李亞飛，尚方建，羅春雨，石哲芳，劉 奇

（1.大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000；2.云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南大理 671000；3.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院保定醫(yī)院，河北保定 071000）

新型冠狀病毒在全球范圍的傳播引起了科研人員對(duì)冠狀病毒（coronavirus，CoV）新一輪的研究熱潮。冠狀病毒亞科分為α、β、γ、δ 4 個(gè)屬，β 屬由A、B、C、D 4 個(gè)亞群組成〔1〕。至今為止，科研人員先后從患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了7 種可引起人類患病的人冠狀病毒（human coronavirus，HCoV），分別為α 屬的HCoV-229E 和HCoV-NL63，A 亞群的HCoV-OC43和HCoV-HKU1，B 亞群的SARS-CoV 和SARSCoV-2，C 亞群的中東呼吸綜合征病毒〔1-2〕。普通冠狀病毒229E、OC43 和NL63 能引起人上呼吸道感染，是導(dǎo)致近三分之一普通感冒的病因〔3〕。盡管普通冠狀病毒感染的癥狀不嚴(yán)重且能自愈，但會(huì)導(dǎo)致兒童、老年人和免疫功能低下患者產(chǎn)生嚴(yán)重甚至致命的疾病〔2，4〕。松塔為松科植物的果球，具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗氧化和增強(qiáng)免疫功能的作用，有較高的研究?jī)r(jià)值〔5-6〕。云南松主要分布在中國(guó)西南地區(qū)，研究〔7〕發(fā)現(xiàn)云南松松塔提取物對(duì)HIV-1ⅢB、HIV-1RF、HIV-1A17等病毒株具有抑制效果，然而其是否具有抗冠狀病毒的活性尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。

本研究通過建立HCoV-229E S 蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞-細(xì)胞融合模型和假病毒模型，探究云南松松塔抗HIV 活性提取物（以下簡(jiǎn)稱“松塔提取物”）對(duì)HCoV-229E 的抑制活性，并初步明確其活性部位和作用機(jī)制，為松塔藥物后續(xù)活性單體追蹤及抗HCoV-229E 機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)，豐富云南松松塔的醫(yī)學(xué)研究?jī)r(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，為抗冠狀病毒天然藥物研究提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒、細(xì)胞 感受態(tài)細(xì)菌（DH-5α）購(gòu)自天根生物科技有限公司（批號(hào)：CB101-02）；293T、Huh-7 細(xì)胞、表達(dá)綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）的克隆載體質(zhì)粒pAAVIRES-EGFP、質(zhì)粒pNL4-3.luc.R-E（編碼env 缺陷，含有螢火蟲酶報(bào)告基因的HIV-1 骨架質(zhì)粒）、表達(dá)HCoV-229E S 蛋白的重組真核表達(dá)質(zhì)粒pCDNA3.1-229E-S、共表達(dá)S 蛋白和EGFP 的重組質(zhì)粒pAAV-IRES-EGFP-229E-S 均由本實(shí)驗(yàn)室團(tuán)隊(duì)前期成功構(gòu)建保存。

1.1.2 主要試劑 大提質(zhì)粒試劑（天根生化科技有限公司，批號(hào)：DP117）；EZ Trans 細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑（上海李記生物科技有限公司，批號(hào)：AC04L091）；螢火蟲酶檢測(cè)系統(tǒng)試劑盒、細(xì)胞裂解液（Promega公司，批號(hào)：E1501、E153A）；DMEM 高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（大連美侖生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：MA0212、PW1001）；DAPI 溶液（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：C0065）；PBS、青鏈霉素混合液、CCK-8 試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：P1020、MA0110、MA0218-L）；松塔提取物由大理大學(xué)藥學(xué)院劉光明教授惠贈(zèng)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞與靶細(xì)胞Huh-7 均采用含10%胎牛血清和1%青鏈霉素混合液的高糖DMEM 完全培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前12 h 將293T 細(xì)胞以8×106個(gè)/孔鋪于6孔板，待細(xì)胞密度達(dá)70%～80%且形態(tài)良好時(shí)，采用EZ Trans 轉(zhuǎn)染試劑按說明書操作進(jìn)行質(zhì)粒pAAVIRES-EGFP-229E-S 轉(zhuǎn)染，繼續(xù)培養(yǎng)24～48 h 后得到穩(wěn)定共表達(dá)HCoV-229E S 和EGFP 蛋白的效應(yīng)細(xì)胞（293T/229E/EGFP），轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pAAV-IRESEGFP 作為陰性對(duì)照細(xì)胞（293T/EGFP）。

