral Oncogene Homolog 1,AKT1)、胱天蛋白酶3(Caspase-3,CASP3)、JUN原癌基因(JUN Proto-oncogene,JUN)、腫瘤壞死因子(Tumour Necrosis Factor,TNF)、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2(Prostaglandin-endoperoxide Synthases 2,PTGS2)為Degree值前5位。見表2、圖4。

圖3 四物湯和阿爾茨海默病潛在靶點PPI網(wǎng)絡(luò)

圖4 PPI網(wǎng)絡(luò)核心靶點(Top20)注:由上至下為Degree值由大至小

表2 Degree值前20的核心靶點

2.5 GO富集分析 經(jīng)富集分析,生物過程(Biological Progress,BP)顯著富集在藥物反應(yīng)、雌二醇反應(yīng)、脂多糖介導(dǎo)的信號通路、神經(jīng)元凋亡過程的正調(diào)控、一氧化氮合成過程的正調(diào)控等。見圖5。細(xì)胞組分(Cellular Component,CC)顯著富集在細(xì)胞質(zhì)、小凹、線粒體、細(xì)胞膜、軸突、神經(jīng)元胞體、細(xì)胞核、神經(jīng)元投射等。見圖6。分子功能(Molecular Function,MF)顯著富集在酶結(jié)合、蛋白質(zhì)同源二聚化活性、血紅素結(jié)合、激酶活性、藥物結(jié)合、蛋白復(fù)合物結(jié)合、蛋白結(jié)合、蛋白激酶活性、類固醇激素受體活性、半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性參與凋亡過程等。見圖7。

圖6 四物湯GO富集分析細(xì)胞組分注:顏色代表P值,紅色表示P值顯著

圖7 四物湯GO富集分析分子功能注:顏色代表P值,紅色表示P值顯著

2.6 KEGG通路富集分析 與AD密切相關(guān)的通路57個,包括TNF信號通路、多巴胺能神經(jīng)突觸、促分裂原活化的蛋白激酶(Mitogen-activated Protein Kinases,MAPK)信號通路、血管內(nèi)皮生長因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)信號通路、T細(xì)胞受體信號通路、細(xì)胞凋亡、Toll樣受體(Toll-like Receptor,TLRs)信號通路等。見圖8。

圖8 四物湯KEGG通路富集dotplot點圖注:圓點大小代表基因數(shù),圓點面積越大,基因越多;顏色代表P值,紅色表示P顯著

2.7 四物顆粒對Aβ25-35致SH-SY5Y細(xì)胞活力的影響 與Aβ25-3520 μmol/L組比較,其余3組的細(xì)胞活力OD值差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),四物顆粒組與多奈哌齊組與對照組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖9。

圖9 四物顆粒對Aβ誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞活力的影響(n=6)注:SWKL四物顆粒;Donepezil多奈哌齊;與對照組比較,△P<0.05;與Aβ25-3520 μmol/L比較,*P<0.05

2.8 四物顆粒對Aβ25-35致SH-SY5Y細(xì)胞Bcl-2的影響 與Aβ25-3520 μmol/L組比較,四物顆粒顯著增加Bcl-2的表達(dá)(P<0.05),與對照組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖10。

圖10 四物顆粒對對Aβ誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞Bcl-2表達(dá)的影響(n=3)注:SWKL四物顆粒;Donepezil多奈哌齊;A.Bcl-2/β-actin量化分析;B.Bcl-2和β-actin代表性蛋白免疫印跡;與對照組比較,△P<0.05;與Aβ25-3520 μmol/L比較,*P<0.05

3 討論

AD是癡呆最常見的原因之一,臨床以認(rèn)知障礙為特征,記憶障礙最為突出[14]。隨著目前針對單一作用機(jī)制研發(fā)的藥物的失敗,越來越多的研究者認(rèn)為AD為多因素共同作用的疾病,包括Aβ異常沉積、tau蛋白過度磷酸、神經(jīng)炎癥反應(yīng)、線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激以及細(xì)胞凋亡等[4]。因此,目前迫切需要尋找多靶點、多通路的治療方法。中醫(yī)的整體觀念在這一方面優(yōu)勢明顯,田金洲教授以補(bǔ)腎為主,分早(補(bǔ)腎精、益脾氣)、中(瀉火、祛瘀、化痰)、晚期(解毒通絡(luò))辨證治療癡呆的方式取得了很好的臨床效果[15]。這顯示了中醫(yī)在防治AD領(lǐng)域的廣闊前景。四物湯是一切血證的立法方劑,活血而不傷血,補(bǔ)血而不滯血,實為AD患者見血虛血瘀證者的良方,研究顯示,鹽酸多奈哌齊聯(lián)合以四物湯為立法的養(yǎng)血清腦顆粒比單用鹽酸多奈哌齊能夠更好地改善患者的記憶力,尤其是在回憶、再認(rèn)及背數(shù)方面,能更有效地提高簡易智能狀態(tài)評定表評分和神經(jīng)精神癥狀問卷評分[16-17]。

本研究從TCMSP中得到的主要活性成分有芍藥苷、山柰酚、谷甾醇、β-谷甾醇、兒茶素、亞油酸乙酯、楊梅酮、川芎哚、洋川芎醌等。已有研究顯示,芍藥苷顯著抑制了Aβ25-35誘導(dǎo)的C6質(zhì)細(xì)胞一氧化氮的產(chǎn)生并通過調(diào)節(jié)核因子κB通路抑制炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生[18],從而改善炎癥反應(yīng)。山柰酚在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中有抗氧化作用,并對Aβ的形成和聚集起調(diào)節(jié)作用[19];川芎哚及其類似物具有一定的降低血液黏度及改善血液流變學(xué)的作用[20]。

通過構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)得到四物湯和AD的46個共同靶點基因,拓?fù)鋵W(xué)分析Degree值前5位的有AKT1、CASP3、JUN、TNF、PTGS2。ARVANITAKIS等[21]研究顯示,腦AKT磷酸化與AD的神經(jīng)病理和認(rèn)知功能下降有關(guān);CASP3已被確定為神經(jīng)元細(xì)胞死亡的關(guān)鍵中介因子,并被認(rèn)為是AD早期藥物治療的潛在靶點[22];TNF則是參與神經(jīng)炎癥反應(yīng)的主要炎癥介質(zhì);JUN蛋白連接到DNA上組成的JUNB參與細(xì)胞生長、細(xì)胞增殖、細(xì)胞調(diào)亡等多種細(xì)胞活動[23]。

GO富集分析表明藥物反應(yīng)、絲氨酸肽基磷酸化、脂多糖介導(dǎo)的信號通路、神經(jīng)元凋亡過程的正調(diào)控、一氧化氮合成過程的正調(diào)控等多個生物過程與四物湯作用于AD有關(guān)。KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)作用靶點主要富集在TNF信號通路、多巴胺能神經(jīng)突觸、MAPK信號通路、VEGF信號通路、T細(xì)胞受體信號通路、細(xì)胞凋亡、TLR信號通路等,這表明四物湯對AD的干預(yù)是多靶點、多通路的。TLRs和輔受體被激活可誘導(dǎo)Aβ攝取或炎癥反應(yīng),纖維性Aβ可與TLR2、TLR4和CD14直接作用,在AD開始階段可以促進(jìn)對Aβ吞噬作用,但在后期增加或加速神經(jīng)元凋亡[24],并有研究表明,神經(jīng)干細(xì)胞移植能夠抑制APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞上TLR4介導(dǎo)的炎癥通路激活[25]。MAPK被激活后,可使核因子κB和其他蛋白激酶等多種底物磷酸化,在細(xì)胞凋亡過程中起重要作用[26]。黃德弘等[27]研究顯示,加味當(dāng)歸芍藥散可抑制AD大鼠模型的炎癥介質(zhì)及磷酸化MAPK信號分子的過表達(dá),從而抑制腦內(nèi)炎癥。經(jīng)細(xì)胞實驗初步驗證顯示,四物顆粒能夠顯著增加Aβ25-35誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞模型的活力以及抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)。以上研究表明,四物湯可能通過多靶點介導(dǎo)的多個重要信號通路發(fā)揮對AD的治療作用。

本研究探討中醫(yī)“血證”理論防治阿爾茨海默病的理論基礎(chǔ)和現(xiàn)代理論依據(jù),發(fā)現(xiàn)呆病本質(zhì)仍是“虛”,瘀血是其不可忽視的主要病理因素之一,所以,虛瘀合證者,補(bǔ)血活血的四物湯是防治呆病的良方。此外,本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探索四物湯多成分、多靶點、多通路防治AD的作用機(jī)制,發(fā)現(xiàn)四物湯的活性成分可能通過抗氧化、抗細(xì)胞凋亡、減少炎癥反應(yīng)和保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞等機(jī)制發(fā)揮治療AD的作用。因此,對四物湯防治AD的深入研究是具有臨床意義的,后續(xù)需要進(jìn)一步進(jìn)行實驗驗證,為阿爾茨海默病的防治提供新的方法。

利益沖突聲明:無。