孟 杰 孟雅姣 趙紅霞

天津市第四中心醫(yī)院 300140

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(Recurrent spontaneous abortion,RSA)又稱(chēng)為習(xí)慣性流產(chǎn),其發(fā)生常與滋養(yǎng)細(xì)胞某些生物學(xué)行為改變有關(guān),包括滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲不足、胎盤(pán)局部缺血缺氧、螺旋小動(dòng)脈無(wú)法轉(zhuǎn)化為低阻力小血管等。正常情況下,基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase,MMPs)與特異性組織抑制物(Specific tissue inhibitor,TIMPs)維持著動(dòng)態(tài)平衡,在正常妊娠中參與胚胎的種植及分娩發(fā)動(dòng),研究指出,MMPs、TIMPs在調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤(rùn)功能中發(fā)揮重要作用[1]。波形蛋白(vimentin)多見(jiàn)于胚胎發(fā)育早期細(xì)胞中,與基因表達(dá)、細(xì)胞分化發(fā)育、內(nèi)皮細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、血管阻力等密切相關(guān)[2]。近年來(lái)研究表明,RAS與免疫紊亂、感染等因素有關(guān)[3],既往文獻(xiàn)證實(shí)人乳頭瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)感染與RSA有一定關(guān)系,但其導(dǎo)致RSA的具體機(jī)制及對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞中MMP-2、TIMP-2、vimentin表達(dá)的影響尚不明確。本文主要探討HPV感染對(duì)復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者早期滋養(yǎng)細(xì)胞中MMP-2、TIMP-2、vimentin表達(dá)的影響 。

1 資料與方法

1.1 一般資料 將2021年1月—2023年1月本院收治的84例RSA患者設(shè)為研究組,另選取95例擬行人工流產(chǎn)術(shù)的早孕婦女設(shè)為對(duì)照組。研究組:年齡22～35歲,平均年齡(28.56±3.02)歲;孕期45～65d,平均孕期(55.14±5.02)d。對(duì)照組:年齡23～34歲,平均年齡(28.62±2.98)歲;孕期45～65d,平均孕期(55.36±4.81)d。兩組年齡、孕期比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。研究組納入標(biāo)準(zhǔn):患者與同一性伴侶發(fā)生連續(xù)3次或3次以上自然流產(chǎn);夫妻雙方染色體正常;無(wú)子宮畸形、宮內(nèi)感染、內(nèi)分泌異常。本研究符合《赫爾辛基宣言》規(guī)定,且患者及其監(jiān)護(hù)人對(duì)本次研究知情并簽署同意書(shū)。

1.2 方法 (1)MMP-2、TIMP-2、vimentin免疫組化檢測(cè): ①無(wú)菌條件下,取新鮮絨毛組織,對(duì)照組人工流產(chǎn)術(shù)時(shí)取樣,觀察組要在確認(rèn)胚胎停止發(fā)育時(shí)取樣,在使用生理鹽水反復(fù)沖洗干凈后取適量絨毛組織,并以10%福爾馬林固定,石蠟包埋,切片;按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行常規(guī)免疫組織化學(xué)染色,檢測(cè)組織中的MMP-2、TIMP-2、vimentin表達(dá),其中MMP-2、TIMP-2、vimentin多克隆抗體及所用試劑盒均來(lái)自博士得生物技術(shù)有限公司。②結(jié)果判定:根據(jù)細(xì)胞中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性表達(dá),運(yùn)用高清晰度病理彩色圖文分析系統(tǒng)分析圖像,每張切片取5個(gè)視野并攝片,保證所有圖片均在同一條件下拍攝;測(cè)定每張圖片上滋養(yǎng)細(xì)胞的平均光密度(MD)、積分光密度(IOD)、有效面積(A),MD=IOD/A,此值反映滋養(yǎng)細(xì)胞中相關(guān)蛋白的表達(dá)值。(2)HPV-DNA檢測(cè):本次檢測(cè)包括5種低危型及23種高危型HPV基因型;采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)法,在組織細(xì)胞配置好之后,加入細(xì)胞消化液將DNA釋放出來(lái),并選用HPV L基因區(qū)的共有引物GP5+/GP6+和β-globin基因引物Glob-F/Glob-R進(jìn)行標(biāo)本PCR擴(kuò)增,再選用改進(jìn)的PGMY09/11對(duì)β-globin陽(yáng)性以及HPV陰性進(jìn)行再次PCR擴(kuò)增操作,所有擴(kuò)增過(guò)程均包含β-globin基因?qū)φ占癏PV陽(yáng)性、陰性對(duì)照,電泳技術(shù)后將熒光條帶出現(xiàn)部分與每條引物擴(kuò)增的DNA長(zhǎng)度相比較。