1.2.2 細(xì)胞-細(xì)胞融合模型建立 融合前1 d 將Huh-7 細(xì)胞以3×104個(gè)/孔鋪于96 孔板培養(yǎng)12 h。融合前2 h 加入20 μL DAPI 溶液作用20 min，進(jìn)行Huh-7 細(xì)胞和293T/229E/EGFP 細(xì)胞核染色，PBS 洗凈DAPI 溶液后將293T/229E/EGFP 和293T/EGFP 以每孔約1×104個(gè)熒光細(xì)胞與Huh-7 細(xì)胞共培養(yǎng)，分別作為實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組，于不同時(shí)間段用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞-細(xì)胞融合情況，計(jì)算細(xì)胞-細(xì)胞融合率。細(xì)胞-細(xì)胞融合率=（1-n1/n0）×100%（式中n1表示不同融合時(shí)間后單個(gè)熒光細(xì)胞數(shù)；n0表示融合前單個(gè)熒光細(xì)胞數(shù)），繪制時(shí)間融合關(guān)系曲線。

1.2.3 假病毒HCoV-229E 包裝及靶細(xì)胞感染 假病毒包裝主要步驟如下：按1 ∶2 比例將質(zhì)粒pCDNA3.1-229E-S 與pNL4-3.luc.R-E 共轉(zhuǎn)染于293T 細(xì)胞，10～12 h 后將液體更換為DMEM 完全培養(yǎng)基。48～72 h 后，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，3 000 r/min 離心10 min，去除細(xì)胞沉淀，取上清液分裝后于-80 ℃保存?zhèn)溆?。感染靶?xì)胞主要步驟如下：感染前12 h于96 孔板中鋪入靶細(xì)胞Huh-7，2×104個(gè)/孔，PBS洗滌細(xì)胞2 次，每孔加入100 μL 用1∶2 DMEM 稀釋的假病毒，感染10～12 h 后，更換為DMEM。培養(yǎng)48～72 h，用PBS 洗滌2 次，每孔加40 μL 細(xì)胞裂解液，100 r/min 振蕩裂解30 min，取裂解后的液體20 μL 于96 孔板中，加20 μL 螢火蟲酶底物，混勻后檢測(cè)熒光值。

1.2.4 抑制活性檢測(cè) 細(xì)胞-細(xì)胞融合抑制活性檢測(cè)以293T/229E/EGFP 與Huh-7 細(xì)胞共培養(yǎng)作為陽(yáng)性對(duì)照組；293T/EGFP 與Huh-7 細(xì)胞共培養(yǎng)作為陰性對(duì)照組；梯度稀釋松塔提取物和293T/229E/EGFP在37 ℃、5% CO2條件下孵育1 h 與Huh-7 細(xì)胞共培養(yǎng)作為實(shí)驗(yàn)組。假病毒抑制活性檢測(cè)以HCoV 細(xì)胞-229E 假病毒與Huh-7 細(xì)胞共培養(yǎng)作為陽(yáng)性對(duì)照組；無(wú)假病毒和松塔提取物作為陰性對(duì)照組；假病毒梯度稀釋松塔提取物37 ℃孵育1 h 與Huh-7細(xì)胞共培養(yǎng)為實(shí)驗(yàn)組，按“1.2.3”項(xiàng)下方法檢測(cè)熒光值，計(jì)算抑制率。抑制率=［1-（E-N）/（P-N）］×100%（式中E 表示實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞-細(xì)胞融合率或熒光值；P 和N 分別表示陽(yáng)性對(duì)照組和陰性對(duì)照組的細(xì)胞-細(xì)胞融合率或熒光值）。以松塔提取物濃度為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)繪制藥物抑制曲線，使用Calsusyn軟件計(jì)算半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）。

1.2.5 時(shí)間-移除實(shí)驗(yàn) 松塔提取物分別與293T/229E/EGFP、Huh-7 細(xì)胞共孵育1 h，洗除未結(jié)合的藥物，將兩者共培養(yǎng)，觀察是否仍具有抑制作用，初步檢測(cè)其作用靶點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)組分為3組：組1 為松塔提取物與293T/229E/EGFP 作用1 h，與Huh-7 細(xì)胞共培養(yǎng)；組2 為松塔提取物與293T/229E/EGFP 作用1 h，用DMEM 洗滌細(xì)胞2 次去除未結(jié)合的藥物，與Huh-7 細(xì)胞共培養(yǎng)；組3 為松塔提取物與Huh-7細(xì)胞作用1 h，用DMEM 洗滌細(xì)胞2 次去除未結(jié)合的藥物，與293T/229E/EGFP 共培養(yǎng)。不加松塔提取物293T/229E/EGFP 與Huh-7 細(xì)胞直接共培養(yǎng)作為陽(yáng)性對(duì)照組；293T/EGFP 與Huh-7 細(xì)胞共培養(yǎng)作為陰性對(duì)照組，測(cè)定熒光值，按“1.2.4”項(xiàng)下方法計(jì)算抑制率。

