陶禹,劉文娟,馬茜茜*,付丹妮*

(1.內(nèi)蒙古民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院,內(nèi)蒙古 通遼 028000;2.內(nèi)蒙古自治區(qū)蒙藥心腦血管藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,內(nèi)蒙古 通遼 028000)

現(xiàn)在生活和工作節(jié)奏不斷加快,人們的壓力也越來越大,造成很多人睡眠不均,飲食不規(guī)律,進(jìn)而出現(xiàn)肝臟脂肪代謝異常,困倦乏力,面色發(fā)黃,食欲不振,惡心,厭油等一系列癥狀,最終演變?yōu)橐环N慢性疾病——非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。NASH是現(xiàn)在常見的一種脂肪性肝病,進(jìn)一步發(fā)展可能導(dǎo)致肝纖維化、肝硬化等肝臟的終末期疾病狀態(tài)[1],造成不可逆性損傷。近幾年,NASH的發(fā)病率逐年增加,已成為我國第一大肝病,但截至目前NASH的作用機(jī)理仍不明確,還需進(jìn)一步研究。西醫(yī)對癥治療NASH的方法主要是保肝護(hù)肝、降低血脂、抗氧化等,具有見效快,服用方法簡便等特點(diǎn),但普遍存在治療效果不明顯、毒副作用較大,還可能存在其他不良反應(yīng),對人體健康不利。中醫(yī)則不同,治療的目的在于調(diào)理機(jī)體,提高免疫力,運(yùn)用整體觀念和辨證施治,治療方法多為保肝護(hù)肝調(diào)肝,在治療NASH上具有明顯療效;且從肝脾腎辨證論治入手,在痊愈率、有效率和改善肝功能等方面均明顯優(yōu)于西藥[2];中藥治療也未發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)。中藥又多配伍使用,復(fù)方治療效果更加顯著,是本病的治療方法之一。

中醫(yī)方面指出:肝郁,脾虛為本病的基本病理病機(jī),痰濕、氣滯、血瘀、熱邪為本病的主要病理產(chǎn)物,又主要以痰濕為主。本病的病位主要在肝、脾胃,痰濕、氣滯等基本病理因素,熱邪在該病的發(fā)展過程中起著重要的作用,而該病日久不愈,遷延日久,瘀血內(nèi)生,多種病理因素相互作用,相互影響,導(dǎo)致該病逐漸發(fā)展。

《金匱要略》云:“見肝之病,當(dāng)先實(shí)脾”,因其相克之聯(lián)系,故保肝護(hù)肝多先健脾[3]。在中藥著作《神農(nóng)本草經(jīng)》《本草衍義》中,蒼術(shù)乃是一味化濕藥,味辛、苦,性溫,歸脾、胃、肝經(jīng),能補(bǔ)脾燥濕,祛風(fēng)散寒,消食,明目,主要治療由脾胃濕熱引起的食欲不振,厭食,消化不良,惡心嘔吐,起到健脾祛濕的功效。氣機(jī)郁滯,肝氣郁結(jié),最常見的原因是受情緒的影響,導(dǎo)致肝氣疏泄,進(jìn)而出現(xiàn)胸悶氣短、兩脅脹痛、惡心、疲倦乏力,急躁焦慮抑郁等癥狀;或者出現(xiàn)口干、噯氣,便秘等病癥;或者影響脾胃消化的功能,從而出現(xiàn)了脾胃不適,偶有消化道出血,嚴(yán)重的會出現(xiàn)肝衰竭。于臟腑則表現(xiàn)為肝熱、肺熱、腸熱或者肝胃俱熱、胃腸俱熱等,形成內(nèi)熱的核心機(jī)制,推動高血脂、脂肪肝的發(fā)生[4]。桂枝則是一味解表劑,辛、甘、溫,可發(fā)汗解肌,溫經(jīng)通脈,止煩出汗,除風(fēng)寒濕痹,另外可以助陽化氣,治腎虛痹證,平?jīng)_將氣。兩者都對NASH的治療有一定功效,但二者配伍使用的作用機(jī)理尚不明確。因此,討論蒼術(shù)-桂枝治療NASH的作用機(jī)理,加以運(yùn)用,可以有效治療NASH。

