白 羽

福建省泉州市第一醫(yī)院檢驗科 362000

血流感染是臨床常見的感染性疾病,有較高的發(fā)病率和致死率,全球每年發(fā)生血液感染的近20萬患兒中,病死率可達(dá)10%～20%,給患兒的生命安全帶來極大威脅[1]。因此當(dāng)患兒出現(xiàn)疑似血流感染時,需要盡快明確病原菌種類,根據(jù)藥敏的不同特點給予其相對應(yīng)的抗菌藥物,不僅能夠控制血流感染速度,挽救患兒生命,同時能夠降低患兒家庭經(jīng)濟負(fù)擔(dān)提高生存率。臨床常以轉(zhuǎn)種培養(yǎng)后的鑒定結(jié)果作為血流感染的金標(biāo)準(zhǔn),但由于培養(yǎng)較困難,同時培養(yǎng)報陽后傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)種和生化表型鑒定方法至少需要48h,結(jié)果判定耗時長等原因受到諸多限制,無法做到快速評估。革蘭染色方法是基于細(xì)菌細(xì)胞壁中肽聚糖之間的反應(yīng),用染劑固定顏色,使細(xì)胞脫色,并進(jìn)行復(fù)染。但脫色過度或不足時,可能會改變結(jié)果,同時脫色時間的長短還受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影響,難以嚴(yán)格規(guī)定[2]?；|(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜在細(xì)菌不經(jīng)過前處理的情況下直接檢測細(xì)菌[3],以上兩種方式在臨床應(yīng)用較為廣泛,因此本研究旨在分析革蘭染色及基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜在檢測兒童陽性血培養(yǎng)病原菌中的價值,現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2021年1月1日—2022年12月31日期間在我院送檢的兒童陽性血培養(yǎng)瓶153例作為研究對象,所收集標(biāo)本由我院工齡滿5年的檢驗技師根據(jù)雙盲法閱片并進(jìn)行病原菌判斷。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)。家屬簽署知情同意書。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)本研究所納入的患兒在臨床中均診斷為血流感染;(2)兒童年齡在3～10歲;(3)所納入的標(biāo)本均為陽性血培養(yǎng)。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)患兒合并其他基礎(chǔ)性疾病;(2)陽性血培養(yǎng)瓶污染;(3)合并其他免疫系統(tǒng)疾病者。

1.2 方法 轉(zhuǎn)種培養(yǎng):使用1ml的無菌注射器抽取0.5ml兒童血培養(yǎng)瓶中的液體,將其接種于血瓊脂平板中,放置于36℃,5%的CO2培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)24h,再使用質(zhì)譜儀對單個菌落進(jìn)行鑒定,其中儀器的使用按照說明書進(jìn)行。

革蘭染色:使用1ml的無菌注射器抽取0.5ml兒童需氧血培養(yǎng)瓶中的液體涂片固定,通過草酸結(jié)晶紫初染1min,用水沖洗。加碘液覆蓋樣本涂面媒染1min,用水沖洗,滴加95%乙醇,輕輕搖動脫色30s,用水沖洗,用吸水紙將水吸干,復(fù)紅染液復(fù)染1min,用水沖洗,用吸水紙將水吸干,最后行鏡檢觀察。

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜培養(yǎng):使用1ml的無菌注射器抽取0.5ml兒童需氧血培養(yǎng)瓶中的液體,前期處理通過運用Sepsityper Kit試劑盒。具體操作:將1ml的陽性血培養(yǎng)瓶中的液體放入eppendorf管中,再加入200μl的Buffer,通過渦旋震蕩10s,混勻離心2min,棄去上清,在沉淀中再加入1ml的洗滌緩沖液,渦旋震蕩30s直至沉淀完全溶解,離心1min,棄去上清,取沉淀,并在沉淀中加入MS-DS靶板,再加入1μl的MSCHCA基質(zhì),靜置至表面干燥,上機鑒定。結(jié)果的判定:綠色為唯一鑒定結(jié)果,可行度為60%～99%,黃色為低分辨結(jié)果可行度為>60%,紅色表示無法鑒定,可信率<60%,與數(shù)據(jù)庫的質(zhì)譜數(shù)據(jù)不匹配,重新檢測。

