趙愛蘭 余琴 俞南 張愛潔 夏輝 徐偉

北京市肺結(jié)核發(fā)病率與全國(guó)相比處于較低水平,2008—2016年北京市肺結(jié)核發(fā)病率為40.00/10萬～25.47/10萬(全國(guó)發(fā)病率為72.95/10萬～52.18/10萬)[1],但要實(shí)現(xiàn)無結(jié)核社區(qū)及終結(jié)結(jié)核病的目標(biāo)仍然需要加強(qiáng)結(jié)核病防治工作。朝陽區(qū)是北京市人口大區(qū),學(xué)生、外來人口和流動(dòng)人口較多,極易造成肺結(jié)核的傳播[2]。北京市基層結(jié)核病檢測(cè)機(jī)構(gòu)主要應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法仍然是涂片鏡檢和固體培養(yǎng),涂片鏡檢檢測(cè)敏感度低,固體培養(yǎng)耗時(shí)較長(zhǎng)。2011年,世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦將GeneXpert MTB/RIF(簡(jiǎn)稱“GeneXpert”)用于結(jié)核病的快速診斷和利福平的耐藥性檢測(cè)[3],在終止結(jié)核病策略中明確提出要提高新發(fā)和復(fù)發(fā)結(jié)核病患者中快速診斷方法作為初始檢測(cè)方法的比例,同時(shí)要提高病原學(xué)陽性患者中耐藥檢測(cè)的可及性。然而,2022年全球結(jié)核病報(bào)告顯示,2021年我國(guó)登記的結(jié)核病患者中僅有57%的患者將WHO推薦的快速診斷方法作為初始檢測(cè)方法。目前,大多數(shù)已發(fā)表的有關(guān)GeneXpert檢測(cè)方法的文獻(xiàn)集中在其與涂片鏡檢、固體培養(yǎng)敏感度和特異度方面的比較。本研究側(cè)重于探索在基層結(jié)核病防治機(jī)構(gòu)(簡(jiǎn)稱“結(jié)防機(jī)構(gòu)”)中應(yīng)用涂片鏡檢和固體培養(yǎng)的基礎(chǔ)上加入GeneXpert后對(duì)活動(dòng)性肺結(jié)核患者中病原學(xué)陽性檢出率的影響及早期診斷利福平耐藥性的應(yīng)用價(jià)值。

對(duì)象和方法

一、研究對(duì)象

按照《WS 288—2017肺結(jié)核診斷》[4]標(biāo)準(zhǔn),納入在北京市朝陽區(qū)結(jié)核病門診部2018年1月至2022年12月初次就診登記的3060例肺結(jié)核可疑癥狀者,按照《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[5]留取3份痰液,分別為即時(shí)痰、夜間痰和晨痰,每份要求≥1 ml,痰液的性狀有干酪痰、血痰、黏液痰和唾液痰。3份痰標(biāo)本均進(jìn)行抗酸染色涂片鏡檢,分枝桿菌固體培養(yǎng)使用即時(shí)痰和夜間痰,2018年1月至2021年12月對(duì)晨痰進(jìn)行GeneXpert檢測(cè),2022年1—12月將每例患者的3份痰標(biāo)本混合后進(jìn)行GeneXpert檢測(cè)。

二、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法

1. 抗酸分枝桿菌(簡(jiǎn)稱“抗酸桿菌”)涂片鏡檢:按照《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》中萋-尼抗酸染色方法進(jìn)行涂片鏡檢,3份標(biāo)本中任一份發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌即判定為涂片陽性。涂片鏡檢結(jié)果報(bào)告為陰性、實(shí)際條數(shù)、+、++、+++、++++。

2. 分枝桿菌固體培養(yǎng)及菌種鑒定:按照《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》固體培養(yǎng)法,對(duì)每例可疑癥狀者的即時(shí)痰和夜間痰依次進(jìn)行固體培養(yǎng),將培養(yǎng)陽性菌株進(jìn)行涂片抗酸染色,鏡檢后的可疑菌株接種對(duì)硝基苯甲酸(P-nitrobenzoic acid,PNB)/噻吩-2羧酸肼(thiophene-2 carboxylic hydrazine,TCH)進(jìn)行初步菌種鑒定,PNB生長(zhǎng)試驗(yàn)陰性,TCH生長(zhǎng)試驗(yàn)陽性判斷為結(jié)核分枝桿菌(MTB)。2份標(biāo)本任一份培養(yǎng)出陽性菌株即判定為培養(yǎng)陽性,結(jié)果報(bào)告為陰性、實(shí)際菌落數(shù)、+、++、+++、++++,2個(gè)月沒有菌落生長(zhǎng)判定為培養(yǎng)陰性。

3. GeneXpert 方法:按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行操作,將晨痰或混合后的標(biāo)本吸取1 ml加入至含有2 ml 痰消化液的前處理管中,振蕩混勻15～20 s,靜置15 min后吸取2 ml加入至反應(yīng)盒中,上機(jī)進(jìn)行檢測(cè),檢測(cè)結(jié)束后,在檢測(cè)系統(tǒng)窗口讀取結(jié)果,檢測(cè)結(jié)果分為陰、極低陽、低陽、中陽、高陽5個(gè)量級(jí)。

4. 比例法藥物敏感性試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱“藥敏試驗(yàn)”):按照《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》中固體比例法藥敏試驗(yàn)操作流程開展利福平表型藥敏試驗(yàn),臨界濃度為40 μg/ml。每批試驗(yàn)均使用質(zhì)控菌株H37Rv進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)量控制。

5. 質(zhì)量控制:按照《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》,每年定期進(jìn)行痰涂片的室間和室內(nèi)質(zhì)量評(píng)價(jià),均為合格。酸性羅氏培養(yǎng)基和藥敏培養(yǎng)基按照要求儲(chǔ)存于4 ℃冰箱并在有效期內(nèi)使用。GeneXpert檢測(cè)系統(tǒng)定期進(jìn)行校準(zhǔn),定期接受國(guó)家疾病預(yù)防控制中心開展的結(jié)核病分子檢測(cè)方法熟練度測(cè)試,結(jié)果均為優(yōu)秀。

三、診斷原則

按照《WS 288—2017肺結(jié)核診斷》[4]標(biāo)準(zhǔn),肺結(jié)核的診斷以病原學(xué)(包括細(xì)菌學(xué)和分子生物學(xué))檢測(cè)結(jié)果為主,結(jié)合流行病學(xué)史、臨床表現(xiàn)、胸部影像特征、相關(guān)輔助檢查及鑒別診斷等,進(jìn)行綜合分析后做出診斷?？顾釛U菌涂片鏡檢陽性、分枝桿菌固體培養(yǎng)陽性,經(jīng)菌種鑒定為MTB或GeneXpert檢測(cè)MTB陽性中任意一項(xiàng)結(jié)果為陽性,該患者均被診斷為病原學(xué)陽性患者。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Excel 2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理,采用SPSS 18.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)數(shù)資料以“頻數(shù)”和“百分率/構(gòu)成比(%)”描述,組間差異的比較采用χ2檢驗(yàn),各年間“百分率/構(gòu)成比”的趨勢(shì)變化采用趨勢(shì)χ2檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以固體培養(yǎng)結(jié)果為參考標(biāo)準(zhǔn),計(jì)算GeneXpert檢測(cè)的敏感度、特異度、一致率和Kappa值,其中Kappa值在0.41～0.60為一致性較低,0.61～0.80為一致性較高,0.81～1.00為高度一致性。

結(jié) 果

一、肺結(jié)核可疑癥狀者實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果

2018—2022年北京市朝陽區(qū)結(jié)核病門診部共登記肺結(jié)核可疑癥狀者3060例,全部進(jìn)行涂片鏡檢和固體培養(yǎng)檢測(cè),其中2557例(83.56%)進(jìn)行了GeneXpert檢測(cè)。排除18例固體培養(yǎng)陽性經(jīng)菌種鑒定后被診斷為非結(jié)核分枝桿菌(nontuberculous mycobacteria,NTM)感染的患者,29例分枝桿菌固體培養(yǎng)污染的患者,49例GeneXpert檢測(cè)錯(cuò)誤或無檢測(cè)結(jié)果的患者,最終3種檢測(cè)方法均有結(jié)果的肺結(jié)核患者共2496例(圖1)。

圖1 肺結(jié)核可疑癥狀者檢測(cè)及結(jié)果分布圖

二、GeneXpert檢測(cè)效能分析

(一)以固體培養(yǎng)為參考標(biāo)準(zhǔn)分析GeneXpert的檢測(cè)效能

涂片鏡檢、固體培養(yǎng)及GeneXpert結(jié)果均有效的2496例患者中,以固體培養(yǎng)結(jié)果為參考,GeneXpert檢測(cè)的敏感度和特異度分別為79.39%(95%CI:76.20%～82.56%)和93.39%(95%CI:92.27%～94.51%),兩種方法Kappa值為0.73,具有較高的一致性(表1)。涂片陽性標(biāo)本中GeneXpert檢測(cè)的敏感度為98.73%(95%CI:97.50%～99.96%),涂片陰性標(biāo)本中的敏感度為59.34%(95%CI:53.83%～64.85%),涂陽和涂陰患者敏感度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Fisher精確概率檢驗(yàn),P<0.001),見表1和表2。

