張俊俊 王 焱

河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科,河南省洛陽市 471003

宮頸癌(Cervical Cancer)是女性常見的惡性腫瘤之一,宮頸組織從正常發(fā)展成癌性病變是一個長期復(fù)雜的過程,且需要多基因、多環(huán)節(jié)的共同參與。目前高危HPV的持續(xù)感染是導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生的主要病因,但宮頸癌的具體發(fā)病機(jī)制尚不清楚,因此尋找有效的防治方法仍是臨床醫(yī)生面臨的重大難題。泛素蛋白-1歸屬于泛素樣蛋白家族,具有保持細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)穩(wěn)定的作用,可通過調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的降解、抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化等機(jī)制參與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。近年研究顯示[1],UBQLN-1 參與了多種腫瘤的發(fā)生進(jìn)展過程;但目前關(guān)于UBQLN-1在宮頸癌中的研究比較少見,且UBQLN-1與高危HPV感染相關(guān)性的研究目前尚未發(fā)現(xiàn)。本文通過免疫組化SP法檢測UBQLN-1在不同宮頸病變組織中的表達(dá)情況,探索其與高危HPV感染的關(guān)系及與宮頸鱗癌發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后的關(guān)系,為宮頸癌的防治及預(yù)后評估提供新的生物學(xué)指標(biāo)。

1 資料和方法

1.1 一般資料 收集2015年4月—2016年8月來自我院經(jīng)手術(shù)切除或活檢的宮頸組織180例,其中宮頸鱗癌84例(宮頸鱗癌組),CINⅠ31例(CINⅠ組), CINⅡ～Ⅲ 39例(CINⅡ～Ⅲ組),以及因子宮肌瘤或腺肌病行子宮全切的正常宮頸組織26例(對照組)。84例宮頸鱗癌患者中,年齡<50歲37例,≥50歲47例;未絕經(jīng)36例,已絕經(jīng)48例;按2018年 FIGO分期標(biāo)準(zhǔn)分期:Ⅰ～Ⅱ期54例,Ⅲ～Ⅳ期30例;分化程度:高分化49例,中—低分化35例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(54例Ⅰ～Ⅱ期患者術(shù)后經(jīng)病理明確指出有無淋巴結(jié)移轉(zhuǎn)的宮頸鱗癌患者):有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移34例,無轉(zhuǎn)移20例。標(biāo)本取材及研究均經(jīng)患者及其家屬知情同意,該研究經(jīng)我院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn):(1)所有研究對象術(shù)前均行 HPV-DNA檢測;(2)均為初次治療患者;(3)所有患者病例資料及隨訪資料完整;(4)所有患者均無合并嚴(yán)重的內(nèi)科疾病。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)既往有放化療及靶向治療史;(2)合并有其他腫瘤病史的患者。

1.3 方法 HPV有無感染采用PCR-反向點(diǎn)雜交檢測方法:采用HPV核酸擴(kuò)增分型檢測試劑盒(深圳亞能生物技術(shù)公司),按試劑盒說明書進(jìn)行操作,首先吸取標(biāo)本1.5ml,進(jìn)行離心,后棄上清液,用試劑盒隨帶的DNA提取試劑提取HPV-DNA,行PCR擴(kuò)增和雜交、顯色及結(jié)果分析。免疫組化方法:所有收集的新鮮標(biāo)本首先均經(jīng) 10% 甲醛固定,進(jìn)一步行石蠟包埋,后嚴(yán)格進(jìn)行4μm 厚連續(xù)切片(所有切片均經(jīng)我院病理科2位高年資主任醫(yī)師統(tǒng)一確診);切片后的標(biāo)本玻片經(jīng)嚴(yán)格依次脫蠟、水化等處理,滴加一抗,采用Envision法進(jìn)行免疫組化染色,實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按試劑說明書操作,該研究所用的UBQLN-1抗體(1∶100)購于abcam公司;二抗試劑盒購于北京中杉金橋技術(shù)有限公司。以PBS緩沖液作為陰性對照。

1.4 結(jié)果判斷 UBQLN-1在宮頸組織中的陽性染色主要定位于細(xì)胞的胞質(zhì)及胞核中,以出現(xiàn)棕色為陽性表達(dá);其表達(dá)情況主要根據(jù)陽性細(xì)胞著色強(qiáng)度和細(xì)胞數(shù)評分:無著色、淡黃色、棕黃色和棕褐色分別計為0、1、2、3分;每個高倍鏡視野計數(shù)100個細(xì)胞,隨機(jī)觀察10個視野,取其平均值作為陽性細(xì)胞數(shù),按照<10%、10%～40%、41%～70%、>70%分別為0、1、2、3分;將兩項得分結(jié)果相乘的結(jié)果作為最終評分,≤3為陰性,>3為陽性[2]。

