王艦,黃鈞浩,葉幫偉,許韓山,孫培龍,楊開*

1(浙江工業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,浙江 杭州,310014) 2(中國(guó)輕工業(yè)食品大分子資源加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(浙江工業(yè)大學(xué)),浙江 杭州,310014) 3(浙江慧和健康科技有限公司,浙江 麗水,323000)4(杭州市臨平區(qū)質(zhì)量計(jì)量監(jiān)測(cè)中心,浙江 杭州,311199)

猴頭菌(Hericiumerinaceus),又稱猴頭菇、獅子鬃毛,是常見的珍稀食藥用菌之一,屬于齒菌科擔(dān)子菌、猴頭菇屬真菌的一種。目前,已從猴頭菌子實(shí)體、菌絲體及發(fā)酵液中分離出多糖、蛋白質(zhì)、萜類、甾醇、酚類等多種營(yíng)養(yǎng)及功能活性物質(zhì)。前期研究發(fā)現(xiàn),猴頭菌具有增強(qiáng)人體免疫[1]、抗腫瘤[2]、抗疲勞[3]、抑菌[4]、保護(hù)胃損傷和治療慢性萎縮性胃炎[5]、調(diào)節(jié)腸道菌群[6]、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞[7-8]等諸多功效。除此之外,最新的研究表明猴頭菌還具有改善學(xué)習(xí)記憶能力[9]、防治阿爾茨海默癥[10]、改善骨關(guān)節(jié)炎癥[11]以及改善衰老過程中運(yùn)動(dòng)能力[12]的潛力。

野生猴頭菌資源有限,常用人工栽培方式培育子實(shí)體。但因人工栽培周期長(zhǎng),且受到環(huán)境因素制約,易受農(nóng)藥、重金屬和塑化劑等殘留影響,不適合現(xiàn)代化工廠發(fā)展。液態(tài)發(fā)酵法能在短時(shí)間內(nèi)獲得大量菌絲體及發(fā)酵液,且工藝設(shè)備較簡(jiǎn)單,生產(chǎn)過程產(chǎn)品品質(zhì)便于控制,已成為一種重要的食藥用菌生產(chǎn)途徑。在過去幾十年中,已經(jīng)有幾十種食藥用菌采用液態(tài)發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)成功,其中大多數(shù)屬于擔(dān)子菌門及子囊菌門[13]。早期液態(tài)發(fā)酵研究中,提高發(fā)酵效率的主要方式是優(yōu)化培養(yǎng)工藝。隨著誘變育種技術(shù)的發(fā)展,已有多種誘變育種技術(shù)應(yīng)用于猴頭菌的菌株變異與篩選,顯著提高了菌株活性與代謝產(chǎn)物生產(chǎn)能力。最近十幾年來,誘導(dǎo)調(diào)控技術(shù)成為了液態(tài)發(fā)酵中新的研究熱點(diǎn),誘導(dǎo)調(diào)控是采用低劑量誘導(dǎo)劑以促進(jìn)目標(biāo)代謝物快速生物合成的一種發(fā)酵策略,具有經(jīng)濟(jì)效益高,特異性強(qiáng),工藝流程簡(jiǎn)單,不易對(duì)環(huán)境造成污染等優(yōu)點(diǎn)[14]。

眾多研究結(jié)果表明猴頭菌液態(tài)發(fā)酵菌絲體及其發(fā)酵液具有很高的食藥用價(jià)值。此前關(guān)于猴頭菌液態(tài)發(fā)酵領(lǐng)域的綜述性文章多針對(duì)于發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化以及發(fā)酵產(chǎn)品應(yīng)用等方面,近十年來缺乏針對(duì)猴頭菌活性物質(zhì)發(fā)酵方面的綜述。本文對(duì)猴頭菌液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)活性物質(zhì)的最新進(jìn)展進(jìn)行綜述,歸納猴頭菌液態(tài)發(fā)酵相關(guān)生產(chǎn)工藝和技術(shù),為進(jìn)一步研究和利用猴頭菌液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)活性物質(zhì)提供參考。