1.2.6 時(shí)間-添加實(shí)驗(yàn) 293T/229E/EGFP 與Huh-7細(xì)胞共孵育，分別于0.0、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0 h 加入松塔提取物作為實(shí)驗(yàn)組；不加松塔提取物293T/229E/EGFP 與Huh-7 細(xì)胞直接共培養(yǎng)作為陽(yáng)性對(duì)照組；293T/EGFP 與Huh-7 細(xì)胞共培養(yǎng)作為陰性對(duì)照組，測(cè)定熒光值，按“1.2.4”項(xiàng)下方法計(jì)算抑制率。

1.2.7 細(xì)胞增殖毒性檢測(cè) 按CCK-8 試劑說明書操作，測(cè)定松塔提取物對(duì)293T、Huh-7 細(xì)胞的毒性作用。酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 處的吸光度（OD）值，計(jì)算細(xì)胞毒性率。細(xì)胞毒性率=［（OD實(shí)驗(yàn)-OD空白）/（OD對(duì)照-OD空白）］×100%。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞-細(xì)胞融合模型的構(gòu)建 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，3 h 后于熒光顯微鏡下可觀察到實(shí)驗(yàn)組產(chǎn)生明顯的細(xì)胞-細(xì)胞融合現(xiàn)象，同一熒光強(qiáng)度下與未融合的細(xì)胞比，熒光強(qiáng)度弱且形狀不規(guī)則，陰性對(duì)照組沒有融合現(xiàn)象。見圖1A。48 h 后熒光視野下實(shí)驗(yàn)組有大面積融合現(xiàn)象，DAPI 染色可見融合區(qū)域有多個(gè)細(xì)胞核。見圖1B。說明HCoV-229E S 蛋白會(huì)介導(dǎo)細(xì)胞-細(xì)胞融合現(xiàn)象的發(fā)生，細(xì)胞-細(xì)胞融合模型構(gòu)建成功。于不同時(shí)間觀察同一視野細(xì)胞-細(xì)胞融合情況，繪制時(shí)間融合關(guān)系曲線，由時(shí)間融合關(guān)系曲線可知6 h 后，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞-細(xì)胞融合率達(dá)到50%。見圖2。

圖1 HCoV-229E S 蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞-細(xì)胞融合情況

圖2 時(shí)間融合關(guān)系曲線

2.2 松塔提取物對(duì)HCoV-229E 的抑制作用 利用細(xì)胞-細(xì)胞融合模型檢測(cè)松塔提取物對(duì)HCoV-229E的抑制活性，6 h 后觀察各組細(xì)胞-細(xì)胞融合情況，計(jì)算抑制率并繪制抑制曲線，結(jié)果顯示：松塔提取物能以劑量依賴方式有效抑制由HCoV-229E S 蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞融合現(xiàn)象發(fā)生。見圖3A。松塔提取物濃度為2 mg/mL 時(shí)，能抑制75%的細(xì)胞融合，IC50為（0.136±0.010）mg/mL，而不加松塔提取物的陰性對(duì)照組沒有抑制作用。假病毒模型檢測(cè)結(jié)果顯示：松塔提取物能抑制HCoV-229E 假病毒感染，在1 mg/mL 時(shí)對(duì)HCoV-229E 假病毒感染的抑制率達(dá)到90%，且以劑量依賴方式有效抑制感染，IC50為（0.069±0.015）mg/mL。見圖3B。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明松塔提取物能有效抑制HCoV-229E 的進(jìn)入。

圖3 松塔提取物抑制曲線

2.3 時(shí)間-移除實(shí)驗(yàn)結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組1 松塔提取物與293T/229E/EGFP 作用1 h 后直接加入Huh-7 細(xì)胞中，抑制率為（82.10±5.30）%。實(shí)驗(yàn)組2 松塔提取物僅與293T/229E/EGFP 作用，以明確藥物作用靶點(diǎn)是否在S 蛋白上，抑制率為（77.25±4.92）%。實(shí)驗(yàn)組3 松塔提取物僅與Huh-7 細(xì)胞作用，明確藥物作用靶點(diǎn)是否在靶細(xì)胞的受體上，抑制率為（25.28±3.07）%。由此可見，松塔提取物抑制活性靶向HCoV-229E 的S 蛋白。