1.5 隨訪 醫(yī)院或電話定期隨訪宮頸鱗癌患者病情及預(yù)后,隨訪開始時間為患者確診住院時間,截止時間為2021 年 8 月31日;總生存期(OS)為患者確診住院開始治療時間至隨訪停止時間或死亡。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用 SPSS23.0軟件分析數(shù)據(jù),計數(shù)資料采用百分率(%)表示,組間比較采用χ2檢驗(yàn);相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)性系數(shù)表示;生存曲線采用Kaplan-Meie 法繪制,比較采用Log-rank χ2檢驗(yàn) ;預(yù)后影響因素用Cox 比例風(fēng)險模型,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 UBQLN-1在不同病變宮頸組織中的表達(dá) UBQLN-1在正常宮頸組織、CINⅠ、CINⅡ～Ⅲ及宮頸鱗癌組織中的陽性率逐步升高,組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=59.672,P<0.05),見表1。

表1 UBQLN-1在不同病變宮頸組織中的表達(dá)

2.2 UBQLN-1表達(dá)與宮頸鱗癌臨床病理特征的關(guān)系 宮頸鱗癌中UBQLN-1的陽性表達(dá)與年齡、是否絕經(jīng)及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)(P>0.05),而與臨床分期、分化程度有關(guān)(P<0.05),見表2。

表2 UBQLN-1表達(dá)與宮頸鱗 癌臨床病理特征的關(guān)系

2.3 高危 HPV在不同病變宮頸組織中的感染情況 高危 HPV 在正常宮頸組織、CINⅠ、CINⅡ～Ⅲ及宮頸鱗癌組織中的感染率逐步升高,組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表3。

表3 高危HPV在不同病變宮頸組織中的感染情況

2.4 UBQLN-1表達(dá)與高危HPV感染的相關(guān)性分析 通過 Spearman 相關(guān)性分析結(jié)果顯示隨著宮頸病變的進(jìn)展,UBQLN-1 在不同病變宮頸組織中的表達(dá)與高危 HPV 的感染呈正相關(guān)(P<0.05), 見表4。

表4 UBQLN-1表達(dá)與高危HPV感染的相關(guān)性分析

2.5 UBQLN-1 在宮頸鱗癌中的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系 84例宮頸鱗癌患者的中位OS為 65.98個月,95%CI為61.98～69.99個月。UBQLN-1的陽性表達(dá)與OS的縮短相關(guān),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.629,P=0.031),見圖1。以O(shè)S作為因變量,UBQLN-1的表達(dá)、臨床分期、分化程度作為自變量進(jìn)行多因素 Cox比例風(fēng)險分析,結(jié)果顯示UBQLN-1的表達(dá)、臨床分期為宮頸鱗癌OS的獨(dú)立影響因素(P<0.05),見表5。

圖1 UBQLN-1在宮頸鱗癌中的表達(dá)與總生存期的關(guān)系

表5 宮頸鱗癌OS的影響因素分析

3 討論

目前隨著HPV疫苗及宮頸癌篩查的普及,部分宮頸癌患者得以早期預(yù)防及治療;但臨床宮頸鱗癌的發(fā)病率仍較高且對于已治患者仍存在較大的復(fù)發(fā)風(fēng)險,而對于復(fù)發(fā)及晚期宮頸癌患者目前尚無有效的治療方式。因此尋求新的有效的防治和預(yù)后評估的手段顯得尤為重要。

UBQLN-1是由11 個外顯子組成的一種核小體表面蛋白,歸屬于泛素蛋白家族,其編碼基因位于人類染色體 9q22,保守性較強(qiáng),可編碼 561 或 589個氨基酸序列;其具有3個功能域,包括C端泛素相關(guān)結(jié)構(gòu)域(UBA)、N端泛素樣結(jié)構(gòu)域(UBL)和STI伴侶結(jié)構(gòu)域。UBQLN-1可通過多種機(jī)制參與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程,具體如下:(1)UBQLN-1可通過其結(jié)構(gòu)域作為一種傳遞蛋白發(fā)揮作用,UBL可介導(dǎo)泛素與蛋白酶體19S亞基的S5A組分的泛素受體以及UbA相互作用,進(jìn)而使UBQLN-1通過連接泛素化機(jī)制和蛋白酶體調(diào)節(jié)蛋白酶體的降解[3-4];(2)UBQLN-1可通過促進(jìn)Survivin表達(dá)和抑制p53的表達(dá)抑制細(xì)胞凋亡[5];(3)UBQLN-1可通過多種信號通路促進(jìn)上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展[6]。