1.3 觀察指標(biāo) 以轉(zhuǎn)種培養(yǎng)后的鑒定結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn),均采用革蘭染色與基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜培養(yǎng),分析革蘭染色與基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜對陽性血培養(yǎng)病原菌的檢出率、兩種方式單獨與轉(zhuǎn)種培養(yǎng)后鑒定結(jié)果的一致性以及對兒童陽性血培養(yǎng)病原菌種類的診斷效能(靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度)。(1)轉(zhuǎn)種培養(yǎng)后的鑒定結(jié)果對兒童陽性血培養(yǎng)病原菌種類的檢出率。(2)革蘭染色與基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜與轉(zhuǎn)種培養(yǎng)后的鑒定結(jié)果診斷的一致性:Kappa值<0.4表示檢測方式與金標(biāo)準(zhǔn)的診斷一致性較差,0.4≤Kappa值<0.75表示檢測方式與金標(biāo)準(zhǔn)的診斷一致性尚可,0.75≤Kappa值≤1.0表示檢測方式與金標(biāo)準(zhǔn)的診斷一致性較好。(3)革蘭染色與基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜對兒童陽性血培養(yǎng)病原菌種類的診斷價值:以轉(zhuǎn)種培養(yǎng)后的鑒定結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn),分析兩種方式對兒童陽性血培養(yǎng)病原菌種類的診斷符合率、靈敏度、特異度。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計數(shù)資料以率表示,采用χ2檢驗;一致性分析采用Kappa檢驗;P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 單一菌樣本革蘭染色與基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜檢測鑒定結(jié)果比較 共收集153例陽性兒童血培養(yǎng)樣本,其中單一菌樣本143例(93.46%),兩種菌樣本10例(6.54%)。153例樣本中,檢出革蘭陽性菌133株(86.93%)中以金黃色葡萄球菌最多(61.1%);革蘭陰性菌20株(13.07%)中以腸桿菌科細(xì)菌最多(60.00%)。

2.2 革蘭染色與基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜對病原菌種類的診斷效能對比 153例兒童陽性血培養(yǎng)病原菌中以轉(zhuǎn)種培養(yǎng)后的鑒定結(jié)果為判斷標(biāo)準(zhǔn),確定133例兒童陽性血培養(yǎng)病原菌為革蘭陽性菌,20例為革蘭陰性菌,其中革蘭染色檢測與轉(zhuǎn)種培養(yǎng)結(jié)果診斷標(biāo)準(zhǔn)一致性尚可(Kappa=0.501);基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜與轉(zhuǎn)種培養(yǎng)結(jié)果診斷標(biāo)準(zhǔn)一致性好(Kappa=0.826),見表1。

表1 革蘭染色與基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜對病原菌種類的診斷效能對比(n)

2.3 革蘭染色與基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜檢測對單一病原菌種類的診斷價值對比 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜診斷病原菌種類的特異度、敏感度及診斷準(zhǔn)確率高于革蘭染色診斷(P<0.05),見表2。

表2 革蘭染色與基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜檢測對單一病原菌種類的診斷價值對比(%)

3 討論

血流感染作為嚴(yán)重的感染性疾病,死亡率較高,對于血流感染患兒而言,推遲1h使用抗生素進(jìn)行合理治療,會降低患兒的存活率[4]。因此對血培養(yǎng)結(jié)果監(jiān)測,了解血液感染病原菌分布,可以更好地幫助和指導(dǎo)臨床科學(xué)合理用藥,保障患兒的生命安全。臨床通常選擇轉(zhuǎn)種培養(yǎng)后的鑒定結(jié)果作為血流感染的金標(biāo)準(zhǔn),但因其培養(yǎng)耗費時間較長,同時從血液中所分離的病原菌在后期形成可視菌落過程較慢,無法作為臨床快速判斷的檢測方法[5]。目前隨著檢測技術(shù)的發(fā)展,分子生物等檢測方式相對簡單,檢測時長較短,逐漸得到檢驗科及門診工作者的重視。革蘭染色可以觀察到細(xì)菌的形態(tài)、排列及結(jié)構(gòu)特征,但分辨度較低,操作煩瑣,不能準(zhǔn)確區(qū)分細(xì)菌種屬,無法完全準(zhǔn)確指導(dǎo)臨床抗生素的合理使用[6]?；|(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜在操作上簡便、大規(guī)模、并行化和高度自動化處理待檢生物樣品,在測定生物大分子和合成高聚物應(yīng)用方面有特殊的優(yōu)越性[7]。

本文收集153例陽性兒童血培養(yǎng)樣本,其中單一菌樣本143例(93.46%),兩種菌樣本10例(6.54%)。153例樣本中,革蘭陽性菌中以金黃色葡萄球菌最多(61.1%);革蘭陰性菌中以腸桿菌科細(xì)菌最多(60.00%);153例兒童陽性血培養(yǎng)病原菌中以轉(zhuǎn)種培養(yǎng)后的鑒定結(jié)果為判斷標(biāo)準(zhǔn),確定133例兒童陽性血培養(yǎng)病原菌為革蘭陽性菌,20例為革蘭陰性菌,其中革蘭染色檢測與轉(zhuǎn)種培養(yǎng)結(jié)果診斷標(biāo)準(zhǔn)一致性尚可(Kappa=0.501);基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜與轉(zhuǎn)種培養(yǎng)結(jié)果診斷標(biāo)準(zhǔn)一致性好(Kappa=0.826);基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜診斷病原菌種類的特異度、敏感度及診斷準(zhǔn)確率均高于革蘭染色診斷(P<0.05),說明基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜檢測診斷價值更高。可能的原因是基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜不僅能鑒定區(qū)分臨床中速分離出的菌落,同時也能夠?qū)εR床中未經(jīng)分離的標(biāo)本進(jìn)行鑒定,相較于常規(guī)鑒定方法此種方法能夠縮短細(xì)菌鑒定時間。其次,基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜是通過判斷分子量的差異進(jìn)行感染細(xì)菌的檢測,將瓊脂板中生長的黨菌落點涂在靶板上,在基質(zhì)溶液充分混勻后,在質(zhì)譜儀內(nèi)接受多次激光照射,在電荷解離的過程中,基質(zhì)能夠吸收激光并與菌體共同解吸,對菌株的鑒定率可達(dá)66%～97%,但處理陽性血培養(yǎng)液通常需要較為煩瑣的人工操作才能獲得足量、純化的病原菌蛋白[8]。再次,通過病原菌富集技術(shù)處理陽性血培養(yǎng)樣本后直接用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜進(jìn)行鑒定,將極大地提高鑒定速度,縮短報告時間,滿足臨床快速診斷的需求。同時,質(zhì)譜技術(shù)能夠鑒定出復(fù)數(shù)菌中一種,未發(fā)現(xiàn)有鑒定錯誤的情況。傳統(tǒng)的生化檢測方法或基因測序方法在實驗整體操作中對于無菌要求較高,污染對結(jié)果的影響較大,而基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜則能保證一定的“容錯性”[9]。有研究發(fā)現(xiàn)[10],當(dāng)感染多種菌且革蘭染色無法分辨時,兩種評分較高的不同種類菌群的質(zhì)譜鑒定結(jié)果是一個寶貴的提示。這在本研究中也得到了同樣的印證。曹敬榮等人研究表明[11],通過運用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜鑒定固體培養(yǎng)基短期培養(yǎng)后的血流感染病原菌,僅需2.5h即可鑒定且準(zhǔn)確率可達(dá)到58.3%,通過5.5h的培養(yǎng)鑒定準(zhǔn)確率能達(dá)82.3%,表明基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜在鑒定血培養(yǎng)陽性方面較有優(yōu)勢,培養(yǎng)時間短,節(jié)省了檢測時間,利于早期診斷。

綜上所述,革蘭染色與基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜檢查均可對兒童陽性血培養(yǎng)病原菌進(jìn)行檢出,且革蘭染色與基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜檢測診斷價值更高。