2.4 時(shí)間-添加實(shí)驗(yàn)結(jié)果 共培養(yǎng)293T/229E/EGFP 和Huh-7 細(xì)胞后，于不同時(shí)間加入松塔提取物，觀察其抑制活性，結(jié)果顯示：融合初始階段加入松塔提取物抑制活性能達(dá)到60%，隨著時(shí)間的推移，抑制活性逐漸降低，2.0 h 后，抑制活性只達(dá)到10%，說明松塔提取物作用時(shí)間在HCoV-229E 感染的早期。見圖4。

圖4 松塔提取物作用時(shí)間檢測(cè)

2.5 細(xì)胞毒性檢測(cè)結(jié)果 檢測(cè)了松塔提取物的細(xì)胞毒性率，結(jié)果顯示：不同濃度松塔提取物對(duì)293T及Huh-7 細(xì)胞沒有明顯毒性作用。見表1。

表1 松塔提取物對(duì)293T、Huh-7 細(xì)胞的細(xì)胞毒性率（%，x±s）

3 討論

在新型冠狀病毒全球傳播的大背景下，雖然針對(duì)冠狀病毒的疫苗研發(fā)技術(shù)在迅速發(fā)展，但藥物研究方面迄今為止仍沒有針對(duì)SARS-CoV-2 或其他冠狀病毒的有效藥物〔8-9〕，因此急需研究開發(fā)新的治療藥物。

松塔含許多天然化合物，具有抗病毒、免疫增強(qiáng)、抗腫瘤等多種作用〔10-11〕，有極其廣泛的藥用價(jià)值。云南松主要分布在中國(guó)西南地區(qū)，其松塔中的木質(zhì)素-碳水化合物復(fù)合物具有多種藥理特性。張海珠等〔12〕于云南松松塔提取物中發(fā)現(xiàn)并提取了木質(zhì)素，分析證明其與抗HIV 作用有關(guān)；崔雪青等〔13〕采用合胞體抑制實(shí)驗(yàn)等方法證明了思茅松松塔提取物SMS-F 能作用于HIV-1 進(jìn)入融合階段，從而阻斷合胞體的形成，具有很好的抗HIV-1 活性。多項(xiàng)研究〔6，14〕表明，天然的木質(zhì)素對(duì)流感病毒、HIV-1、輪狀病毒、單純皰疹病毒、腸病毒的生長(zhǎng)均有抑制作用，具有多方面的抗病毒活性。基于此，本研究進(jìn)一步對(duì)松塔提取物的抗HCoV-229E 的活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，并探討了其作用機(jī)制。

S 蛋白是研究抗冠狀病毒進(jìn)入抑制劑藥物及疫苗的主要靶點(diǎn)之一。其中進(jìn)入抑制藥物可以通過阻斷S1 與相應(yīng)受體的結(jié)合，或靶向S2 抑制其6-HB的形成，從而阻斷病毒包膜與靶細(xì)胞細(xì)胞膜的融合進(jìn)程，最終抑制冠狀病毒的感染。本研究成功構(gòu)建了由HCoV-229E S 蛋白介導(dǎo)的可視化細(xì)胞-細(xì)胞融合模型，制備了HCoV-229E 假病毒，以檢測(cè)松塔提取物對(duì)HCoV-229E 的抑制活性。結(jié)果顯示：松塔提取物能有效抑制由HCoV-229E S 蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞-細(xì)胞融合（IC50：0.136±0.010 mg/mL），同時(shí)能有效抑制HCoV-229E 假病毒對(duì)靶細(xì)胞的感染（IC50：0.069±0.015 mg/mL）。進(jìn)一步通過時(shí)間-添加實(shí)驗(yàn)以及時(shí)間-移除實(shí)驗(yàn)研究作用時(shí)間及作用靶點(diǎn)，結(jié)果表明松塔提取物作用是在病毒感染的早期，靶向S 蛋白。

綜上所述，本研究初步建立了一種安全性高的抗HCoV-229E 感染活性體外檢測(cè)模型，對(duì)松塔提取物抗HCoV-229E 活性作出評(píng)價(jià)并研究其機(jī)制。結(jié)果顯示：松塔提取物具有較強(qiáng)的抗HCoV-229E活性和低細(xì)胞毒性。松塔具有來(lái)源廣泛及廉價(jià)易取的特點(diǎn)，適宜量產(chǎn)，有望成為抗冠狀病毒的候選藥物之一，但其具體機(jī)制和體內(nèi)抗HCoV-229E 病毒活性和毒性有待進(jìn)一步評(píng)價(jià)。