2020年謝光琴等[7]的研究顯示UBQLN1可通過增強(qiáng)食管癌細(xì)胞中N-cadherin、Vimentin的表達(dá),同時抑制E-cadherin的表達(dá),促進(jìn)上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生降低食管鱗癌細(xì)胞間黏附力,增強(qiáng)胞間移動性,進(jìn)而促進(jìn)食管癌的侵襲和遷移。胡潺潺等[5]的研究發(fā)現(xiàn)抑制UBQLN1的表達(dá)可上調(diào)p53的表達(dá),誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,抑制乳腺癌的發(fā)生。目前關(guān)于UBQLN-1 在宮頸癌中的研究較少,直到2021年王麗娜等首次[2]發(fā)現(xiàn)UBQLN-1 在宮頸癌組織中陽性表達(dá)率明顯高于癌旁組織,且與預(yù)后顯著相關(guān);由此說明UBQLN-1 可能與宮頸癌的形成、發(fā)展及預(yù)后有關(guān)。本文結(jié)果顯示,UBQLN-1 在正常宮頸組織、CINⅠ、CINⅡ～Ⅲ及宮頸鱗癌中的陽性表達(dá)率逐步升高,且在宮頸鱗癌中的表達(dá)明顯高于正常組織;與王麗娜等的研究結(jié)果相似,但由于實(shí)驗(yàn)標(biāo)本數(shù)目、方法及期別限制,無法說明是否與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)及對宮頸癌侵襲轉(zhuǎn)移的影響。生存期影響因素分析顯示,UBQLN-1 的表達(dá)與預(yù)后相關(guān),陽性表達(dá)率越高,生存期越短;這與UBQLN-1 在乳腺癌患者中表達(dá)越高,生存期越短的結(jié)果一致。該研究還發(fā)現(xiàn)UBQLN-1 在宮頸鱗癌中的表達(dá)與臨床分期、分化程度有關(guān),對于分期越晚、分化程度越低的患者,其陽性表達(dá)率越高;該結(jié)果與孫光源等[8]關(guān)于UBQLN-1在直腸癌中的研究結(jié)果一致。

高危 HPV 的持續(xù)感染是導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生的主要原因,其中最常見的為 HPV16、18。其HPV-DNA中與致癌性密切相關(guān)的主要是早期轉(zhuǎn)錄基因中的E6、E7及E5。當(dāng)HPV病毒侵入機(jī)體后,其基因組可隨機(jī)整合到宿主細(xì)胞 DNA 中,E6蛋白通過特異性綁合p53蛋白,使其失去活性并快速降解或表達(dá)下調(diào),致細(xì)胞原有周期失去控制,細(xì)胞增生失控[9];同時E2基因出現(xiàn)缺失及斷裂,致使整合細(xì)胞內(nèi)E2蛋白低表達(dá),進(jìn)而減弱對E6、E7基因的抑制,使E6、E7蛋白過表達(dá),輔以E5蛋白的表達(dá),促進(jìn)HPV細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡及HPV轉(zhuǎn)化細(xì)胞的免疫逃逸,促使感染細(xì)胞進(jìn)入永生化甚至發(fā)生癌變[10-11]。E6作為HPV的主要致癌蛋白可通過特異性綁合p53 蛋白,使其失去活性并快速降解或表達(dá)下調(diào)從而促進(jìn)細(xì)胞增生,導(dǎo)致宮頸癌的發(fā)生;而UBQLN-1 也可通過調(diào)控 p53的表達(dá),抑制細(xì)胞凋亡,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增生;兩者均可調(diào)控P53發(fā)揮作用,因此猜測UBQLN-1與高危HPV感染之間可能存在某種關(guān)系,而目前關(guān)于兩者相關(guān)性的研究尚無。而該研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)UBQLN-1 與高危HPV的感染呈正相關(guān),說明兩者之間可能通過某種機(jī)制相互作用共同促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生及發(fā)展過程。

綜上所述,UBQLN-1可能參與宮頸鱗癌的發(fā)生、進(jìn)展過程,并影響預(yù)后,同時調(diào)控高危HPV的感染;為宮頸癌的臨床預(yù)防、治療及預(yù)后提供了新的生物學(xué)指標(biāo);但因該研究標(biāo)本及規(guī)模有限且目前UBQLN-1在宮頸癌中的研究較少,關(guān)于UBQLN1參與宮頸癌形成及與高危HPV感染相互作用的具體機(jī)制尚不清楚,仍需要今后更多更大樣本的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)一步探究。