1.3 觀察指標(biāo) (1)比較兩組滋養(yǎng)細(xì)胞中MMP-2、TIMP-2、vimentin表達(dá)。(2)比較兩組HPV感染情況。(3)比較HPV陽(yáng)性受試者早期滋養(yǎng)細(xì)胞中MMP-2、TIMP-2、vimentin表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 兩組滋養(yǎng)細(xì)胞中MMP-2、TIMP-2、vimentin表達(dá)比較 研究組滋養(yǎng)細(xì)胞中MMP-2表達(dá)水平高于對(duì)照組,TIMP-2、vimentin表達(dá)水平低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表1。

表1 兩組滋養(yǎng)細(xì)胞中MMP-2、TIMP-2、vimentin表達(dá)比較

2.2 兩組HPV感染情況比較 研究組HPV陽(yáng)性率(42.86%)顯著高于對(duì)照組(16.84%),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=14.639,P<0.001),見(jiàn)表2。

表2 兩組HPV感染情況比較[n(%)]

2.3 兩組中HPV陽(yáng)性、陰性受試者早期滋養(yǎng)細(xì)胞中MMP-2、TIMP-2、vimentin表達(dá)比較 研究組中,HPV陽(yáng)性患者滋養(yǎng)細(xì)胞中MMP-2表達(dá)水平高于陰性,TIMP-2、vimentin表達(dá)水平低于陰性,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);對(duì)照組中,HPV陽(yáng)性、陰性者滋養(yǎng)細(xì)胞中MMP-2、TIMP-2、vimentin表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)表3～4。

表3 研究組HPV陽(yáng)性、陰性患者早期滋養(yǎng)細(xì)胞中MMP-2、TIMP-2、vimentin表達(dá)比較

表4 對(duì)照組HPV陽(yáng)性、陰性者早期滋養(yǎng)細(xì)胞中MMP-2、TIMP-2、vimentin表達(dá)比較

3 討論

RSA病因較為復(fù)雜,包括免疫、病毒感染等因素,多為早期流產(chǎn)。相關(guān)研究顯示,在胚胎發(fā)育的早期,子宮—胎盤(pán)血液循環(huán)以及妊娠的完成均依賴(lài)于滋養(yǎng)細(xì)胞向子宮內(nèi)膜層的侵襲遷移能力[4]。滋養(yǎng)細(xì)胞兼具高度繁殖以及浸潤(rùn)性生長(zhǎng)的特點(diǎn),具有嚴(yán)格的空間性及時(shí)間性,在胚胎發(fā)育及胎盤(pán)建立中發(fā)揮著重要的作用。因此推測(cè)滋養(yǎng)細(xì)胞中一些細(xì)胞因子的異常分泌可能是導(dǎo)致流產(chǎn)發(fā)生的危險(xiǎn)因素,其中MMP-2、TIMP-2均是滋養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)分泌的重要細(xì)胞因子;vimentin為細(xì)胞骨架蛋白,維持細(xì)胞器形態(tài)并參與細(xì)胞間的信號(hào)傳遞[5-6]。

