趙世博,劉俊霞,何琳琳,姜鵬飛,程虎,金文剛*

1(陜西理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院,秦巴生物資源與生態(tài)環(huán)境省部共建培育國家重點實驗室,陜西 漢中,723001)2(陜西理工大學(xué) 陜西省資源生物重點實驗室,陜西 漢中,723001) 3(陜西理工大學(xué) 陜南秦巴山區(qū)生物資源綜合開發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心,陜西 漢中,723001) 4(大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院,國家海洋食品工程技術(shù)研究中心,遼寧 大連,116034) 5(漢中市龍頭山水產(chǎn)養(yǎng)殖開發(fā)有限公司,陜西 漢中,723001)

大鯢為我國特有的兩棲動物,具有豐富的營養(yǎng)價值和藥用價值[1]。大鯢肉富含優(yōu)質(zhì)蛋白,必需氨基酸含量高,不飽和脂肪酸含量高,通過酶解后的大鯢肽具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)的功能[2],具有較大開發(fā)利用潛力。活性氧能夠攻擊蛋白質(zhì),致使細胞膜脂質(zhì)過氧化,使蛋白質(zhì)交聯(lián)變性、酶活性喪失、細胞老化甚至死亡[3]。D-半乳糖(D-galactosidase,D-gal)能夠?qū)е卵趸瘧?yīng)激,進而導(dǎo)致表觀上和生理上的退行性衰老。近年來,開發(fā)具有抗衰老作用的多肽類物質(zhì)成為研究熱點。ZHANG等[4]對D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老小鼠分別灌胃Na2SeO3、SeMet、大豆肽和含硒大豆肽,發(fā)現(xiàn)含硒大豆肽可以提高小鼠肝臟超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶-1(glutathione peroxidase, GSH-Px)的活力,降低天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶和核因子(nuclear factor kappa-B,NF-κB)含量,可通過調(diào)節(jié)絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)/NF-κB通路抑制腦的氧化應(yīng)激,且含硒肽在抗氧化活性方面優(yōu)于其他硒補充劑。YU等[5]采用D-半乳糖誘導(dǎo)建立衰老大鼠模型,通過灌胃大鼠堇葉碎米薺富硒肽,發(fā)現(xiàn)富硒肽可增加衰老大鼠血清中的SOD、GSH-Px、過氧化氫酶(catalase, CAT)、總抗氧化能力(total antioxidant capacity, T-AOC),降低活性氧(reactive oxigen species, ROS)和丙二醛(malondialdehyde, MDA)水平,并激活Nrf2(調(diào)控抗氧化應(yīng)激的一種關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子)/血紅素氧合酶1(heme oxygenase-1,HO-1)/醌氧化還原酶1(quinone oxidoreductase 1,QO1)通路,抑制衰老大鼠NF-κB通路來減輕神經(jīng)炎癥。ZHU等[6]通過分離純化獲得堇葉碎米薺富硒肽,并利用堇葉碎米薺富硒肽灌胃D-半乳糖誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷小鼠,研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)堇葉碎米薺富硒肽可提高小鼠血清和心臟、肝臟組織中的抗氧化酶活力,降低MDA和蛋白質(zhì)羰基含量。

課題組前期優(yōu)化制備了大鯢肽-硒螯合物,并比較了多肽和肽硒螯合物的結(jié)構(gòu)特征和抗氧化活性[7],發(fā)現(xiàn)大鯢肽-硒螯合物具有更強的體外抗氧化活性。已有研究報道了大鯢肽對D-半乳糖致小鼠機體氧化損傷的修復(fù)作用[8],然而有關(guān)大鯢肽-硒螯合物的體內(nèi)抗氧化活性,尚未見報道。為此,本研究通過D-半乳糖誘導(dǎo)建立小鼠氧化應(yīng)激損傷模型,探究大鯢肽硒螯合物對氧化損傷小鼠不同組織抗氧化指標的影響,旨在為大鯢活性肽高值產(chǎn)品開發(fā)提供理論和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