表1 以固體培養(yǎng)為參考標(biāo)準(zhǔn)分析GeneXpert MTB/RIF的檢測(cè)效能

表2 以固體培養(yǎng)為參考標(biāo)準(zhǔn)分析不同涂片結(jié)果GeneXpert MTB/RIF的檢測(cè)效能

不同年度GeneXpert檢測(cè)的敏感度顯示,2020年最低,為72.18%(95%CI:64.55%～79.81%),2022年最高,為90.48%(95%CI:84.20%～96.76%),各年度敏感度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.148,P=0.025)。特異度范圍為90.91%(95%CI:87.76%～94.06%)～94.82%(95%CI:92.98%～96.76%),各年度間特異度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.960,P=0.202),見表1。

(二)GeneXpert與經(jīng)菌種鑒定后的固體培養(yǎng)檢測(cè)不一致結(jié)果分析

252例患者GeneXpert與經(jīng)菌種鑒定后的固體培養(yǎng)結(jié)果不一致,其中GeneXpert檢測(cè)陽性/培養(yǎng)陰性124例,GeneXpert檢測(cè)陰性/培養(yǎng)陽性128例。GeneXpert檢測(cè)陽性/培養(yǎng)陰性的124例患者中,極低陽性結(jié)果71例(57.26%),明顯高于GeneXpert檢測(cè)陽性/培養(yǎng)陽性患者的20.49%(101/493),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=66.632,P<0.001)。128例GeneXpert檢測(cè)陰性/培養(yǎng)陽性的患者中,121例(94.53%)固體培養(yǎng)結(jié)果為1～3個(gè)菌落,另7例(5.47%)為+。

(三)病原學(xué)陽性患者結(jié)果分析

1. 不同年份病原學(xué)陽性患者發(fā)現(xiàn)情況:2018年肺結(jié)核可疑癥狀者中使用GeneXpert檢測(cè)的比例僅為47.54%,自2019年開始檢測(cè)比例明顯上升,至2022年達(dá)到98.11%。肺結(jié)核可疑癥狀者中,GeneXpert檢測(cè)陽性率5年平均為29.89%,范圍在27.37%～32.80%,見表3。

表3 肺結(jié)核可疑癥狀者中病原學(xué)檢測(cè)情況

2. GeneXpert提高涂片陰性或涂陰培陰患者的病原學(xué)陽性情況:2018—2022年,3種方法均有有效結(jié)果的病原學(xué)陽性肺結(jié)核患者共746例,各年度3種方法的病原學(xué)陽性患者陽性檢出比例見表4。3種方法對(duì)病原學(xué)陽性患者的陽性檢出比例差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=320.000,P<0.001)。GeneXpert的陽性檢出比例(82.71%)明顯高于涂片鏡檢(46.51%),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=213.691,P<0.001),與固體培養(yǎng)(83.24%)比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.076,P=0.783)。

表4 病原學(xué)陽性患者中各檢測(cè)方法陽性患者檢出情況 [例(檢出率,%)]

在746例病原學(xué)陽性患者中,涂片陰性而GeneXpert檢測(cè)陽性的患者比例為36.86%,涂片和固體培養(yǎng)均為陰性但GeneXpert檢測(cè)陽性患者比例為12.60%,見表4。

(四)GeneXpert檢測(cè)利福平耐藥及探針突變類型分析

GeneXpert檢測(cè)的2496例標(biāo)本中共檢出MTB陽性617例,其中利福平耐藥46例,耐藥不確定

23例,利福平敏感548例,利福平耐藥率為7.46%(46/617)。檢測(cè)試劑盒中,A、B、C、D、E 5個(gè)探針突變共檢測(cè)到10個(gè)基因突變型,其中3例不同時(shí)間標(biāo)本檢出兩種突變型(無/E、ABE/AB、無/B),10個(gè)基因突變類型分別為A(6.12%,3/49)、B(6.12%,3/49)、C(2.04%,1/49)、D(8.16%,4/49)、E(63.27%,31/49)、AB(4.08%,2/49)、AD(2.04%,1/49)、DE(2.04%,1/49)、ABE(2.04%,1/49)和無探針突變(4.08%,2/49)。各突變探針的突變頻率為探針E(63.27%,31/49)>聯(lián)合突變(10.20%,5/49)>探針D(8.16%,4/49)>探針A(6.12%,3/49)=探針B(6.12%,3/49)>無突變(4.08%,2/49)>探針C(2.04%,1/49),探針E突變型屬于優(yōu)勢(shì)型別,在各年度也是優(yōu)勢(shì)型別,見表5。

表5 GeneXpert技術(shù)檢測(cè)利福平耐藥情況分析

46例GeneXpert檢測(cè)利福平耐藥患者中僅有36例為培養(yǎng)陽性患者,其菌株經(jīng)比例法藥敏試驗(yàn),顯示32例耐藥,4例敏感。4例比例法藥敏試驗(yàn)敏感但GeneXpert檢測(cè)耐藥的3例患者為同一個(gè)探針A突變型,另1例為探針E突變型。

548例GeneXpert檢測(cè)利福平敏感的患者中,447例培養(yǎng)陽性,其中170例患者的菌株進(jìn)行了比例法藥敏試驗(yàn),結(jié)果顯示均為敏感。

討 論

分子生物學(xué)方法對(duì)于提高病原學(xué)陽性率具有重要作用。本研究結(jié)果顯示,隨著GeneXpert技術(shù)在肺結(jié)核可疑癥狀者中應(yīng)用比例的提高,提高痰標(biāo)本質(zhì)量并優(yōu)化GeneXpert檢測(cè)對(duì)象(從挑取1份痰標(biāo)本轉(zhuǎn)變?yōu)榛旌霞磿r(shí)痰、夜間痰和晨痰3份痰標(biāo)本),活動(dòng)性肺結(jié)核患者中病原學(xué)陽性比例明顯提高,從2018年的45.07%提升到2022年的69.39%,與其他研究結(jié)果相似[6-8]。且進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),通過實(shí)施GeneXpert,可以進(jìn)一步檢測(cè)出36.86%的涂片陰性而最終病原學(xué)為陽性的患者,以及12.60%的涂片和培養(yǎng)均為陰性的病原學(xué)陽性患者。由此證實(shí)GeneXpert在臨床實(shí)踐中的重要性,此點(diǎn)也與楊超等[9]的研究結(jié)果相似,同時(shí)也提示在可疑癥狀者中,聯(lián)合使用固體培養(yǎng)、涂片鏡檢和GeneXpert 3種檢測(cè)方法,結(jié)合本文中優(yōu)化的標(biāo)本操作對(duì)象,活動(dòng)性肺結(jié)核患者病原學(xué)陽性率達(dá)到約70%(2022年為69.39%),基本是最佳數(shù)據(jù)。

在本研究中,除了2018年GeneXpert檢測(cè)比例較低外,自2019年開始,GeneXpert的檢測(cè)率均達(dá)到90%以上,但研究發(fā)現(xiàn)2019年病原學(xué)檢測(cè)陽性率與2018年相比并沒有明顯差異,分析原因可能為2018年臨床醫(yī)生選取的檢測(cè)患者均為高度疑似肺結(jié)核患者且選取的均為性質(zhì)最好的痰標(biāo)本進(jìn)行GeneXpert檢測(cè),而2019年因采取盡檢原則,其中不合格痰標(biāo)本較多,一定程度上影響了敏感度和病原學(xué)檢測(cè)陽性率。WHO總結(jié)了全球各項(xiàng)研究的GeneXpert總敏感度和特異度,分別為85%和98%[10]。本研究以固體培養(yǎng)結(jié)果為參考,GeneXpert檢測(cè)的敏感度和特異度分別為79.38%(95%CI:76.20%～82.56%)和93.39%(95%CI:92.27～94.51),其中2022年敏感度最高,并且與2019—2021年相比差異明顯,可能是由于2022年進(jìn)行GeneXpert檢測(cè)的標(biāo)本為取3份標(biāo)本混合后進(jìn)行檢測(cè)所致。本研究是一項(xiàng)基于常規(guī)實(shí)驗(yàn)室工作的回顧性分析,痰標(biāo)本質(zhì)量控制無法達(dá)到前瞻性研究的嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn),這也提示在基層結(jié)防機(jī)構(gòu)痰標(biāo)本質(zhì)量依然是影響肺結(jié)核患者病原學(xué)檢測(cè)陽性率的重要因素之一。Sinshaw等[11]的研究表明,痰質(zhì)量是影響GeneXpert陽性檢出率的重要因素,以唾液痰為參考,干酪痰和血痰GeneXpert陽性率分別提高1.39倍和6.9倍,另一項(xiàng)研究也提示GeneXpert敏感度在唾液痰中明顯低于膿性痰(82.5%vs. 95.8%)[12]。在基層結(jié)核病檢測(cè)機(jī)構(gòu)中,在無法嚴(yán)格控制痰標(biāo)本質(zhì)量的情況下,將3份標(biāo)本均量混合再進(jìn)行GeneXpert檢測(cè)可能會(huì)提高肺結(jié)核患者的病原學(xué)檢測(cè)陽性率。

在本研究中,GeneXpert和固體培養(yǎng)不一致主要發(fā)生于細(xì)菌載量低的患者。為了排除由于固體培養(yǎng)質(zhì)量造成的培養(yǎng)假陽性問題,筆者查驗(yàn)原始記錄,這些患者并不集中于某一時(shí)間段或時(shí)間點(diǎn),也不局限于某些陽性標(biāo)本同一操作時(shí)間。因此,排除了由于固體培養(yǎng)操作質(zhì)量發(fā)生交叉污染的可能性,這些不一致的結(jié)果確實(shí)是由于標(biāo)本中含菌量極低所致。

GeneXpert技術(shù)以rpoB基因?yàn)榘袠?biāo)檢測(cè)MTB對(duì)利福平的耐藥性,通過檢測(cè)A～E等5個(gè)分子探針對(duì)rpoB基因81 bp核心區(qū)的覆蓋情況來判斷是否對(duì)利福平耐藥。其與表型藥敏試驗(yàn)檢測(cè)利福平耐藥性的一致性很好,僅出現(xiàn)4例兩種方法檢測(cè)不一致的患者,且主要發(fā)生在GeneXpert結(jié)果為A突變型的患者,既往研究也顯示Leu511Pro的位點(diǎn)突變是造成臨床MTB基因型與表型藥敏試驗(yàn)結(jié)果不一致的主要原因之一[13],其他原因還包括基因突變?yōu)橥x突變(即不引起表型改變);耐藥水平較低,用現(xiàn)有利福平臨界濃度無法檢測(cè)到;表型藥敏試驗(yàn)由于操作步驟較多,極個(gè)別患者可能因操作偏差引起結(jié)果不完全準(zhǔn)確。本研究結(jié)果顯示,北京市朝陽區(qū)僅GeneXpert檢測(cè)陽性肺結(jié)核患者的利福平耐藥率為7.46%,高于北京市昌平區(qū)2019年僅GeneXpert檢測(cè)陽性肺結(jié)核患者的利福平耐藥率(6.3%)[14],以及21世紀(jì)初期北京地區(qū)羅氏固體培養(yǎng)陽性菌株比例法藥敏試驗(yàn)檢測(cè)的利福平耐藥率(5.5%)[15],可能是由于地區(qū)和人口差異,另外方法學(xué)的差異也會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果,如安燕生等[15]應(yīng)用固體培養(yǎng)分離菌株再進(jìn)行表型藥敏試驗(yàn),會(huì)丟掉部分培養(yǎng)陰性但耐藥的患者,而GeneXpert可以彌補(bǔ)此缺陷。本研究對(duì)利福平耐藥肺結(jié)核患者的耐藥基因型進(jìn)行進(jìn)一步分析顯示,本地區(qū)各年度以探針E突變型耐藥為主,與林永通等[16]的研究結(jié)論一致,但與其探針突變頻率的順序有所不同,這說明不同地區(qū)所流行的菌株利福平耐藥基因型略有不同。

綜上所述,北京市朝陽區(qū)結(jié)核病門診部在2018—2022年期間,GeneXpert的逐步廣泛應(yīng)用,不僅提高了活動(dòng)性肺結(jié)核患者的病原學(xué)檢測(cè)陽性率,也能及時(shí)發(fā)現(xiàn)利福平耐藥肺結(jié)核患者。混合3份痰標(biāo)本進(jìn)行GeneXpert檢測(cè)可能有助于提升檢測(cè)陽性率。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)趙愛蘭:醞釀和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、實(shí)施研究、論文撰寫和修改、分析和解釋數(shù)據(jù);余琴:實(shí)施研究、采集數(shù)據(jù)、統(tǒng)計(jì)分析;俞南和張愛潔:實(shí)施研究、采集數(shù)據(jù);夏輝:文章修改和指導(dǎo)、分析和解釋數(shù)據(jù);徐偉:行政/技術(shù)/材料支持、支持性貢獻(xiàn)和指導(dǎo)