李春令,劉增祥,溫成麗,呂實(shí)波,程?hào)|,孫昌華

(1.山東省醫(yī)療器械和藥品包裝檢驗(yàn)研究院,山東 濟(jì)南 250101;2.山東省疾病預(yù)防控制中心,山東 濟(jì)南 250014)

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物機(jī)構(gòu)是科學(xué)研究的基礎(chǔ)平臺(tái)[1],要想獲得準(zhǔn)確的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),必須依靠標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膭?dòng)物實(shí)驗(yàn)過(guò)程、適合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生存的實(shí)驗(yàn)環(huán)境[2]。在生命科學(xué)及生物醫(yī)藥等多行業(yè)、多領(lǐng)域的研發(fā)和各類實(shí)驗(yàn)中,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物起著越來(lái)越重要和不可或缺的基礎(chǔ)性支撐作用[3],通常被稱為“不可替代的活的精密儀器”。隨著人們動(dòng)物保護(hù)意識(shí)的提高,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)帶來(lái)的倫理學(xué)挑戰(zhàn)變得越來(lái)越突出,如何處理好動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與動(dòng)物保護(hù)的關(guān)系已是當(dāng)今社會(huì)關(guān)注的熱點(diǎn)之一[4-6]。

近年來(lái),國(guó)內(nèi)相繼頒布并實(shí)施了一系列的標(biāo)準(zhǔn),例如GB/T 35892-2018《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查指南》[7]、T/CALAS 73-2019《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)工作指南》[8]、DB11/1734-2020《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查技術(shù)規(guī)范》[9]、T/CALAS 31-2017《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物安樂(lè)死指南》[10]、GB/T 39760-2021《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物安樂(lè)死指南》[11]、RB/T 173-2018《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物人道終點(diǎn)評(píng)審指南》[12]。2000年OECD發(fā)布了《應(yīng)用臨床體征識(shí)別、評(píng)估安全性評(píng)價(jià)中動(dòng)物實(shí)驗(yàn)仁慈終點(diǎn)的指南》、美國(guó)國(guó)家科學(xué)院發(fā)布的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)管理和使用指南(第八版)》、加拿大動(dòng)物保護(hù)協(xié)會(huì)(CCAC)發(fā)布了《研究、教學(xué)和檢測(cè)中選擇實(shí)驗(yàn)動(dòng)物仁慈終點(diǎn)指南》、歐盟27國(guó)在2013年實(shí)施的新保護(hù)實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物指令均對(duì)仁慈終點(diǎn)或人道終點(diǎn)的判定及安樂(lè)死的時(shí)機(jī)、方法和評(píng)價(jià)等都做了一些詳細(xì)介紹。人道終點(diǎn)(humane endpoints)亦稱仁慈終點(diǎn),指在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物承受嚴(yán)重疼痛、痛苦和窘迫,或?yàn)l死的早期階段,實(shí)驗(yàn)研究人員人為地介入來(lái)結(jié)束動(dòng)物生命的時(shí)間點(diǎn)即作為試驗(yàn)的終點(diǎn)[13]。2000年OECD(經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織)對(duì)人道終點(diǎn)的定義為:能反映實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遭受嚴(yán)重疼痛、痛苦或?yàn)l臨死亡最早的指標(biāo)[14-15],其核心為“在所提及指標(biāo)出現(xiàn)時(shí)提前對(duì)動(dòng)物實(shí)施安樂(lè)死”。OECD鼓勵(lì)在毒性與安全性的評(píng)估研究中使用人道終點(diǎn)理論,在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遭受疼痛與痛苦前進(jìn)行預(yù)測(cè),充分踐行3R原則。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)隨時(shí)觀察,適時(shí)對(duì)符合人道終止?fàn)顟B(tài)的動(dòng)物及時(shí)終止實(shí)驗(yàn)[1]。

減少(reduction)、替代(replacement)、優(yōu)化(refinement)的“3R”原則是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用和管理領(lǐng)域的國(guó)際發(fā)展趨勢(shì),也是當(dāng)今國(guó)際上開展動(dòng)物試驗(yàn)普遍遵循的動(dòng)物福利原則[1,16-18]。隨著“3R”原則的深入淺出,人道終點(diǎn)逐步被看作“優(yōu)化”原則的重要組成部分,其目的是盡可能減輕實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物遭受的疼痛和痛苦[14,19]。資料表明,研究人員對(duì)不同種屬的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物安樂(lè)死、人道終點(diǎn)的探索從未終止,并進(jìn)行不斷的優(yōu)化和完善[20-35]。通過(guò)對(duì)動(dòng)物人道終點(diǎn)的判定原則和方法進(jìn)行探討,在最大限度保障動(dòng)物福利的前提下,有效保證了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的真實(shí)性、準(zhǔn)確性和完整性,為從事動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的研究人員提供了一定的參考。

1 人道終點(diǎn)判定的基本原則

根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)研究目的,實(shí)驗(yàn)方案制定時(shí)應(yīng)包括動(dòng)物人道終點(diǎn)的時(shí)機(jī),方案需通過(guò)IACUC(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利與倫理委員會(huì))的審核。在實(shí)驗(yàn)方案中應(yīng)明確說(shuō)明試驗(yàn)終點(diǎn)的科學(xué)性、必要性和對(duì)動(dòng)物福利的考慮,對(duì)一些與動(dòng)物福利和倫理相矛盾且必須開展的實(shí)驗(yàn)時(shí),方案中要有充分的理由。

根據(jù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的要求和動(dòng)物狀態(tài),明確人道終點(diǎn)的判定準(zhǔn)則,既要符合現(xiàn)行公認(rèn)原則,又要保證相關(guān)研究人員可以理解、掌握和運(yùn)用[1]。實(shí)驗(yàn)中,人道終點(diǎn)的評(píng)估是個(gè)持續(xù)過(guò)程,當(dāng)研究的科學(xué)目標(biāo)已達(dá)到,沒(méi)必要進(jìn)行下去時(shí),應(yīng)及時(shí)終止并記錄。實(shí)驗(yàn)中,當(dāng)動(dòng)物遭受到非實(shí)驗(yàn)本身引起且未預(yù)料到的意外痛苦時(shí),應(yīng)實(shí)施人道終點(diǎn)并記錄。動(dòng)物遭受的疼痛/痛苦由實(shí)驗(yàn)本身引起且實(shí)驗(yàn)前已有預(yù)料或?qū)嶋H中遭受的痛苦比預(yù)料更嚴(yán)重時(shí)[14],應(yīng)實(shí)施人道終點(diǎn)并記錄。確保專題負(fù)責(zé)人(SD)、IACUC共同參與人道終點(diǎn)的制定。IACUC應(yīng)負(fù)責(zé)監(jiān)督動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過(guò)程中人道終點(diǎn)的判定,及時(shí)制止和糾正不當(dāng)行為,并給予專業(yè)的指導(dǎo),在人道終點(diǎn)的判定和實(shí)施過(guò)程中應(yīng)保證獸醫(yī)的權(quán)威性。人道終點(diǎn)的確定不是一成不變、一勞永逸的事情,它可因動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的研究目的、研究對(duì)象及研究類型等不同而存在差異,它是一個(gè)持續(xù)不斷優(yōu)化的過(guò)程。

2 人道終點(diǎn)的判定方法

選擇和確定人道終點(diǎn)的目的是為了在動(dòng)物因?qū)嶒?yàn)遭受不必要的疼痛和痛苦之前準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)出結(jié)束實(shí)驗(yàn)的終點(diǎn),最大限度地縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間,避免或減輕實(shí)驗(yàn)后期給動(dòng)物造成的疼痛和痛苦[36]。因此,國(guó)際上將人道終點(diǎn)及安樂(lè)死作為一種優(yōu)化策略,用來(lái)減輕動(dòng)物在試驗(yàn)期間遭受的疼痛和痛苦[19]。動(dòng)物人道終點(diǎn)判定,需區(qū)分動(dòng)物疾病和瀕死狀態(tài)。如動(dòng)物出現(xiàn)下列任何癥狀時(shí),應(yīng)考慮執(zhí)行人道處死動(dòng)物的方法[19,37-47]。

2.1 通用性指標(biāo)

2.1.1 體質(zhì)量變化主要包括體質(zhì)量快速下降、成長(zhǎng)期動(dòng)物無(wú)增重,未監(jiān)測(cè)到體質(zhì)量變化動(dòng)物可呈現(xiàn)出惡病質(zhì)狀態(tài)及持續(xù)性肌肉消耗狀況等,還可反映為動(dòng)物食欲不振或廢絕。

2.1.2 外部體征的主要表現(xiàn)各種不良因素引起的全身性脫毛或被毛蓬松或被毛污穢不潔,無(wú)法治療的長(zhǎng)期腹瀉,持續(xù)性的倦怠伴隨蜷縮、弓背、目光呆滯、精神萎靡、嗜睡或持續(xù)躺臥等。

2.1.3 生理指標(biāo)動(dòng)物在疾病發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中,機(jī)體功能和代謝發(fā)生改變的情況。包括可測(cè)量的臨床指標(biāo)如心率、呼吸頻率、體溫、血液、生理生化指標(biāo)等;描述性的臨床癥狀如腹瀉、脫水、漸進(jìn)性皮炎、咳嗽、呼吸困難、鼻腔分泌物、黃疸、發(fā)紺或蒼白、貧血、出血等。