近年來,網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)越來越多地被用于醫(yī)藥研究方面,尤其是中醫(yī)藥。一方面,網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)透徹地剖析單味中藥或者中藥方劑“多成分”“多途徑”的作用體系,展現(xiàn)出與特定疾病關(guān)聯(lián)的“成分-疾病-靶點(diǎn)-途徑”,明確中藥復(fù)方效用的物質(zhì)過程及作用機(jī)制;另一方面,網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)注重提高藥物醫(yī)治效果,減小毒副作用,廣泛用于臨床新藥研發(fā),節(jié)省藥物研發(fā)費(fèi)用。因此,本次使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法,主要探論蒼術(shù)-桂枝治療NASH的作用機(jī)理,為治療NASH提供參考。

1 資料與方法

1.1 蒼術(shù)-桂枝成分的收集分別以蒼術(shù)、桂枝為對象,在TCMSP中藥數(shù)據(jù)庫篩選蒼術(shù)、桂枝成分,參考 TCMSP數(shù)據(jù)庫使用指南,以“OB 值≥30%并且DL≥0.18”為基本條件[5],篩選蒼術(shù)和桂枝的有效活性成分。

1.2 蒼術(shù)-桂枝作用靶點(diǎn)的收集基于上述篩選得到的有效成分,收集蒼術(shù)、桂枝的潛在作用靶點(diǎn),并在Uniport數(shù)據(jù)庫修正相關(guān)靶點(diǎn)簡稱,然后通過Swiss Target Prediction進(jìn)一步補(bǔ)充蒼術(shù)、桂枝的靶點(diǎn)。

1.3 NASH靶點(diǎn)的收集以關(guān)鍵詞Nonalcoholic Steatohepatitis(NASH)在Gene Cards和OMIM疾病數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索,得到NASH的相關(guān)靶點(diǎn)信息。

1.4 預(yù)測蒼術(shù)-桂枝對抗NASH的作用靶點(diǎn)將蒼術(shù)、桂枝與NASH的靶點(diǎn)分別錄入到draw venn diagram中,繪制韋恩圖,得到蒼術(shù)與桂枝、蒼術(shù)-桂枝與NASH的交集靶點(diǎn),即可能為蒼術(shù)-桂枝對抗NASH的作用靶點(diǎn)。

1.5 描繪“藥物-成分-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖將蒼術(shù)-桂枝與NASH交集靶點(diǎn)導(dǎo)入到可視化軟件Cytoscape中,生成蒼術(shù)-桂枝與NASH關(guān)聯(lián)的“藥物-成分-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖,對大小、形狀、顏色等進(jìn)一步優(yōu)化。

1.6 蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建String數(shù)據(jù)庫可以收集靶點(diǎn)并作出簡單的PPI網(wǎng)絡(luò)圖,輸入蒼術(shù)-桂枝與NASH交集靶點(diǎn),獲取PPI網(wǎng)絡(luò)及數(shù)據(jù)信息,然后將數(shù)據(jù)導(dǎo)入 Cytoscape 可視化作圖軟件中,優(yōu)化PPI網(wǎng)絡(luò)圖,分析關(guān)鍵靶點(diǎn)信息。

1.7 富集分析與分子對接利用DAVID富集分析平臺,分析蒼術(shù)-桂枝與NASH的主要BP、CC、MF和關(guān)鍵通路,得到蒼術(shù)-桂枝治療NASH的過程通路,并作出其通路分析氣泡圖和功能分析柱狀圖。

在化合物數(shù)據(jù)庫Pubchem得到交集靶點(diǎn)對應(yīng)的活性成分的2D結(jié)構(gòu),制作分子對接的結(jié)構(gòu)文件,把文件導(dǎo)入用PyMOL軟件,通過對核心組分和靶點(diǎn)的分子對接驗(yàn)證,得到相關(guān)的結(jié)合能數(shù)據(jù)和分子對接圖像。

2 結(jié)果

2.1 蒼術(shù)-桂枝成分的收集在TCMSP中藥數(shù)據(jù)分析平臺,根據(jù)OB≥30%,同時(shí) DL≥0.18 進(jìn)行篩選, 共得到蒼術(shù)9個(gè),桂枝7個(gè)(見表1),包括漢黃芩素(wogonin)、NSC63551、3β-乙酰氧基白術(shù)酮(3β-acetoxyatractylone)、β-胡蘿卜素(β-daucosterol_qt)、β-谷甾醇(β-sitosterol)、過氧麥角甾醇(Peroxyergosterol)、紫杉葉素(taxifolin)、表兒茶素(ent-Epicatechin)等。

表1 蒼術(shù)有效活性成分

表2 桂枝有效活性成分表

2.2 蒼術(shù)-桂枝作用靶點(diǎn)的收集按照“2.1”項(xiàng)下篩選的有效活性成分,檢索其靶點(diǎn)信息,并通過Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫預(yù)測補(bǔ)充,共得到蒼術(shù)靶點(diǎn)273個(gè),桂枝靶點(diǎn)110個(gè)(去重后)。

2.3 NASH靶點(diǎn)的收集在Gene Cards和OMIM疾病數(shù)據(jù)庫共得到NASH的疾病靶點(diǎn)656個(gè)(去重后)(部分見表3)。

表3 NASH部分靶點(diǎn)

2.4 預(yù)測蒼術(shù)-桂枝對抗NASH的作用靶點(diǎn)將上述“2.2”和“2.3”項(xiàng)下得到的蒼術(shù)、桂枝、NASH的作用靶點(diǎn)分別輸入到draw venn diagram中,得到蒼術(shù)與桂枝交集靶點(diǎn)74個(gè)(見圖1),蒼術(shù)-桂枝與NASH的交集靶點(diǎn)77個(gè)(見圖2),其中的26個(gè)靶點(diǎn)可能為蒼術(shù)-桂枝對抗NASH的潛在作用靶點(diǎn),如PPARD、HMGCR、NOS2、SLC6A4、PTPN1、RXRA、CYP2C19等。

圖1 蒼術(shù)-桂枝交集靶點(diǎn)

圖2 蒼術(shù)-桂枝與NASH的交集靶點(diǎn)

2.5 構(gòu)建“蒼術(shù)-桂枝-成分-NASH-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖在可視化軟件Cytoscape中導(dǎo)入有關(guān)文件,制作“蒼術(shù)-桂枝-成分-NASH-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖(見圖3)。圖中共有91個(gè)點(diǎn),191條邊,其中最中間的橙色菱形代表蒼術(shù)-桂枝與非酒精性脂肪性肝炎交集靶點(diǎn),共26個(gè),中間外圈紫色代表蒼術(shù)與NASH交集靶點(diǎn),共42個(gè),綠色代表藥物桂枝與NASH交集靶點(diǎn),共9個(gè),左側(cè)藍(lán)色圓圈代表蒼術(shù)與桂枝的有效成分,共11個(gè),中間紅色為蒼術(shù)-桂枝藥對,最右側(cè)棕色為NASH。表明蒼術(shù)-桂枝的有效活性成分通過PPARD、HMGCR、NOS2、SLC6A4、PTPN1、RXRA、CYP2C19、NR1H3、CES2等靶點(diǎn)對治療NASH起作用。

圖3 蒼術(shù)-桂枝與NASH的“藥物-成分-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

2.6 蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)分析在String數(shù)據(jù)庫導(dǎo)入蒼術(shù)-桂枝與NASH的交集靶點(diǎn)信息,獲得PPI網(wǎng)絡(luò),并把得到的相關(guān)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape可視化作圖軟件中,制作清晰明了的PPI網(wǎng)絡(luò)圖(見圖4),根據(jù)網(wǎng)絡(luò)分析各節(jié)點(diǎn)degree值,設(shè)置其大小、位置、顏色,degree值越大,字體,圖案越大,位置越靠近最里圈,顏色也越深,并根據(jù)Cytoscape軟件內(nèi)的插件Centiscape 2.2依據(jù)Closeness、Betweenness、Degree篩選出蒼術(shù)-桂枝對抗NASH的關(guān)鍵靶點(diǎn)16個(gè),分別是ACE、APOB、CAT、TP53、EGFR、PPARG、ESR1、PPARA、AKT1、PTGS2、FN1、IL-6、TNF、FASN、CTNNB1、RXRA。

圖4 蒼術(shù)-桂枝與NASH交集靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

2.7 富集分析將從韋恩圖得到的77個(gè)交集靶點(diǎn)導(dǎo)入David富集分析平臺進(jìn)行富集分析,得到GO與KEGG數(shù)據(jù)。

2.7.1 富集分析根據(jù)P值<0.001篩選出:10種BP,10個(gè)CC,10個(gè)MF,并在微生信作圖網(wǎng)絡(luò)中作出其GO功能富集分析柱狀圖(見圖5)。其中炎癥反應(yīng)[6]、膽固醇穩(wěn)態(tài)[7]、細(xì)胞對脂多糖[8]的反應(yīng)、膽固醇代謝過程、胰島素分泌的調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)[6]的積極調(diào)節(jié);脂質(zhì)顆粒、高分子絡(luò)合物;肝素[9]結(jié)合等,參與蒼術(shù)-桂枝治療NASH的過程。由此可見,蒼術(shù)-桂枝治療NASH的作用機(jī)制是由多種生物過程,多個(gè)細(xì)胞組分和多個(gè)分子功能相互協(xié)助,共同作用實(shí)現(xiàn)的。

同樣根據(jù)P<0.001篩選出13條信號通路,并利用微生信作出氣泡圖(見圖6),提示蒼術(shù)-桂枝可能主要通過這些通路對抗NASH,發(fā)揮作用,脂質(zhì)與動脈粥樣硬化、內(nèi)分泌抵抗、丙型肝炎、胰島素抵抗[10]、非酒精性脂肪肝[11]等,其中,有10個(gè)靶點(diǎn)落在胰島素抵抗的通路上,分別為:IKBKB、PTPN1、IL-6、MAPK8、NR1H2、INSR、NR1H3、AKT1、PPARA、TNF;有11個(gè)靶點(diǎn)落在非酒精性脂肪肝上,分別為:IKBKB、IL-6、MAPK8、RXRA、CXCL8、INSR、NR1H3、AKT1、PPARG、PPARA、TNF。綜上所述,蒼術(shù)-桂枝是通過以上多個(gè)通路治療NASH。

圖6 交集靶點(diǎn)KEGG通路富集分析氣泡

2.7.2 分子對接驗(yàn)證結(jié)果將準(zhǔn)備的結(jié)構(gòu)文件導(dǎo)入用PyMOL分子對接軟件中運(yùn)行得到成分與靶點(diǎn)的分子對接圖像(見圖7)和結(jié)合能信息(見表4),結(jié)果發(fā)現(xiàn):蒼術(shù)的漢黃芩素與PTGS2有較強(qiáng)的結(jié)合能,能作用于上述通路發(fā)揮作用,很好的治療NASH。

圖7 部分成分與靶點(diǎn)的分子對接圖像[從上到下分別為Taxifolin與APOB,Peroxyergostero與FASN,(+)-catechin 與RXRA]