凍干大鯢肽(giant salamander peptides, GSP)(分子質(zhì)量低于3 000 Da)和大鯢肽-硒螯合物(giant salamander peptide-selenium chelate, Se-GSP),由陜西省資源生物重點實驗室提供,制備方法和部分性質(zhì)詳見文獻[7]。昆明種小鼠[CKX(陜)2018-001],由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心提供。

亞硒酸鈉,天津市大茂化學(xué)試劑廠;D-半乳糖,上海麥克林生化科技有限公司;BCA試劑盒、T-SOD試劑盒、MDA試劑盒、GSH-Px試劑盒、T-AOC試劑盒、GSH試劑盒、蛋白質(zhì)羰基測試盒,南京建成生物工程研究所;4%多聚甲醛,阿拉丁公司;二甲苯,國藥集團化學(xué)試劑有限公司;石蠟切片,上海華靈康復(fù)器械廠。

1.2 儀器與設(shè)備

Evolution 201紫外-可見分光光度計,賽默飛世爾科技公司;Spectra Max M3 全波長多功能酶標儀,美國Molecular Devices公司;DSX-18L高壓蒸汽滅菌鍋,上海博訊醫(yī)療生物儀器有限公司;F10高速勻漿機,天津恒奧科技發(fā)展有限公司;Allegra X-30R型離心機,Beckman coulter有限公司;HistoCore Arcadia生物組織包埋機、RM2015組織攤片機、HistoCore AUTOCUT 切片機、DM3000光學(xué)顯微鏡,德國Leica公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 模型建立及分組給藥

取6周齡,體重18～22 g的雄性昆明小鼠,在溫度(22±2) ℃,相對濕度50%～70%,12 h光照周期的條件進行適應(yīng)性喂養(yǎng),期間自由飲食飲水,每天同一時間段測定體重,觀察小鼠的活動并記錄。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,采用隨機抽樣的方法,將小鼠分為8組,每組10只,分別是正常對照組(Normal)、模型對照組(Model)、陽性對照組(AA)、大鯢肽低劑量組(GSP-L)、大鯢肽高劑量組(GSP-H)、大鯢肽-硒螯合物低劑量組(Se-GSP-L)、大鯢肽-硒螯合物高劑量組(Se-GSP-H)、亞硒酸鈉組(Na2SeO3)。除正常對照組外,對其余7組小鼠進行腹腔注射600 mg/(kg·bw)D-半乳糖構(gòu)建氧化應(yīng)激損傷模型。正常對照組小鼠腹腔注射等體積的生理鹽水,每日一次,持續(xù)注射9周。建模4周后,7個試驗組分別給予對應(yīng)的干預(yù),分組及給藥情況見圖1。其中正常對照組小鼠給予L-抗壞血酸(L-ascorbicacid,AA)100 mg/(kg·bw)[8],GSP的低劑量和高劑量分別為100 mg/(kg·bw)、400 mg/(kg·bw)[9],Se-GSP的低劑量組和亞硒酸鈉劑量組是根據(jù)《中國居民膳食指南》中的硒每日推薦攝入量60 μg/d換算而得。連續(xù)灌胃4周,每天根據(jù)每只小鼠的體重進而調(diào)整灌胃體積。本研究中相關(guān)動物實驗內(nèi)容符合實驗動物倫理委員會的基本要求并經(jīng)過審批(批準號:DLPU2022103)。

圖1 各組小鼠分組、建模及給藥情況Fig.1 Classification, modelling, and administration of mice in each group

1.3.2 體重和臟器指數(shù)的測定

觀察小鼠的外觀和形態(tài)變化,定期檢測并記錄小鼠的體重,并對小鼠的體重變化進行分析。試驗結(jié)束后,用乙醚致小鼠昏迷,眼球取血,取血后將小鼠脫臼處死。解剖小鼠并取出小鼠的肝臟、心臟、脾臟、腎臟、胸腺等組織器官,用預(yù)冷的生理鹽水沖洗,濾紙吸干水分,對其進行稱重并計算臟器指數(shù)。組織稱重結(jié)束后,將不同的器官分開存放于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。臟器指數(shù)的計算如公式(1)所示:

1.3.3 血清及組織勻漿的制備

試驗結(jié)束后,小鼠乙醚麻醉后進行眼球取血,將收集的血液在37 ℃條件下靜置1 h,后在4 ℃冰箱中放置12 h,2 500 r/min條件下離心10 min,用移液器吸取上層液體,獲取血清樣本,將各組小鼠血清進行抗氧化指標的檢測。

準確稱取組織,用預(yù)冷的生理鹽水對組織進行漂洗,濾紙擦干,稱重,用剪刀將組織剪碎后放入高速勻漿器中,加入9倍體積(料液比)預(yù)冷的生理鹽水,在冰水浴條件下充分勻漿,并將勻漿于4 ℃,3 000 r/min的條件下離心10 min,取上清液備用。

1.3.4 抗氧化指標測定

根據(jù)ELISA試劑盒說明書,測定各組小鼠的血清、肝、腦、心臟中T-AOC活力、SOD活力、GSH活力、GSH-Px活力、MDA含量、蛋白質(zhì)羰基含量;其中肝、腦、心臟組織的總蛋白含量均按照試劑盒說明書測定。

1.3.5 組織器官病理學(xué)觀察

將小鼠解剖后,取小鼠腦組織、肝組織固定,石蠟包埋切片進行蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining,HE)染色,按照以下步驟操作,光學(xué)顯微鏡下觀察組織的病理學(xué)形態(tài)并記錄:

1.4 數(shù)據(jù)分析

每個試驗重復(fù)3次,取平均值。利用SPSS 26.0 統(tǒng)計分析軟件對試驗數(shù)據(jù)進行t檢驗、單因素方差分析和鄧肯多重比較,以P<0.05表示差異顯著,使用Origin 2021和GraphPad Prism 9軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 Se-GSP對D-半乳糖誘導(dǎo)氧化損傷小鼠體重、臟器指數(shù)影響

通過頸背部皮下注射和腹腔注射D-半乳糖是目前公認的構(gòu)建氧化應(yīng)激損傷模型的方法之一[10],半乳糖在醛糖還原酶的催化下,可還原為半乳糖醇,造成線粒體老化、自由基損傷、非酶糖基化反應(yīng)和免疫功能障礙等問題[11]。連續(xù)4周腹腔注射600 mg/(kg·bw)的D-半乳糖后,小鼠毛色變得沒有光澤,毛發(fā)易脫落,行動遲緩,消瘦,易倦怠,體重增加緩慢,出現(xiàn)明顯的衰老體征。小鼠的體重變化是反映機體生長發(fā)育的一個重要指標,試驗期間各組小鼠平均體重呈緩慢增加趨勢。圖2為建模期間和建模后小鼠體重變化,氧化損傷模型形成初期,各組小鼠體重基本一致,組間無顯著差異(P>0.05)。建模期間各組小鼠平均體重逐漸增加,最后模型組小鼠體重極顯著低于正常對照組小鼠(P<0.01),表明建模成功。通過灌胃5周的受試物,導(dǎo)致小鼠體重增加。其中空白對照組、模型對照組以及陽性對照組小鼠體重增量分別為(17.28±1.72) g,(10.5±0.83) g和(15.48±2.14) g?？瞻讓φ战M和陽性對照組小鼠體重增量顯著高于模型對照組(P<0.05)。但Se-GSP-L組、Se-GSP-H組和亞硒酸鈉組小鼠的體重增量與模型對照組無顯著差異(P>0.05)。陽性對照組、Se-GSP-L和Se-GSP-H組小鼠體重分別為(43.86±3.73) g、(42.7±4.11) g和(42.86±6.14) g,與模型組小鼠體重(40.62±2.29) g相比顯著增加(P<0.05)。GSP-L和GSP-H組小鼠體重與模型組相比顯著增加(P<0.05)。灌胃亞硒酸鈉小鼠體重為(41.57±0.35) g與模型組小鼠體重?zé)o明顯差異(P>0.05),說明灌胃GSP、Se-GSP可以提高氧化應(yīng)激損傷小鼠的體重,低劑量的GSP、Se-GSP具有促進衰老小鼠恢復(fù)生長的作用。關(guān)百婷等[9]

A-體重變化;B-體重增量圖2 不同受試物對小鼠的影響Fig.2 Effect of different subjects of mice注:同一指標上標注字母不同表示差異顯著(P<0.05),下同。

報道的灌胃大鯢活性肽能顯著增加D-半乳糖衰老小鼠體重,大鯢活性肽的低、中、高劑量組小鼠體重均高于模型組,并十分接近正常對照組小鼠的體重。

臟器指數(shù)可以間接揭示動物體內(nèi)因氧化作用而導(dǎo)致的損傷程度,脾臟和胸腺在機體中有著重要的免疫功能,其體積的減小可表明機體存在一定程度上的衰老[12]。各組SPF級雄性昆明小鼠灌胃相應(yīng)受試物5周后,其臟器指數(shù)變化如圖3所示。正常對照組的心臟指數(shù)、肝臟指數(shù)、腎臟指數(shù)、脾臟指數(shù)以及胸腺指數(shù)分別為(8.89±4.14)%、(41.30±6.93)%、(17.68±7.29)%、(5.12±0.96)%、(2.51±0.39)%。模型對照組的心臟指數(shù)、肝臟指數(shù)、腎臟指數(shù)、脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)分別為(6.50±1.59)%、(49.47±8.44)%、(16.04±1.41)%、(3.52±0.43)%和(1.92±0.23)%。陽性對照組的心臟指數(shù)、肝臟指數(shù)、腎臟指數(shù)、脾臟指數(shù)以及胸腺指數(shù)分別為(8.44±1.50)%、(43.27±5.05)%、(18.05±2.98)%、(5.04±1.43)%和(2.20±0.73)%。正常對照組的各臟器指數(shù)與模型對照組的臟器指數(shù)均具有顯著性差異(P<0.05),表明小鼠氧化應(yīng)激損傷模型建立成功。陽性對照組所有臟器指數(shù)均與空白對照組無顯著差異(P>0.05)。亞硒酸鈉組小鼠的臟器指數(shù)除心臟指數(shù)外,其他臟器顯著高于模型組(P<0.05)(圖3)。GSP-L組、GSP-H組、Se-GSP-L組和Se-GSP-H組小鼠的心臟、肝臟、腎臟、脾臟和胸腺指數(shù)介于模型對照組與空白對照組之間。以上結(jié)果表明,GSP和Se-GSP均可在一定程度上減輕器官的萎縮,這與關(guān)百婷等[9]研究結(jié)果相符。

圖3 不同劑量組對小鼠器官指數(shù)的影響Fig.3 Effects of different dose groups on mouse organ index

2.2 Se-GSP對D-半乳糖誘導(dǎo)氧化損傷小鼠血清中抗氧化指標的影響

當D-半乳糖濃度過高時,在半乳糖氧化酶的作用下,D-半乳糖會轉(zhuǎn)變?yōu)槿┨?、氫過氧化物,進而生成超氧陰離子自由基和氧衍生自由基[13]。另一方面,D-半乳糖與游離氨基酸發(fā)生反應(yīng)形成糖基化終產(chǎn)物,促進活性氧的產(chǎn)生,降低線粒體呼吸鏈復(fù)合物的活性并引起氧化應(yīng)激損傷[14]。大量研究表明,抗氧化活性在機體衰老過程中有著至關(guān)重要的作用,機體內(nèi)存在清除自由基的防御系統(tǒng),其中包括SOD、GSH-Px等抗氧化酶系[15]。T-AOC代表機體內(nèi)酶類抗氧化物質(zhì)、非酶類抗氧化物質(zhì)的綜合[16],可反映出體系的各種抗氧化大分子、小分子和酶的總體水平。SOD是機體內(nèi)一種有重要作用的抗氧化酶,能夠有效清除超氧陰離子自由基并將其歧化為水和氧氣,降低MDA和自由基代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生[17]。GSH是機體內(nèi)重要的非酶抗氧化物質(zhì),具有清除超氧陰離子自由基和過氧化氫、維持脫氧核糖核苷酸的生物合成以及維持細胞的正常發(fā)育等生理功能[18]。GSH-Px能特異地催化GSH還原過氧化物的還原反應(yīng),可阻斷過氧化物引發(fā)的自由基對機體的損害[15]。MDA是機體內(nèi)自由基產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物,常被作為評價衰老的指標之一[19],其含量隨著衰老而增加[20]。蛋白質(zhì)的氧化損傷程度可由蛋白質(zhì)羰基含量來表達,過氧化氫和超氧陰離子自由基對蛋白質(zhì)氨基酸側(cè)鏈的氧化可進一步導(dǎo)致羰基產(chǎn)物的累積,其含量隨著年齡的增長而增加。

不同受試物對小鼠血清中SOD活力、GSH-Px活力、T-AOC含量、GSH含量、MDA含量和蛋白質(zhì)羰基含量的影響見表1。

表1 GSP和Se-GSP對小鼠血清中抗氧化指標的影響Table 1 Effects of GSP and Se-GSP on antioxidant indexes in mouse serum

由表1可知,與正常對照組相比,模型對照組血清中SOD活力、GSH-Px活力、GSH含量和T-AOC含量顯著降低(P<0.05),而MDA和蛋白質(zhì)羰基含量顯著升高(P<0.05),說明建模成功。正常對照組小鼠血清中T-AOC和MDA含量與陽性對照組無顯著差異(P>0.05),SOD活力、GSH-Px活力、GSH含量和蛋白質(zhì)羰基含量與陽性對照組有顯著差異(P<0.05)。與模型對照組相比,GSP-L小鼠血清中的T-AOC含量、SOD活力、GSH含量、GSH-Px活力以及MDA、蛋白質(zhì)羰基含量均有顯著差異(P<0.05)。與模型組相比,Se-GSP-L組小鼠血清中的SOD、GSH-Px活力和GSH、T-AOC含量顯著升高(P<0.05),MDA、蛋白質(zhì)羰基含量均顯著降低(P<0.05),隨著劑量的增加,各指標與模型對照組差異逐漸增大。與陽性對照組相比,Se-GSP-H組小鼠血清中SOD活力、GSH-Px活力、GSH含量、T-AOC含量及MDA、蛋白質(zhì)羰基含量與模型相比均有顯著差異(P<0.05)。Se-GSP-H組小鼠中T-AOC含量、SOD活力和GSH-Px活力較模型對照組分別提高了77.33%、41.35%和59.78%;MDA和蛋白質(zhì)羰基含量較模型對照組分別降低了30.64%和63.72%。灌胃亞硒酸鈉的小鼠血清中T-AOC含量、SOD活力、GSH含量、GSH-Px活力及MDA、蛋白質(zhì)羰基含量與模型相比均有顯著差異(P<0.05)。說明低、高劑量的GSP、Se-GSP均可以提高體內(nèi)抗氧化酶類和非酶類的活性。關(guān)百婷等[9]采用D-半乳糖構(gòu)建衰老小鼠模型,與正常對照組相比,衰老模型小鼠血清中的MDA含量極顯著上升,SOD活力和T-AOC含量極顯著降低,灌胃大鯢活性肽后小鼠血清中MDA含量極顯著降低,SOD活力和T-AOC含量顯著升高。蔡佳佳等[21]用大鯢肉喂養(yǎng)D-半乳糖誘發(fā)亞急性衰老小鼠8周,與模型組相比,大鯢肉各劑量組小鼠血清SOD活性升高,MDA含量減少。翟興月等[22]采用鱘魚肽灌胃衰老模型小鼠,灌胃鱘魚肽的低、中、高劑量組均能極顯著降低血清中MDA含量,極顯著升高了小鼠血清中T-AOC含量和SOD活性,這些結(jié)論與本試驗結(jié)論一致。