2.1.4 異常行為包括活動(dòng)性下降、警覺(jué)性下降、不活躍、刻板行為、離群、自殘、焦躁不安等。

2.1.5 疼痛/痛苦等級(jí)量化評(píng)分疼痛/痛苦等級(jí)量化評(píng)分主要包括體質(zhì)量變化、體態(tài)、可測(cè)量臨床指標(biāo)、行為、對(duì)外界刺激的反應(yīng)5項(xiàng),評(píng)分分為0～3四個(gè)等級(jí),每個(gè)評(píng)分等級(jí)對(duì)應(yīng)相應(yīng)的變量(見表1)。

表1 疼痛/痛苦等級(jí)量化評(píng)分

2.2 特定性指標(biāo)特定性指標(biāo)指針對(duì)特定研究需特別觀察的指標(biāo)。常見的特定指標(biāo)主要包括以下幾個(gè)指標(biāo)。

2.2.1 毒理學(xué)研究的觀察指標(biāo)一般觀察:脫水,體質(zhì)量下降,身體部位缺失,姿勢(shì)異常,體溫降低,附屬物破潰,腫脹,軟組織腫塊,脫垂,包莖;皮膚和被毛:脫毛、沾尿液或糞便、蒼白、紅腫、發(fā)紺、黃疸、傷口、膿腫、潰瘍;眼睛:眼球突出,眼球下垂,紅眼,流淚,眼球渾濁;口、鼻、頭部:斜頸,流涕,牙齒咬合不全,流涎;呼吸:打噴嚏,呼吸困難,呼吸急促;尿液:變色,血尿,多尿,無(wú)尿;糞便:變色,血便,稀便/腹瀉;運(yùn)動(dòng):多動(dòng)、昏迷、共濟(jì)失調(diào)、轉(zhuǎn)圈、肌肉震顫。

2.2.2 腫瘤研究的相關(guān)指標(biāo)常規(guī)實(shí)驗(yàn),腫瘤負(fù)擔(dān)不應(yīng)超過(guò)動(dòng)物正常體重的5%;治療性實(shí)驗(yàn)中,不能超過(guò)動(dòng)物體重的10%;腫瘤不能到達(dá)嚴(yán)重影響動(dòng)物行使正常功能的位置,或由于腫瘤的生長(zhǎng)引起動(dòng)物痛苦(固體腫瘤);動(dòng)物減輕的體重超過(guò)正常體重的20%(應(yīng)考慮到腫瘤所占的重量);腫瘤生長(zhǎng)部位出現(xiàn)潰瘍或感染;轉(zhuǎn)移到其他組織器官;持續(xù)的自殘行為。

2.2.3 感染性研究的相關(guān)指標(biāo)動(dòng)物體溫降低超出一定限度(如超過(guò)4～6 ℃);體重下降,如減輕(下降10%～20%)可作為人道終點(diǎn)重要指標(biāo);活動(dòng)次數(shù)減少、嗜睡等其他異常生理和行為變化。

2.3 大動(dòng)物(含非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物)人道終點(diǎn)的判定未麻醉或鎮(zhèn)靜狀態(tài)下,動(dòng)物無(wú)法站立或極度勉強(qiáng)才可站立長(zhǎng)達(dá)24 h。高溫或低溫超過(guò)24 h且經(jīng)過(guò)相應(yīng)的治療無(wú)改善。體質(zhì)量降低15%～20%,或動(dòng)物出現(xiàn)惡病質(zhì)或消耗性疾病。動(dòng)物食欲廢絕達(dá)5 d或飲欲廢絕達(dá)3 d,或食欲、飲欲減退(低于正常量的50%)分別達(dá)7 d和5 d且經(jīng)治療無(wú)改善。動(dòng)物感染情況明確可知,或因動(dòng)物體溫升高、白細(xì)胞數(shù)目增加并診斷為感染,在抗生素治療無(wú)效并伴隨動(dòng)物全身性不適癥狀出現(xiàn)時(shí)。出現(xiàn)器官功能喪失的臨床癥狀且治療無(wú)效,或經(jīng)獸醫(yī)判定預(yù)后不良時(shí)。包括但不限于:心血管系統(tǒng):失血過(guò)量、給予輸液治療后仍然貧血(低于20%);呼吸系統(tǒng):呼吸困難、發(fā)紺;消化系統(tǒng):嚴(yán)重嘔吐或下痢、消化道阻塞、套疊或腹膜炎;泌尿道系統(tǒng):腎衰竭(肌酐、尿素氮值升高超過(guò)正常范圍2倍以上);肌肉骨骼系統(tǒng):肌肉受損或骨折導(dǎo)致肢體功能喪失;皮膚:無(wú)法治愈的傷口,反復(fù)性自殘;神經(jīng)系統(tǒng):中樞神經(jīng)抑制(長(zhǎng)時(shí)間對(duì)外界刺激無(wú)反應(yīng))、震顫、痙攣、癱瘓、對(duì)止痛劑治療無(wú)效的疼痛。