1 猴頭菌菌株誘變育種

選取生長(zhǎng)力旺盛、代謝合成能力強(qiáng)的菌株是實(shí)行猴頭菌液態(tài)發(fā)酵的第一步,也是最關(guān)鍵的一步。目前,優(yōu)良菌株的選育一般是通過從野生猴頭菌中分離并篩選出生長(zhǎng)力強(qiáng)的菌株進(jìn)行純化、傳代。另一種途徑是通過誘變育種的方式,猴頭菌的誘變育種主要通過外源物理干擾,誘導(dǎo)猴頭菌菌株產(chǎn)生突變或調(diào)控基因表達(dá),通過穩(wěn)定傳代篩選出生長(zhǎng)旺盛,分泌代謝產(chǎn)物能力強(qiáng)的變異菌株。常用的方法有紫外線誘變、射線輻照誘變、超聲波誘變、離子束誘變等。如表1所示,研究人員利用篩選后的誘變菌株進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵,與原始菌株相比,誘變菌株在液態(tài)發(fā)酵過程中的生長(zhǎng)速率以及代謝產(chǎn)物產(chǎn)量均明顯提高。

表1 不同誘變育種技術(shù)對(duì)猴頭菌液態(tài)發(fā)酵影響Table 1 Effects of different mutagenesis breeding techniques on liquid fermentation of Hericium erinaceus

1.1 紫外線誘變

紫外線誘變育種成本低、易操作且突變效果好,可在短時(shí)間內(nèi)大量獲得突變體。菌株吸收紫外光后,DNA分子會(huì)形成嘧啶二聚體,引發(fā)DNA空間構(gòu)象的改變,阻礙堿基間正常配對(duì),從而引起誘變[22]。李艷紅等[16]利用紫外線對(duì)猴頭菌株HT1進(jìn)行誘變育種,變異菌株HT65,菌絲體生物量提高率由13.03 g/L提高至21.61 g/L。此外,吳清山[15]通過紫外線誘導(dǎo)猴頭菌株,篩選出的變異菌株經(jīng)液態(tài)發(fā)酵后菌絲體生物量提高86.5%,達(dá)到12.03 g/L,總多糖含量提高35.9%,達(dá)到3.27 g/L。

1.2 γ射線輻照誘變

射線輻射誘變主要使細(xì)胞發(fā)生DNA發(fā)生斷裂、損傷和堿基缺失等多種生物學(xué)效應(yīng)而促使其產(chǎn)生大的突變[23]。王楠等[19]利用60Co-γ射線輻照誘變猴頭菌株,在輻照劑量為800 Gy和劑量率為27.84 Gy/min的條件下選育出的猴頭菌變異株HE-09,液體培養(yǎng)其生物量和原始菌株相比提高14.2%,菌絲多糖產(chǎn)量提高200%。經(jīng)過氧化物同工酶電泳分析,誘變菌株HE-09與原始菌株均有相同的譜帶,但出現(xiàn)了不同譜帶和部分相同譜帶濃度不一致的現(xiàn)象,說明誘變菌株與出發(fā)菌株同源但不同株。GONG等[24]在對(duì)ATRP誘變的猴頭菌進(jìn)行多組學(xué)分析中發(fā)現(xiàn),變異菌株與原始菌株相比,顯著下調(diào)的蛋白質(zhì)中,過氧化物酶為其中之一。誘變菌株產(chǎn)生的變異可能與過氧化物酶的改變有關(guān)。

1.3 超聲波誘變

超聲波的空化、機(jī)械和熱效應(yīng)刺激猴頭菌細(xì)胞產(chǎn)生對(duì)應(yīng)激環(huán)境的防御反應(yīng),影響與生物體代謝合成途徑相關(guān)的基因的表達(dá)。此外,利用超聲波空化效應(yīng)及其次生效應(yīng),即高壓高頻瞬變機(jī)械效應(yīng),可以剪切基因,改變蛋白質(zhì)表達(dá)水平,實(shí)現(xiàn)誘變育種[25]。張帥等[17]采用超聲波誘變猴頭菌菌株,經(jīng)篩選后的猴頭菌變異株H-2,經(jīng)液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)后,菌絲體粗多糖含量提高1.2%。經(jīng)抑菌性測(cè)試,從猴頭菌變異株H-2提取出的子實(shí)體多糖對(duì)金黃色葡萄球菌有強(qiáng)抑制效果,原菌株提取多糖則對(duì)金黃色葡萄球菌無明顯抑制效果。超聲誘導(dǎo)可能影響了多糖結(jié)構(gòu)。

