王秋蓮 吳著明 葉鵬飛

(大冶市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,湖北 大冶 435100)

缺血性腦卒中是常發(fā)生于中老年人群中的一種腦血管疾病,目前臨床常采用溶栓治療等方法,而血管再通是最有效的方法,但血液供應(yīng)后氧自由基可造成細(xì)胞再灌注損傷,進(jìn)而造成腦組織損傷,同時(shí)缺氧條件下腦血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷可進(jìn)一步損害神經(jīng)功能,因而如何減輕腦血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷對(duì)改善缺血性腦卒中等腦血管疾病患者的預(yù)后具有重要意義〔1～3〕。環(huán)狀RNA(circRNA)在腦血管疾病中表達(dá)異常,并可參與腦血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷過(guò)程〔4〕。但circRNA在糖氧剝奪(OGD)誘導(dǎo)的人腦血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷中的作用機(jī)制尚未闡明。circZNF652在脂多糖誘導(dǎo)的肺炎中表達(dá)水平升高,抑制其表達(dá)可通過(guò)調(diào)節(jié)miR-181a減輕脂多糖誘導(dǎo)的炎癥損傷〔5〕。生物信息學(xué)分析顯示circZNF652與miR-17-5p存在結(jié)合位點(diǎn),研究發(fā)現(xiàn),miR-17-5p在缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)明顯下調(diào),miR-17-5p過(guò)表達(dá)可通過(guò)靶向磷酸酶與張力蛋白同源物(PTEN)而減輕細(xì)胞氧化損傷〔6〕。但circZNF652是否通過(guò)靶向調(diào)控miR-17-5p影響人腦血管內(nèi)皮細(xì)胞(HBVEC)損傷尚不十分清楚。因此,本研究采用OGD誘導(dǎo)的HBVEC建立細(xì)胞損傷模型,探討circZNF652/miR-17-5p分子軸對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡及氧化應(yīng)激的影響。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 HBVEC購(gòu)自美國(guó)ATCC;Lipofectamine2000購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher;乳酸脫氫酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所;CCK-8試劑、凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶;實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)系列試劑盒購(gòu)自北京天根生化;si-circZNF652、miR-17-5p mimics、anti-miR-17-5p及其陰性對(duì)照物購(gòu)自廣州銳博生物;兔抗人蛋白水解酶(CHOP)單克隆抗體、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-12多克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔二抗購(gòu)自英國(guó)Abcam。

1.2實(shí)驗(yàn)分組 HBVEC培養(yǎng)在DMEM完全培養(yǎng)液中,于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng),每2～3 d傳代1次。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HBVEC接種于6孔板(1×104個(gè)/孔),24 h后棄舊培養(yǎng)基,磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌,更換為無(wú)糖DMEM培養(yǎng)基,于95%N2、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6 h,構(gòu)建細(xì)胞OGD損傷模型〔7〕,記為OGD組。在制備OGD損傷模型時(shí)同步更換為無(wú)血清的培養(yǎng)基處理HBVEC,于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),記為Con組。無(wú)血清培養(yǎng)基分別稀釋si-NC、si-circZNF652、miR-NC、miR-17-5p mimics、si-circZNF652與anti-miR-NC(共轉(zhuǎn)染)、si-circZNF652與anti-miR-17-5p(共轉(zhuǎn)染)后室溫孵育5 min,同時(shí)用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋Lipofectamine2000,分別將脂質(zhì)體稀釋液與基因稀釋液共同加入HBVEC培養(yǎng)24 h后進(jìn)行OGD處理,分別記為OGD+si-NC組、OGD+si-circZNF652組、OGD+miR-NC組、OGD+miR-17-5p組、OGD+si-circZNF652+anti-miR-NC組、OGD+si-circZNF652+anti-miR-17-5p組。

1.3qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中circZNF652與miR-17-5p表達(dá)水平 用RNA提取試劑盒提取HBVEC總RNA,按照試劑盒說(shuō)明書加入細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞后提取RNA,檢測(cè)RNA濃度后將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,然后通過(guò)PCR儀檢測(cè)目的基因表達(dá)情況,2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

1.4檢測(cè)氧化應(yīng)激指標(biāo)LDH、SOD、MDA水平 采集細(xì)胞上清液,根據(jù)LDH試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)LDH水平。取各組HBVEC,棄培養(yǎng)基,PBS洗滌,用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞,