董蓬,王小兵,李啟艷,吳曉云,于海英,謝強(qiáng)勝,郭東曉

(山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院,國(guó)家藥品監(jiān)督管理局化妝品原料質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,特色植物資源化妝品濟(jì)南市工程研究中心,山東 濟(jì)南 250101)

沙棘為胡頹子科沙棘屬植物Hippophae[1-3]的干燥成熟果實(shí)?！吨袊?guó)藥典》收載的沙棘(HippophaerhamnoidesLinn.)又名醋柳(山西)、黃酸刺、酸刺柳(陜西)、黑刺(青海)、酸刺(內(nèi)蒙古),主產(chǎn)于內(nèi)蒙古、河北、山西、陜西、甘肅、寧夏等省[4-5],是原國(guó)家醫(yī)藥局和原衛(wèi)生部聯(lián)合公布的藥食同源植物。沙棘的籽、果皮、果實(shí)及果渣中都有一定量的油脂,成熟的沙棘籽中含有8%～20%的油脂,研究發(fā)現(xiàn)沙棘籽油中含有維生素E、類胡蘿卜素、不飽和脂肪酸等人體必需的多種營(yíng)養(yǎng)成分,有輔助降血脂、保肝、抗氧化、醒脾健胃等多種作用,在醫(yī)藥及保健食品領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景[6-9]。

維生素E即生育酚,是人體必需的脂溶性維生素,也是良好的抗氧化劑和營(yíng)養(yǎng)劑,在水果、蔬菜、堅(jiān)果及糧食等食物中廣泛存在。天然維生素E主要有4種,即α、β、γ和δ-生育酚,其中α-生育酚活性最強(qiáng)。生育酚具有多種生物活性,包括抗癌、抗衰老、抗動(dòng)脈硬化、護(hù)肝、預(yù)防白內(nèi)障、延緩早老性癡呆、治療胃潰瘍、調(diào)節(jié)血壓等[10-11]。

目前,已批準(zhǔn)的沙棘籽油單方保健食品(沙棘籽油系以沙棘籽為原料經(jīng)壓榨、浸出、超臨界CO2萃取等方法提取獲得)主要?jiǎng)┬蜑檐浤z囊,均采用企業(yè)自擬標(biāo)準(zhǔn),各企業(yè)對(duì)其產(chǎn)品中生育酚類成分的在檢驗(yàn)方法、指標(biāo)成分?jǐn)?shù)量、含量限度等質(zhì)量控制方面存在較大差異,這也導(dǎo)致各企業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量差異較大。為了更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量,我們建立了沙棘籽油軟膠囊中4種主要生育酚類成分的含量測(cè)定方法。

1 儀器和試劑、試藥

1.1 儀器Waters2695e高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司);Mettler Toledo電子天平(瑞士梅特勒-托利多集團(tuán));KQ-500E型醫(yī)用超聲洗器(昆山超聲儀器有限公司)。

1.2 試劑、試藥甲醇為色譜純,購(gòu)自天津康科德科技有限公司;其他試劑均為分析純。α-生育酚購(gòu)自Sigma公司,批號(hào):LRAB6618;β-生育酚對(duì)照品購(gòu)自北京曼哈格生物科技有限公司,批號(hào):20139-810;γ-生育酚購(gòu)自Sigma公司,批號(hào):LRAB6868;δ-生育酚購(gòu)自Sigma公司,批號(hào):LRAB6868。3批樣品購(gòu)自河北神興沙棘研究所,批號(hào)分別為20171104、20171105、20171106(規(guī)格均為0.65 g/粒);2批樣品購(gòu)自內(nèi)蒙古宇航人高技術(shù)產(chǎn)業(yè)有限責(zé)任公司,批號(hào)分別為20171101、20180120(規(guī)格均為0.5 mL/粒)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件色譜柱為Agilent Poroshell 120 PFP柱(4.6 mm×250 mm,4 μm);流動(dòng)相為甲醇-水(94∶6);檢測(cè)波長(zhǎng)為294 nm;柱溫為26 ℃;流速為0.9 mL·min-1;進(jìn)樣量為10 μL。

2.2 對(duì)照品溶液的制備分別取α、β、γ和δ-生育酚適量,精密稱定,加無水乙醇制成每l mL含1.00 mg的單標(biāo)溶液,作為儲(chǔ)備溶液。分別精密量取5.0 mL,置同一50 mL量瓶中,用甲醇定容至刻度,4種生育酚濃度約為100 μg·mL-1,作為混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中間液。分別精密量取0.2、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL于10 mL棕色容量瓶中,用甲醇定容至刻度,作為標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。同時(shí)對(duì)對(duì)照品溶液進(jìn)行含量標(biāo)定。

2.3 供試品溶液的制備[12]皂化:取本品0.5 g,精密稱定,置150 mL平底燒瓶中,加入1.0 g抗壞血酸和0.1 g二丁基羥基甲苯(BHT),混勻,加入30 mL無水乙醇,加入20 mL氫氧化鉀溶液(50 g/100 g),沸水浴中回流皂化30 min,皂化后立即用冷水冷卻至室溫。

提取:將皂化液用30 mL水轉(zhuǎn)移至250 mL的分液漏斗中,加入50 mL石油醚(60～90 ℃)-乙醚混合液(體積比1∶1),振蕩萃取5 min,將下層溶液轉(zhuǎn)移至另一250 mL的分液漏斗中,加入50 mL的混合醚液再次萃取,合并醚層。

洗滌:用約100 mL水洗滌醚層,重復(fù)3次,直至將醚層洗至中性,去除下層水相。

濃縮:經(jīng)洗滌后的醚層經(jīng)無水硫酸鈉(約3 g)濾入250 mL旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中,用約15 mL石油醚(60～90 ℃)沖洗分液漏斗及無水硫酸鈉2次,并入蒸發(fā)瓶中,并將其接在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上,于40 ℃水浴中減壓蒸餾,待瓶中醚液剩下約2 mL時(shí),取下蒸發(fā)瓶,立即用氮?dú)獯抵两?。用甲醇分次將蒸發(fā)瓶中殘留物溶解并轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中,定容至刻度,濾過,供HPLC測(cè)定。

除不加樣品外,其余同供試品溶液制備方法制得陰性對(duì)照樣品溶液,結(jié)果見圖1。

1.δ-生育酚;2.β-生育酚;3.γ-生育酚;4.α-生育酚圖1 HPLC色譜圖

2.4 線性取標(biāo)準(zhǔn)系列溶液,按上述色譜條件,注入液相色譜儀,測(cè)得峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo),對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算回歸方程,結(jié)果見表1。

表1 線性關(guān)系考察

2.5 精密度試驗(yàn)取同一混合對(duì)照品溶液,每次進(jìn)樣10 μL,連續(xù)進(jìn)樣6次,測(cè)定4種生育酚的(A)峰面積值,結(jié)果RSD在1.15%～1.67%之間,表明精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一混合對(duì)照品溶液,在0、2、4、6、12、24 h分別進(jìn)樣10 μL,測(cè)定4種生育酚的(A)峰面積值,結(jié)果RSD在1.07%～1.78%之間,表明在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)取批號(hào)為20171104的供試品,按照“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份,α、β、γ和δ-生育酚平均含量分別為91.1、16.3、65.9、8.5 mg/100 g,4種成分含量測(cè)定值(n=6)RSD在0.85%～1.56%之間。

2.8 回收率試驗(yàn)精密稱取批號(hào)為20171104(α、β、γ和δ-生育酚含量分別為91.1、16.3、65.9、8.5 mg/100 g)的供試品6份,每份約0.25g,精密加入4種生育酚的混合對(duì)照品溶液(α、β、γ和δ-生育酚濃度分別為0.228 7、0.046 6、0.183 7、0.022 2 mg·mL-1)1 mL,置同一150 mL平底燒瓶中,按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,照“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定,計(jì)算回收率,結(jié)果見表2～5。

表2 α-生育酚加標(biāo)回收試驗(yàn)

表4 γ-生育酚加標(biāo)回收試驗(yàn)數(shù)據(jù)

表5 δ-生育酚加標(biāo)回收試驗(yàn)數(shù)據(jù)

2.9 樣品測(cè)定取樣品,按上述方法進(jìn)行處理,測(cè)定含量,結(jié)果見表6。

3 討論

在生育酚含量測(cè)定樣品處理過程中,考察了皂化時(shí)間的影響,分別考察了皂化10、20、30、40 min,結(jié)果皂化10、20 min所測(cè)含量偏低,而30、40 min所測(cè)含量基本一致,為提高效率,選擇皂化30 min。在固定檢測(cè)波長(zhǎng)294 nm的情況下,采用乙腈-水和甲醇-水及不同的比例試驗(yàn),最后確定以甲醇-水(94∶6)為流動(dòng)相,4種生育酚的分離效果最好。

沙棘籽油中營(yíng)養(yǎng)成分復(fù)雜,為全面反映產(chǎn)品質(zhì)量,應(yīng)加強(qiáng)各類成分的質(zhì)量控制方法開發(fā),推動(dòng)制定相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),從而保障其安全性、有效性和質(zhì)量可控性。本文建立了沙棘籽油軟膠囊中4種主要生育酚的含量測(cè)定方法,該方法重復(fù)性好、專屬性強(qiáng),為其質(zhì)量控制提供了技術(shù)支持。