1.4 離子束誘變

ARTP誘變育種技術(shù)具有放電均勻且穩(wěn)定、誘變時(shí)間短、安全性高、基因突變體的穩(wěn)定性高等特點(diǎn),主要作用對(duì)象為細(xì)胞,造成細(xì)胞內(nèi)DNA損傷,從而引發(fā)突變[26]。楊珊等[27]采用ARTP技術(shù)對(duì)猴頭菌原生質(zhì)體進(jìn)行誘變,經(jīng)重復(fù)培養(yǎng)、穩(wěn)定遺傳后,篩選出的變異株猴頭菌321液態(tài)發(fā)酵生物量和多糖含量分別提高了30.37%和47.45%。宋甜甜等[18]在前者的基礎(chǔ)上,對(duì)誘變的3株菌株提取的菌絲體多糖進(jìn)行研究并與原始菌株比較,發(fā)現(xiàn)變異菌株菌絲體多糖結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,誘變菌株236的20%醇沉多糖H2P40表現(xiàn)出較好的免疫活性,明顯高于原始菌株。進(jìn)一步分析顯示,ARTP誘變改變了菌絲體多糖分子量質(zhì)分布與單糖組成。其中變異菌株大分子多糖比例增加;H4P20與原始菌株菌絲體多糖相比,單糖組成中葡萄糖與甘露糖比例有明顯提高。GONG等[24]進(jìn)一步對(duì)ARTP誘變的猴頭菌株通過多組學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)編碼UDP-葡萄糖4-差向異構(gòu)酶的A6180基因片段在猴頭菇突變株中顯著上調(diào),這與突變菌株中多糖的產(chǎn)量較高有關(guān)。此外,誘變株Ras-cAMP-PKA途徑的蛋白表達(dá)譜顯著降低,而多糖含量顯著增加47.45%。S期阻滯實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)Ras-cAMP-PKA途徑的功能障礙可能促進(jìn)突變株產(chǎn)生高水平的多糖和β-葡聚糖。

低能離子束誘導(dǎo)也是菌株誘變常用方法之一,低能離子束注入會(huì)刻蝕細(xì)胞,增加細(xì)胞通透性,在細(xì)胞表面形成孔洞,細(xì)胞表面及內(nèi)部的孔洞和空腔連接成特定通道,使后續(xù)離子深入到遺傳物質(zhì),進(jìn)而產(chǎn)生其他生物學(xué)效應(yīng)[28]。低能離子束誘導(dǎo)具有損傷輕,誘變率高等特點(diǎn)。譚一羅等[21]采用N+離子注入技術(shù)誘變猴頭菌孢子,在12×1016ions/cm2,注入能量為15 keV的離子束下成功選育出一株猴頭菌誘變株H1215,生長(zhǎng)速率及液體發(fā)酵生物量分別提高了25.30%和30.67%。嚴(yán)濤等[20]則采用N+離子注入技術(shù)對(duì)猴頭菌菌株進(jìn)行誘變,并進(jìn)行了高溫耐熱試驗(yàn),成功選育出一株能在高溫下生長(zhǎng)較快的突變菌株,突變株較原始菌株生長(zhǎng)速度提高了44.41%,多糖含量提高了224.42%,總氨基酸含量提高了12.12%。

2 猴頭菌生物活性物質(zhì)液態(tài)發(fā)酵工藝

培養(yǎng)基的組成與配比直接影響著猴頭菌液態(tài)發(fā)酵菌絲體的形態(tài)與生物活性物質(zhì)的合成,選擇合適的培養(yǎng)基,是提高液態(tài)發(fā)酵中猴頭菌生物活性物質(zhì)產(chǎn)量最直觀有效的方法。表2列舉了多種針對(duì)猴頭菌特定活性物質(zhì)所篩選的優(yōu)化培養(yǎng)基,發(fā)現(xiàn)在不同品系的猴頭菌之間,營(yíng)養(yǎng)需求也可能并不相同。面對(duì)不同的生物活性產(chǎn)物的需求,所選用的最佳培養(yǎng)基組分也有所區(qū)別,因此,針對(duì)不同品系的猴頭菌以及目標(biāo)活性物質(zhì)進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵工藝研究很有必要。

表2 猴頭菌在不同培養(yǎng)條件中生物量及代謝物產(chǎn)量Table 2 Biomass and metabolite production of Hericium Erinaceus under different culture conditions

2.1 多糖

多糖作為猴頭菌最主要的活性成分之一,利用液態(tài)發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)猴頭菌多糖是主要的研究方向。已有眾多研究人員優(yōu)化液態(tài)發(fā)酵工藝生產(chǎn)猴頭菌多糖,并研究其生物活性及營(yíng)養(yǎng)功能。利用液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)的猴頭菌多糖具有生產(chǎn)周期短,產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定等優(yōu)勢(shì)。菌絲體多糖和胞外多糖是不同代謝途徑的產(chǎn)物,因此適合它們生產(chǎn)的最佳營(yíng)養(yǎng)素有所不同[29]。

為了提高菌絲體多糖含量,所選用培養(yǎng)基必須同時(shí)促進(jìn)菌絲體發(fā)育和代謝產(chǎn)物合成。菌絲體多糖含量和組成受碳源種類的影響比較顯著。汪敬健等[30]在進(jìn)行猴頭菌液體培養(yǎng)基優(yōu)化發(fā)現(xiàn),以葡萄糖和可溶性淀粉為碳源時(shí),均可以獲得較高的菌絲體生物量,而發(fā)酵培養(yǎng)基以可溶性淀粉為碳源時(shí),菌絲體多糖含量最高。速效碳源(葡萄糖、麥芽糖等)搭配復(fù)合碳源(玉米粉、山藥粉等)是一種更有效的培養(yǎng)基,不僅兼顧前期菌絲體發(fā)育,也解決了后期代謝產(chǎn)物合成后勁不足的問題。例如,信文娟等[31]優(yōu)化猴頭菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基,相比其他碳源,發(fā)現(xiàn)葡萄糖與山藥粉組成的復(fù)合碳源培養(yǎng)的菌絲體量和多糖產(chǎn)量最高,可達(dá)0.95 g/L,多糖含量為52.5 mg/g。張?bào)忝返萚32]選用2%葡萄糖、0.5%酵母膏、2%麥麩、2%玉米粒、1%(均為質(zhì)量分?jǐn)?shù))豆粉作為培養(yǎng)基碳氮源,在26 ℃、pH 5.0條件下對(duì)猴頭菌進(jìn)行罐批發(fā)酵,菌絲體多糖含量可達(dá)130 mg/g,產(chǎn)量最高可達(dá)1.38 g/L。

除菌絲體多糖外,猴頭菌胞外多糖的分泌受碳源和氮源影響都顯著,這可能與胞外多糖復(fù)雜的轉(zhuǎn)化過程有關(guān)。MALINOWSKA等[29]在碳源篩選過程中,發(fā)現(xiàn)蔗糖有利于提高胞外多糖產(chǎn)量,但影響了菌絲體生長(zhǎng)量,這一結(jié)果同樣與汪敬健等[30]的研究相似;此外,研究還發(fā)現(xiàn)麥芽提取物能同時(shí)促進(jìn)菌絲體生長(zhǎng)和胞外多糖分泌。在氮源方面,無機(jī)氮源促進(jìn)了胞外多糖的合成,卻抑制了菌絲體生長(zhǎng),因?yàn)樗鼰o法提供菌絲體生長(zhǎng)所需要的必需氨基酸。最近,萬寧威等[33]研究對(duì)比多種營(yíng)養(yǎng)素,發(fā)現(xiàn)復(fù)雜的碳氮源更利于猴頭菌發(fā)酵,提高猴頭菌發(fā)酵液營(yíng)養(yǎng)成分的最佳碳源為可溶性淀粉和玉米粉,氮源為酵母浸粉和山藥汁,胞外多糖產(chǎn)量達(dá)到5.12 g/L。在單因素試驗(yàn)篩選碳氮源過程中,復(fù)合組碳氮源均比單一組分的碳氮源(如葡萄糖、蛋白胨、酵母粉等)更適合促進(jìn)猴頭菌胞外多糖的分泌。值得注意的是,猴頭菌在這些含淀粉的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)速率和活性物質(zhì)產(chǎn)量都有所提高,適合在工廠化生產(chǎn)中獲得富含多糖的高質(zhì)量猴頭菌菌粉及發(fā)酵液等粗產(chǎn)物,作為藥用材料或食品輔料。但若其中的淀粉未被完全利用,則會(huì)對(duì)猴頭菌胞外活性多糖后續(xù)的分離純化增加一定難度。

2.2 猴頭菌素

猴頭菌素(erinacine)主要是一類Cyathane型二萜化合物,液態(tài)發(fā)酵過程中主要在菌絲體中富集,也有少量在猴頭菌發(fā)酵液中被發(fā)現(xiàn)(猴頭菌素E和Q)。目前發(fā)現(xiàn)的20種猴頭菌素化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示。猴頭菌素具有刺激神經(jīng)生長(zhǎng)因子合成的生物活性,可用于治療神經(jīng)退行性疾病和周圍神經(jīng)病。到目前為止,已分離鑒定出20種左右的猴頭菌素(猴頭菌素A～K、P～V和Z1、Z2)(圖1),進(jìn)一步研究表明其具有不同的神經(jīng)保護(hù)活性,例如促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)因子釋放(猴頭菌素A～I(xiàn))、減少β淀粉樣蛋白沉積、增加胰島素降解酶的表達(dá)(猴頭菌素A和S)或止痛(猴頭菌素E)[34]。猴頭菌素A已被證實(shí)具有抗腫瘤活性,研究人員發(fā)現(xiàn)猴頭菌素A可以在體外抑制DLD-1細(xì)胞的增殖,并在體內(nèi)抑制DLD-1細(xì)胞的生長(zhǎng)[35]。猴頭菌素雖然能通過化學(xué)合成,但是其步驟繁瑣,易產(chǎn)生副產(chǎn)物[34],液態(tài)發(fā)酵是猴頭菌素增產(chǎn)的重要途徑。因此,優(yōu)化液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)猴頭菌素工藝非常必要。