2.3 Se-GSP對D-半乳糖誘導(dǎo)氧化損傷小鼠肝臟中抗氧化指標的影響

按照“1.3.3節(jié)”組織勻漿的制備方法,進行肝組織勻漿的制備,按照SOD活力、GSH-Px活力、GSH含量、T-AOC含量、MDA含量和蛋白質(zhì)羰基含量的檢測方法對肝組織勻漿中的相關(guān)指標進行檢測,結(jié)果如表2 所示。肝臟在機體內(nèi)具有解毒、代謝等功能。研究表明,D-半乳糖能夠?qū)е赂闻K的損傷[23]。由表2可知,與正常對照組相比,腹腔注射D-半乳糖的模型對照組肝臟的SOD活力、GSH含量、GSH-Px活力和T-AOC含量顯著下降(P<0.05),MDA和蛋白質(zhì)羰基含量顯著上升(P<0.05)。陽性對照組與正常對照組相比,SOD活力、GSH-Px活力、T-AOC含量、MDA和蛋白質(zhì)羰基含量有顯著差異(P<0.05),而GSH含量無顯著差異(P>0.05)。GSP-L組小鼠肝臟中的SOD活力、GSH含量、GSH-Px活力、T-AOC含量顯著增加(P<0.05),MDA、蛋白質(zhì)羰基含量顯著下降(P<0.05),并隨著GSP劑量的增加差異逐漸增大。Se-GSP-L組小鼠肝臟中的SOD活力、GSH含量、GSH-Px活力、T-AOC含量顯著增加(P<0.05),MDA、蛋白質(zhì)羰基含量顯著下降(P<0.05),隨著劑量的增加差異逐漸增大。灌胃低、高劑量的GSP組的SOD活力、GSH含量、GSH-Px活力、T-AOC含量分別顯著低于灌胃低、高劑量的Se-GSP組(P<0.05),MDA和蛋白質(zhì)羰基含量分別顯著高于灌胃低、高劑量Se-GSP組(P<0.05)。Se-GSP-H組小鼠肝臟中MDA和蛋白質(zhì)羰基含量較模型對照組分別降低了70.59%和71.63%。灌胃亞硒酸鈉的小鼠肝臟中各指標居于GSP-L組和Se-GSP-L組之間。張昱等[24]用藍點馬鮫魚皮抗氧化肽Fraction Ⅱ 灌胃D-半乳糖誘導(dǎo)氧化損傷大鼠,各劑量組的Fraction Ⅱ 能顯著提高肝臟組織的SOD、GSH-Px活性和T-AOC能力,降低MDA含量,與本試驗結(jié)果一致。

表2 GSP和Se-GSP對小鼠肝臟中抗氧化指標的影響Table 2 Effect of GSP and Se-GSP on antioxidant indexes in mouse liver

2.4 Se-GSP對D-半乳糖誘導(dǎo)氧化損傷小鼠心臟中抗氧化指標的影響

按照“1.3.4節(jié)”組織勻漿的制備方法,進行心臟組織勻漿的制備,按照SOD活力、GSH-Px活力、T-AOC含量、GSH含量、MDA含量和蛋白質(zhì)羰基含量的檢測方法對心臟組織勻漿中的相關(guān)指標進行檢測,結(jié)果如表3所示。

表3 GSP和Se-GSP對小鼠心臟中抗氧化指標的影響Table 3 Effects of GSP and Se-GSP on antioxidant indexes in mouse heart

與正常對照組相比,腹腔注射D-半乳糖的模型對照組心臟的SOD活力、GSH含量、GSH-Px活力和T-AOC含量顯著下降(P<0.05),MDA、蛋白質(zhì)羰基含量顯著上升(P<0.05),說明建模成功。陽性對照組與正常對照組相比,SOD活力、GSH含量、GSH-Px活力、T-AOC、MDA和蛋白質(zhì)羰基含量有顯著差異(P<0.05)。灌胃亞硒酸鈉小鼠的心臟中T-AOC含量、SOD活力、GSH含量、GSH-Px活力與MDA含量與Se-GSP-L組無顯著差異(P<0.05)。Se-GSP-H組的各項指標均與正常對照組有顯著差異(P<0.05),表明高劑量Se-GSP的效果不如陽性對照藥物L(fēng)-抗壞血酸。與模型對照組相比,灌胃GSP后,心臟中的SOD活力、GSH含量、GSH-Px活力、T-AOC含量顯著增加(P<0.05),MDA、蛋白質(zhì)羰基含量顯著下降(P<0.05),并隨著劑量的增加差異逐漸增大,表明GSP可提高衰老小鼠心臟組織的SOD、GSH、GSH-Px活力,且對D-半乳糖誘導(dǎo)的小鼠心臟的脂質(zhì)過氧化有較好的抑制作用。與模型對照組相比,灌胃Se-GSP后,心臟中的SOD活力、GSH含量、GSH-Px活力、T-AOC含量顯著增加(P<0.05),MDA和蛋白質(zhì)羰基含量顯著下降(P<0.05),并隨著劑量的增加差異逐漸增大,其中Se-GSP-H組小鼠心臟中T-AOC含量較模型對照組小鼠增加了79.22%,MDA和蛋白質(zhì)羰基含量較模型對照組降低了47.56%和53.48%。表明Se-GSP可提高衰老小鼠心臟組織的SOD活力、GSH含量、GSH-Px活力,且對D-半乳糖誘導(dǎo)的小鼠心臟的脂質(zhì)過氧化有較好的抑制作用。且Se-GSP-H組小鼠心臟中各指標均與GSP-H組具有顯著差異性(P<0.05)。