MMP-2是一類(lèi)以無(wú)活性酶原形式分泌到外環(huán)境的蛋白酶,并參與許多人體生理及病理過(guò)程,如在胚泡植入中可促進(jìn)血管生成、參與蛻膜止血與修復(fù),且可維持細(xì)胞外基質(zhì)的動(dòng)態(tài)平衡;相關(guān)研究顯示,MMP-2可在許多惡性腫瘤組織中監(jiān)測(cè)到,因此作為組織侵襲的標(biāo)志物[7-8]。當(dāng)MMP-2在滋養(yǎng)細(xì)胞中過(guò)度表達(dá)時(shí)便會(huì)導(dǎo)致侵襲過(guò)度,對(duì)胚胎發(fā)育產(chǎn)生不良影響,甚至導(dǎo)致流產(chǎn)。TIMPs對(duì)MMPs具有特異性抑制作用,兩者之間的動(dòng)態(tài)平衡可控制侵襲程度,促進(jìn)妊娠順利進(jìn)行[9]。研究發(fā)現(xiàn),MMP-2的活性表達(dá)與滋養(yǎng)細(xì)胞的遷移活力呈正相關(guān);施林領(lǐng)等[10]的研究中推測(cè)MMP-9/TIMP-1動(dòng)態(tài)失衡是稽留流產(chǎn)患者發(fā)病的重要因素。vimentin在正常的上皮細(xì)胞中不表達(dá),可作為間葉組織的標(biāo)記,主要定位于絨毛間質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞,是中間絲的一種,當(dāng)絨毛血管內(nèi)皮發(fā)生缺血等病變,可對(duì)內(nèi)皮中間絲產(chǎn)生干擾作用。本文結(jié)果顯示,研究組滋養(yǎng)細(xì)胞中MMP-2表達(dá)水平高于對(duì)照組,TIMP-2、vimentin表達(dá)水平低于對(duì)照組,說(shuō)明RSA的發(fā)生可能與妊娠早期滋養(yǎng)細(xì)胞MMP-2、TIMP-2、vimentin異常表達(dá)與有關(guān)。目前對(duì)于HPV感染導(dǎo)致RAS發(fā)生的機(jī)制尚未明確,相關(guān)學(xué)者認(rèn)為,HPV衣殼蛋白質(zhì)的質(zhì)量較大從而不容易穿過(guò)胎盤(pán)屏障,因此對(duì)早期妊娠不產(chǎn)生危險(xiǎn)[11]。但本文結(jié)果顯示,研究組HPV陽(yáng)性率高于對(duì)照組,說(shuō)明HPV與RAS的發(fā)生具有相關(guān)性;此外,研究組中,HPV陽(yáng)性患者滋養(yǎng)細(xì)胞中MMP-2表達(dá)水平高于陰性,TIMP-2、vimentin表達(dá)水平低于陰性,而對(duì)照組中,HPV陽(yáng)性、陰性者滋養(yǎng)細(xì)胞中MMP-2、TIMP-2、vimentin表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,可能是樣本量較少所致,仍提示HPV可能影響RSA發(fā)生,且在RSA患者中,HPV影響妊娠早期滋養(yǎng)細(xì)胞MMP-2、TIMP-2異常表達(dá)更顯著,其機(jī)制推測(cè)為HPV能促進(jìn)MMP-2表達(dá),病毒感染后,細(xì)胞內(nèi)的分子含量以及活性均會(huì)發(fā)生變化,誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)源性炎性因子,包括白介素、腫瘤壞死因子等,均能對(duì)其他蛋白的轉(zhuǎn)錄水平和活性產(chǎn)生誘導(dǎo)或抑制作用;除此之外,HPV可誘導(dǎo)細(xì)胞黏附等相關(guān)蛋白降解,從而使細(xì)胞間的黏附性降低,促進(jìn)MMP-2在滋養(yǎng)細(xì)胞中過(guò)度表達(dá),最終導(dǎo)致侵襲過(guò)度[12-13]。

綜上所述,RSA的發(fā)生可能與早期滋養(yǎng)細(xì)胞中MMP-2、TIMP-2、vimentin的異常表達(dá)有關(guān),且HPV可能參與這一過(guò)程。本研究樣本量少,來(lái)源集中,相關(guān)論點(diǎn)有待進(jìn)一步論證。