圖1 二十種猴頭菌素化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of 20 erinacines

目前,主要針對(duì)與猴頭菌素A與猴頭菌素C液體發(fā)酵及優(yōu)化的研究比較多,這可能與它們?cè)诰z體中含量較高有關(guān)。KRZYCZKOWSKI等[36]發(fā)現(xiàn)pH 4～5的環(huán)境可能是促進(jìn)猴頭菌素A合成的有利因素,最適的碳氮源分別為葡萄糖和酪蛋白胨,并采用中心復(fù)合旋轉(zhuǎn)設(shè)計(jì)法優(yōu)化了培養(yǎng)基,采用最適培養(yǎng)基組成(g/L):葡萄糖69.87,酪蛋白胨11.17,氯化鈉1.45,硫酸鋅0.055,磷酸二氫鉀1.0,pH 4.5;25 ℃下,在10 L生物反應(yīng)器中可獲得192.73 mg/L的猴頭菌素A。CHANG等[7]在前者研究基礎(chǔ)上,額外添加了亞鐵、銅、錳、鎳金屬離子,猴頭菌素A產(chǎn)量提高到225.54 mg/L。在大型發(fā)酵罐生產(chǎn)實(shí)例中,LI等[37]用20 t發(fā)酵罐生產(chǎn)猴頭菌素,優(yōu)化培養(yǎng)基由0.25% 酵母膏、4.5%葡萄糖、0.5%黃豆粉、0.25%蛋白胨和0.05%(均為質(zhì)量分?jǐn)?shù))硫酸鎂組成,pH 4.5,溫度為25 ℃。在發(fā)酵12 d后,觀察到猴頭菌素A的積累產(chǎn)量最高為5 mg/g干菌絲體。

在優(yōu)化猴頭菌素C發(fā)酵培養(yǎng)基研究中,WOLTERS等[8]發(fā)現(xiàn),燕麥片和Edamin@K(一種水解乳清蛋白)是增加猴頭菌素C產(chǎn)量的關(guān)鍵。其采用最適培養(yǎng)基組成為燕麥片5 g/L,碳酸鈣1.5 g/L,EDamin@K 0.5 g/L,pH 7.5,培養(yǎng)6 d后猴頭菌素C質(zhì)量濃度可達(dá)2.73 g/L。但是在其方法中,是將一級(jí)種子液離心濃縮去除預(yù)培養(yǎng)基組分,菌絲體再以體積比5∶10的接種量接種至主發(fā)酵培養(yǎng)基中。但該方法只適用于實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模研究培養(yǎng),不適用于工廠化大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn),因?yàn)楦邼舛纫后w種子難以適應(yīng)大型生物反應(yīng)器的無菌操作[34]。WOLTERS等[38]進(jìn)一步研究還發(fā)現(xiàn),采用酸化處理后的啤酒糟和小麥麩皮可作為產(chǎn)猴頭菌素C的培養(yǎng)基原料,猴頭菌經(jīng)酸化啤酒糟基質(zhì)和酸化小麥麩皮基質(zhì)預(yù)培養(yǎng)后,采用上述方法接種至主發(fā)酵培養(yǎng)基,其中采用酸化啤酒糟預(yù)培養(yǎng)的猴頭菌素C含量為174.8 mg/g菌絲體干重,采用小麥麩皮預(yù)培養(yǎng)的猴頭菌素C含量為99.3 mg/g菌絲體干重,這對(duì)利用加工廢棄副產(chǎn)物利用有重要意義。

2.3 甾醇

猴頭菌中甾醇類物質(zhì)主要為麥角甾醇及其衍生物,麥角甾醇具有抗炎作用,在體內(nèi)還可以通過代謝轉(zhuǎn)換成骨化二醇的活性形式,起到調(diào)節(jié)機(jī)體代謝作用。LI等[39]從猴頭菌菌絲體的甲醇提取物中分離得到11種麥角烷型脂肪酸酯,其中Erinarol A～I(xiàn)為新發(fā)現(xiàn)的化合物。Erinarol A、B以劑量依賴的方式顯著激活過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptor,PPAR)的轉(zhuǎn)錄活性,目前,PPAR是設(shè)計(jì)和開發(fā)治療2型糖尿病和代謝綜合征激動(dòng)劑的治療靶點(diǎn)。