2.5 Se-GSP對D-半乳糖誘導(dǎo)氧化損傷小鼠腦中抗氧化指標的影響

按照“1.3.4節(jié)”組織勻漿的制備方法,進行腦組織勻漿的制備,按照SOD活力、GSH-Px活力、T-AOC含量、GSH含量、MDA含量和蛋白質(zhì)羰基含量的檢測方法對腦組織勻漿中的相關(guān)指標進行檢測,結(jié)果如表4所示。腦是機體中結(jié)構(gòu)最復(fù)雜、功能完備、且能調(diào)節(jié)人體生理活動的器官[25],氧化應(yīng)激會誘導(dǎo)急性腦卒中、腦缺血和衰老等疾病的發(fā)生,腦組織若長期受到損傷,會造成不可逆轉(zhuǎn)的后果。因此,抑制并修復(fù)腦組織的氧化損傷十分重要。D-半乳糖能夠加速大腦組織衰老。與正常對照組比較,其余7組小鼠腦組織的SOD活力、GSH含量、GSH-Px活力和T-AOC顯著降低(P<0.05),MDA和蛋白質(zhì)羰基含量顯著增加(P<0.05)。與模型對照組比較,亞硒酸鈉組和GSP、Se-GSP的低、高劑量組小鼠腦組織中的SOD活力、GSH含量、GSH-Px活力和T-AOC都升高,MDA和蛋白質(zhì)羰基含量降低,且亞硒酸鈉組、GSP-L、GSP-H、Se-GSP-L和Se-GSP-H組的各指標與模型對照組有顯著性差異(P<0.05)。陽性對照組與正常對照組相比,除T-AOC含量無顯著差異(P>0.05)之外,其余各指標均與正常對照組有顯著性差異(P<0.05),表明D-半乳糖對小鼠大腦的損傷在抗壞血酸的作用下不可逆轉(zhuǎn)。Se-GSP-L組和Se-GSP-H組的各項指標均呈現(xiàn)顯著性差異(P<0.05),其中Se-GSP-L組小鼠的腦組織中的SOD、GSH、GSH-Px活力和T-AOC含量較Se-GSP-H組顯著下降(P<0.05),MDA含量、蛋白質(zhì)羰基含量較Se-GSP-H組顯著上升(P<0.05)。Se-GSP-H組小鼠腦中T-AOC含量較模型對照組小鼠增加了80.00%,MDA和蛋白質(zhì)羰基含量較模型對照組降低了62.47%和52.68%。表明Se-GSP和GSP均能提高D-半乳糖誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷小鼠腦組織中的SOD活力、GSH含量、GSH-Px活力和T-AOC含量,同時能夠降低腦組織中的MDA和蛋白質(zhì)羰基含量。

表4 GSP和Se-GSP對小鼠腦中抗氧化指標的影響Table 4 Effects of GSP and Se-GSP on antioxidant indexes in mouse brain