3 動(dòng)物瀕死期的判定

瀕死期又稱臨終期,是死亡過(guò)程的開始階段。這個(gè)時(shí)期動(dòng)物各系統(tǒng)的功能嚴(yán)重紊亂,中樞神經(jīng)系統(tǒng)自腦干以上功能處于抑制狀態(tài)。動(dòng)物表現(xiàn)為意識(shí)模糊或消失,臥地昏迷,呼喚不應(yīng),對(duì)刺激幾乎無(wú)反應(yīng),機(jī)體反射反應(yīng)減弱或消失;體質(zhì)量消瘦,嚴(yán)重時(shí)可呈惡病質(zhì)狀態(tài);體溫驟降;瞳孔呈散大狀態(tài);心臟減弱、心率波動(dòng);血壓下降;呼吸微弱而不穩(wěn),或出現(xiàn)病理性的呼吸。瀕死期的持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)短不一,主要與動(dòng)物的死因、機(jī)體狀態(tài)和救治情況等因素有關(guān),可從幾秒鐘到數(shù)小時(shí),甚至?xí)L(zhǎng)。

在藥理、毒理學(xué)等動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,為了獲取實(shí)驗(yàn)的第一手?jǐn)?shù)據(jù),對(duì)瀕死期的動(dòng)物采用人道終點(diǎn)的判定原則和方法是非常必要的,尤其是在新藥研發(fā)或藥物非臨床安全性評(píng)價(jià)研究過(guò)程中為及早獲取動(dòng)物的死亡原因提供了寶貴的資料。通過(guò)及時(shí)、及早地發(fā)現(xiàn)并判定瀕死動(dòng)物,為后續(xù)的緊急剖檢、采血、采尿(如果可能)、組織臟器的摘取提供了可能性和可操作性,可獲取血液學(xué)、血清生化、血凝學(xué)、尿液(如果可能)等臨床檢驗(yàn)指標(biāo)所需樣本,對(duì)摘取的動(dòng)物臟器進(jìn)行詳細(xì)大體病理學(xué)檢查和組織病理學(xué)檢查,通過(guò)對(duì)臨床檢驗(yàn)數(shù)據(jù)、病理學(xué)檢查結(jié)果、動(dòng)物體質(zhì)量變化及大體癥狀觀察進(jìn)行綜合分析,為判定藥物的毒性或毒性靶器官提供了極為重要的參考依據(jù)。

4 結(jié)語(yǔ)

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)是生命科學(xué),特別是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究中的重要條件和基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物被研究人員公認(rèn)為“活的試劑”“活的精密儀器”,其自身常常作為藥物安全性評(píng)價(jià)的特殊載體,其生存狀態(tài)和福利的好壞直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果,所以深入探討動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中人道終點(diǎn)的判定與應(yīng)用,在動(dòng)物福利和倫理越來(lái)越受到關(guān)注的今天顯得尤為重要。近年來(lái),雖然我國(guó)在人道終點(diǎn)的研究和應(yīng)用方面取得了一定進(jìn)展,但是與西方發(fā)達(dá)國(guó)家相比仍然存在許多不完善之處,需要不斷的改進(jìn)。如何科學(xué)合理地確定動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的人道終點(diǎn),在實(shí)現(xiàn)研究目的的同時(shí),最大限度地減輕實(shí)驗(yàn)動(dòng)物所承受的疼痛和痛苦,是動(dòng)物使用計(jì)劃中一項(xiàng)重要的工作。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物行業(yè)或領(lǐng)域內(nèi)要努力遵循“3R”原則,在科學(xué)、合理、人道的使用動(dòng)物的同時(shí),促進(jìn)生命科學(xué)、生物醫(yī)藥研究與人類道德文明同步和諧發(fā)展[48-50]。

目前,各從事動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的研究機(jī)構(gòu)、CRO公司對(duì)動(dòng)物人道終點(diǎn)的判定和應(yīng)用尤其是對(duì)瀕死期或需要人道終點(diǎn)的動(dòng)物存在著標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一、參差不齊的現(xiàn)狀,故此類動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)誤差較大。本文通過(guò)對(duì)動(dòng)物人道終點(diǎn)的判定原則和方法進(jìn)行詳細(xì)和深入的探討,結(jié)合實(shí)踐中總結(jié)出的一點(diǎn)心得,難免存在不足之處,僅供同道們參考。同時(shí),希望大家能夠進(jìn)一步深刻理解和踐行實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利、倫理相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)和要求,不斷完善動(dòng)物人道終點(diǎn)的適用原則和范圍并靈活應(yīng)用,在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中不斷的獲取新的經(jīng)驗(yàn)、認(rèn)知和其他良好實(shí)踐,以指導(dǎo)人道終點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)不斷持續(xù)的改進(jìn)和完善。