研究發(fā)現(xiàn),可以通過優(yōu)化培養(yǎng)基提高猴頭菌中甾醇類物質(zhì)的產(chǎn)量。杜嬌[40]采用優(yōu)化培養(yǎng)基:3.3%葡萄糖、0.3%蛋白胨、0.15%硫酸鎂、3.2%(均為質(zhì)量分?jǐn)?shù))豆粕粉,在pH 5.0～5.5,溫度25 ℃條件下,猴頭菌麥角甾醇產(chǎn)量最高為57.77 mg/L。與前者不同的是,張忠等[41]研究了猴頭菇高產(chǎn)麥角甾醇液態(tài)發(fā)酵工藝,采用0.74%葡萄糖、0.66%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))麥芽浸粉作為復(fù)合碳源,1.8%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))酵母自溶粉為氮源,配備液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基,在26 ℃,pH自然的條件下,麥角甾醇含量可達(dá)到69.79 mg/L。在對(duì)誘變后菌株的發(fā)酵工藝優(yōu)化方面,蔡佳佳等[42]通過紫外線誘變育種,篩選出一株高產(chǎn)麥角甾醇的猴頭菌菌株,在優(yōu)化培養(yǎng)基:葡萄糖2%、酵母膏0.5%、磷酸二氫鉀0.15%、硫酸鎂0.075%、蛋白胨1%(均為質(zhì)量分?jǐn)?shù))、起始pH值5.0,溫度23 ℃條件下,發(fā)酵獲得菌絲體粉麥角甾醇含量高達(dá)18.44 mg/g,總產(chǎn)量可達(dá)到114.79 mg/L。上述研究均發(fā)現(xiàn),適合猴頭菌液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)麥角甾醇的最佳碳源為葡萄糖,最佳氮源為酵母膏和蛋白胨,額外添加麥芽浸粉、豆粨粉等復(fù)雜碳氮源均有助于提高麥角甾醇產(chǎn)量。除此之外,誘變育種技術(shù)對(duì)提升猴頭菌麥角甾醇的產(chǎn)量有顯著作用。

2.4 其他活性物質(zhì)

猴頭菌液態(tài)發(fā)酵還可以生產(chǎn)糖苷酶類,杜嬌等[45]研究猴頭菌液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)α-半乳糖苷酶的培養(yǎng)條件,以3%豆粕粉、2.3%葡萄糖、1.9%蛋白胨、0.3%(均為質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鎂為優(yōu)化培養(yǎng)基,在pH 5.0～6.0,溫度25 ℃條件下,培養(yǎng)發(fā)酵液中α-半乳糖苷酶活性可達(dá)1.178 U/mL,較未優(yōu)化前提高48.9%。

在猴頭菌菌絲體中,還分離鑒定出如酚類、吡喃酮類、生物堿類等化合物。KOBAYASHI等[46]發(fā)現(xiàn)酚類物質(zhì)Hericene A～C具有一定的生物活性作用,Hericene A對(duì)Hela細(xì)胞以及α-葡萄糖苷酶均具有抑制活性,Hericenes B和C對(duì)毒胡蘿卜素誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激依賴性細(xì)胞凋亡具有一定的保護(hù)作用。汪楷等[47]針對(duì)猴頭菌屬次級(jí)代謝產(chǎn)物(hericenes、erinapyrones和erinacerins等)已有較多闡述,但針對(duì)這些活性物質(zhì)的優(yōu)化發(fā)酵還尚未見報(bào)道,這可能與其在猴頭菌發(fā)酵產(chǎn)物中含量過低有關(guān)。

3 發(fā)酵誘導(dǎo)技術(shù)

為了高效生產(chǎn)目標(biāo)次生代謝產(chǎn)物,需要刺激細(xì)胞的生物合成,最常用的方法是選擇各種合適的誘導(dǎo)子[48]。誘變育種技術(shù)與發(fā)酵工藝優(yōu)化均能顯著提升液態(tài)發(fā)酵中生物活性物質(zhì)的產(chǎn)量,但誘變育種技術(shù)存在一定不確定性,發(fā)酵工藝優(yōu)化方法也有一定局限性,誘導(dǎo)發(fā)酵技術(shù)成為了新的突破方向,并能與前兩種技術(shù)發(fā)揮協(xié)同作用。誘導(dǎo)子是一類特殊觸發(fā)因子,它能觸發(fā)真菌細(xì)胞對(duì)脅迫做出一系列的防御反應(yīng),調(diào)控代謝過程中酶的活性,從而增加植物次生代謝產(chǎn)物的合成[14]。根據(jù)來源不同,誘導(dǎo)子可分為兩種類型,即生物誘導(dǎo)子與非生物誘導(dǎo)子,非生物誘導(dǎo)子又分為物理誘導(dǎo)子和化學(xué)誘導(dǎo)子。關(guān)于利用誘導(dǎo)子在猴頭菌發(fā)酵領(lǐng)域中還僅有少量研究,如表3所示,本文在此將介紹猴頭菌及其他幾種食用菌的研究作為參考,以期在未來借鑒采用更多誘導(dǎo)方式應(yīng)用于猴頭菌液態(tài)發(fā)酵研究。

表3 猴頭菌及其他食藥用菌的液態(tài)發(fā)酵誘導(dǎo)影響Table 3 Effect of liquid fermentation induction on Hericium Erinaceus and other edible and medicinal mushrooms

3.1 物理誘導(dǎo)

物理誘導(dǎo)因素通常有光照、干旱、高低溫脅迫等。LU等[49]研究不同光源誘導(dǎo)中華美味蘑菇產(chǎn)生胞外多糖,通過比較6種光源發(fā)現(xiàn),藍(lán)光是最適合中華美味蘑菇在液態(tài)發(fā)酵中促進(jìn)胞外多糖生產(chǎn)的誘導(dǎo)光源。藍(lán)光照射誘導(dǎo)顯著提高了胞外多糖的產(chǎn)量,與黑暗環(huán)境下相比胞外多糖產(chǎn)率提高了42%。

近年來,弱磁場(chǎng)應(yīng)用于微生物培養(yǎng)展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。磁場(chǎng)處理會(huì)影響細(xì)胞的微觀結(jié)構(gòu);它會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜脂質(zhì)流動(dòng)性的加速,從而使細(xì)胞能夠?qū)ν獠繎?yīng)激刺激做出反應(yīng),從而保護(hù)細(xì)胞內(nèi)部。細(xì)胞膜通透性的增加,也讓細(xì)胞能吸收更多營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),增加分泌代謝產(chǎn)物能力[25]。研究表明,磁場(chǎng)能促進(jìn)猴頭菌的生長(zhǎng)和胞外多糖的分泌。高夢(mèng)祥等[50]在猴頭菌液態(tài)發(fā)酵過程中,利用低交變磁場(chǎng)誘導(dǎo),與對(duì)照組相比,發(fā)現(xiàn)菌絲體干重增長(zhǎng)率達(dá)140.1%,菌體胞外多糖質(zhì)量濃度增長(zhǎng)率達(dá)271.7%。磁場(chǎng)作用影響了細(xì)胞的微觀結(jié)構(gòu),經(jīng)過放大觀察,菌絲體在磁場(chǎng)影響下,結(jié)構(gòu)變疏松,這種結(jié)構(gòu)更利于菌絲體與外界物質(zhì)的交換[51]。

3.2 化學(xué)誘導(dǎo)

常用的化學(xué)誘導(dǎo)子有植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、重金屬離子、油脂類物質(zhì)、信號(hào)分子刺激物等?；瘜W(xué)誘導(dǎo)子具有快速、穩(wěn)定、專一性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì),可以選擇性誘導(dǎo)食用菌特定基因的表達(dá),從而實(shí)現(xiàn)代謝產(chǎn)物的積累[52]。DAI等[53]利用水楊酸和茉莉酸甲酯調(diào)控猴頭菌生產(chǎn)麥角甾醇,在培養(yǎng)基中添加適宜濃度的茉莉酸甲酯,猴頭菌菌絲體中麥角甾醇含量提高了25.8%。除添加刺激物外,添加表面活性劑也是重要手段之一。OKUMURA等[54]采用吐溫80誘導(dǎo)猴頭菌菌絲體發(fā)酵,可以顯著增加細(xì)胞膜的通透性,有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收、胞外多糖的生物合成和胞外多糖分泌。經(jīng)吐溫80誘導(dǎo),收獲的干菌絲體量相較對(duì)照組提高了118%,β-葡聚糖產(chǎn)量相較對(duì)照組提高了87%。

信號(hào)分子誘導(dǎo)也是化學(xué)誘導(dǎo)的重要途徑,如法尼醇作為真菌中的群體感應(yīng)分子,可以通過促進(jìn)多糖的生物合成和調(diào)節(jié)菌絲形態(tài)而顯著提高胞外多糖(exopoly saccharides,EPS)產(chǎn)量。法尼醇使雜色木霉菌絲發(fā)育成蓬松、疏松的多菌絲形態(tài),有利于胞內(nèi)多糖向培養(yǎng)基內(nèi)排泄[55]。WANG等[56]通過外源添加群體感應(yīng)分子法尼醇來提高灰樹花液體發(fā)酵EPS的產(chǎn)量、抗氧化活性和抗腫瘤活性,經(jīng)法尼醇誘導(dǎo),EPS產(chǎn)量為1.25 g/L,比對(duì)照提高150%,通過分級(jí)醇沉出4種多糖組分,EPS-F-0.2M具有最高的抗氧化和抗腫瘤活性,說明法尼醇可能通過影響結(jié)構(gòu)和性質(zhì)來調(diào)節(jié)EPS的生物活性。這可為法尼醇在誘導(dǎo)猴頭菌液態(tài)發(fā)酵提供參考。

3.3 生物誘導(dǎo)

生物誘導(dǎo)子是指來源于動(dòng)植物細(xì)胞或微生物中的物質(zhì),包括細(xì)菌、真菌、酵母提取物、細(xì)胞壁成分、代謝產(chǎn)物、蛋白質(zhì)和脂類等。例如,YANG等[57]通過人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化猴頭菌、雙孢菇和雞腿菇菌絲體共發(fā)酵產(chǎn)蒽醌,相比單種食用菌組合發(fā)酵,產(chǎn)率要明顯提高。蒽醌產(chǎn)率從0.55%～0.97%大大提高至2.11%。此外,MA等[58]發(fā)現(xiàn),在牛樟芝液態(tài)發(fā)酵第7天,添加橘子皮提取物,可顯著促進(jìn)多酚和三萜類化合物產(chǎn)生,這可能與橘子皮中的柑橘精油含大量萜烯類物質(zhì)有關(guān)。并且,牛樟樹皮提取物也被證實(shí)能有效促進(jìn)牛樟芝菌絲體生長(zhǎng)和生物活性物質(zhì)的產(chǎn)量[59]。目前,利用生物誘導(dǎo)子促進(jìn)猴頭菌液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物的研究還很少,生物誘導(dǎo)調(diào)控在液態(tài)發(fā)酵中效率高、符合綠色生產(chǎn)原則,還能實(shí)現(xiàn)資源的可再生利用。猴頭菌中次生代謝產(chǎn)物種類豐富,可利用的活性價(jià)值高,利用誘導(dǎo)策略促進(jìn)猴頭菌高價(jià)值的次生代謝產(chǎn)物發(fā)酵生產(chǎn)是猴頭菌液態(tài)發(fā)酵研究的一大趨勢(shì)。

4 總結(jié)與展望

猴頭菌自古以來就以其味道鮮美、生物活性高而廣受關(guān)注。為了滿足猴頭菌產(chǎn)量日益增長(zhǎng)的需求,液態(tài)發(fā)酵為猴頭菌及其活性物質(zhì)提供了一種高效的生產(chǎn)途徑,具有廣闊的工業(yè)應(yīng)用前景和極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。本文從菌株選育、發(fā)酵工藝以及誘導(dǎo)調(diào)控3個(gè)方面對(duì)猴頭菌液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)活性物質(zhì)的方法進(jìn)行了總結(jié)和歸納。目前,大多數(shù)研究都側(cè)重于猴頭菌液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化的研究,而在誘導(dǎo)調(diào)控猴頭菌液態(tài)發(fā)酵,促進(jìn)代謝產(chǎn)物生成方面的研究還較缺乏。近年來,已有研究通過代謝組學(xué)分析,確定了猴頭菌中多糖與萜類等物質(zhì)合成的上游通路和關(guān)鍵酶[24,60],這為探索尋找猴頭菌液態(tài)發(fā)酵誘導(dǎo)調(diào)控中新的誘導(dǎo)子提供了新的思路。猴頭菌中活性物質(zhì)的提取、分離、鑒定和功能方面的研究已較有較多闡述,而在開發(fā)和利用高效、綠色、經(jīng)濟(jì)的新誘導(dǎo)技術(shù)來提高目標(biāo)活性產(chǎn)物的發(fā)酵效率,是猴頭菌液態(tài)發(fā)酵領(lǐng)域的發(fā)展趨勢(shì)。