2.6 Se-GSP對D-半乳糖誘導(dǎo)氧化損傷小鼠肝、腦組織的影響

HE染色是觀察形態(tài)最常用的染色方法之一[26],本研究利用HE染色對組織病理學(xué)觀察,進一步確認Se-GSP和GSP對D-半乳糖誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷小鼠的保護作用。D-半乳糖可致氧化應(yīng)激損傷模型小鼠中央靜脈結(jié)構(gòu)紊亂,肝細胞排列雜亂,肝索和肝竇排列不規(guī)則,胞質(zhì)疏松、腫脹[27]。肝臟的HE染色結(jié)果如圖4所示,正常對照組小鼠的肝小葉完整,肝細胞群排列在中央靜脈周圍,肝細胞結(jié)構(gòu)清晰完整、細胞核正常,無明顯病理變化。模型對照組小鼠肝細胞排列雜亂、胞漿內(nèi)出現(xiàn)大量脂肪樣變性空泡,肝血竇擴張明顯。陽性對照組小鼠的肝細胞排列有序,其形態(tài)發(fā)生了略微的變化,胞內(nèi)脂肪樣變性空泡減少,肝損傷減輕。低劑量Se-GSP對氧化應(yīng)激小鼠肝臟的修復(fù)能力弱于高劑量Se-GSP。GSP-L組小鼠肝細胞內(nèi)仍有脂肪樣空泡,肝索呈放射狀排列。亞硒酸鈉組部分肝細胞體積增大,肝索排列紊亂。高劑量Se-GSP能改善氧化應(yīng)激小鼠肝細胞形態(tài),減少中性脂肪聚集,修復(fù)部分肝臟損傷。由此可見,高劑量的Se-GSP和GSP可緩解肝細胞的破壞,維護組織功能正常,進一步延緩衰老。

圖4 小鼠肝臟組織病理切片圖(×200)Fig.4 Mouse liver histopathological section(×200)

大腦的耗氧量較大,由此導(dǎo)致的自由基蓄積損傷尤為明顯。隨著年齡的增加,機體的老化狀態(tài)也越發(fā)嚴重,大腦各部位的神經(jīng)元細胞都在減少。其中最主要的病理改變發(fā)生在大腦皮質(zhì)和海馬區(qū)[28]。GSP、Se-GSP對半乳糖誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷模型小鼠腦組織的影響如圖5所示,腦組織經(jīng)HE染色后,神經(jīng)細胞胞漿表現(xiàn)為紫紅色,細胞核呈紫藍色?？瞻讓φ战M小鼠的腦組織整體結(jié)構(gòu)正常,腦組織海馬區(qū)的神經(jīng)元細胞排列有序,細胞核和胞漿清晰可見。模型對照組小鼠的腦組織整體結(jié)構(gòu)異常,組織海馬區(qū)神經(jīng)元排列紊亂,數(shù)量減少,可見大量神經(jīng)元明顯固縮深染壞死,組織間質(zhì)未見血管明顯地充血擴張,組織未見明顯的炎癥細胞浸潤。GSP-H組和Se-GSP-H組仍有不同程度的神經(jīng)元細胞變性,但是變性細胞顯著減少,表明高劑量GSP和Se-GSP可改善D-半乳糖誘導(dǎo)的腦組織病理變化。

圖5 小鼠腦組織病理切片圖(×200)Fig.5 Mouse brain histopathological section(×200)

3 結(jié)論

采用D-半乳糖誘導(dǎo)建立氧化應(yīng)激損傷小鼠模型,通過大鯢肽和大鯢肽硒螯合物干預(yù)后均顯示出了較好的拮抗肝臟、脾臟和胸腺萎縮的作用,能顯著提高小鼠血清、肝臟、心臟、腦組織中T-AOC含量、SOD活力、GSH含量和GSH-Px活力(P<0.05),同時降低MDA和蛋白質(zhì)羰基含量(P<0.05)。組織病理學(xué)切片結(jié)果顯示,大鯢肽和大鯢肽硒螯合物對氧化應(yīng)激損傷小鼠肝臟和腦具有較好的保護作用。與大鯢肽相比,大鯢肽硒螯合物對D-半乳糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷小鼠的保護和修復(fù)作用更強,顯示出更好的體內(nèi)抗氧化活性。今后還需要進一步對其進行安全性評價、胃腸道消化穩(wěn)定性以及免疫調(diào)節(jié)功能進行探究,以期為大鯢肽硒螯合物相關(guān)衍生產(chǎn)品研發(fā)提供參考數(shù)據(jù)。