表4 蒼術(shù)-桂枝與NASH部分成分-靶點(diǎn)對接結(jié)果

3 討論

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和相關(guān)文獻(xiàn)分析蒼術(shù)-桂枝對抗NASH的作用機(jī)制,最終發(fā)現(xiàn)蒼術(shù)-桂枝可能通過漢黃芩素、β-胡蘿卜素、紫衫葉素、表兒茶素、β-谷甾醇等有效活性成分,作用于ACE、APOB、CAT、TP53、EGFR、PPARG、ESR1、PPARA、AKT1、PTGS2、FN1、IL-6、TNF、FASN、CTNNB1、RXRA等靶點(diǎn),參與炎癥反應(yīng)、膽固醇穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞對脂多糖的反應(yīng)、膽固醇代謝過程、胰島素分泌的調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)的積極調(diào)節(jié)等生物過程,調(diào)控脂質(zhì)與動脈粥樣硬化、內(nèi)分泌抵抗、丙型肝炎、胰島素抵抗、非酒精性脂肪肝等信號通路,進(jìn)而證明蒼術(shù)-桂枝在治療NASH方面起作用,分子對接結(jié)果也驗(yàn)證本次研究數(shù)據(jù)的可靠性,但缺乏實(shí)驗(yàn)證據(jù),希望以后可以通過實(shí)驗(yàn)證明。

4 結(jié)論

NASH的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,涉及脂質(zhì)沉積、炎癥、氧化應(yīng)激、纖維化、膽汁酸異常代謝、腸道菌群失調(diào)和易感基因變異之間復(fù)雜的相互作用[10],本次研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析方法,剖析蒼術(shù)-桂枝治療NASH的作用機(jī)制,共得到16個(gè)有效活性成分。在蒼術(shù)的成分中,漢黃芩素[12]對炎癥反應(yīng)起到抑制的作用;β-胡蘿卜素[13]具有抗氧化的作用,在桂枝的成分中,紫衫葉素[14]更是直接通過抵制炎癥從而治療NASH;表兒茶素[15]在對抗肝纖維化起到顯著作用。β-谷甾醇[16]既有抗炎作用又有抗氧化作用。383個(gè)潛在作用靶點(diǎn),NASH有656個(gè)靶點(diǎn),通過韋恩圖分析得知三者交集靶點(diǎn)共77個(gè),進(jìn)而猜測蒼術(shù)-桂枝是通過這些成分和靶點(diǎn)對NASH起到治療的作用。在PPI網(wǎng)絡(luò)分析中發(fā)現(xiàn),degree值越大,越有可能起到治療作用,并根據(jù)Cytoscape軟件內(nèi)的插件Centiscape 2.2依據(jù)Closeness、Betweenness、Degree篩選出14個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn),進(jìn)一步證明蒼術(shù)-桂枝藥對是通過多成分,多靶點(diǎn)醫(yī)治NASH[17-19]。

接下來為了進(jìn)一步證明二者作用機(jī)制,又通過富集分析。結(jié)果顯示,二者聯(lián)合多種生物過程,細(xì)胞成分,分子功能,多種通路共同作用:上述成分和靶點(diǎn)參與炎癥反應(yīng)、膽固醇穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞對脂多糖的反應(yīng)、膽固醇代謝過程、胰島素分泌的調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)的積極調(diào)節(jié)等生物過程,調(diào)控脂質(zhì)與動脈粥樣硬化、內(nèi)分泌抵抗、丙型肝炎、胰島素抵抗、非酒精性脂肪肝等信號通路,表明蒼術(shù)-桂枝藥對確實(shí)對治療NASH起作用[20-22]。最后,分子對接驗(yàn)證結(jié)果表明,蒼術(shù)的漢黃芩素與PTGS2有較強(qiáng)的結(jié)合能,桂枝的過氧麥角甾醇與FASN有較強(qiáng)的結(jié)合能,桂枝的(+)-兒茶素與RXRA有較強(qiáng)的結(jié)合能。這些結(jié)果更加說明蒼術(shù)與桂枝的核心活性成分與靶點(diǎn)之間具有較強(qiáng)聯(lián)系,通過多條通路調(diào)治NASH。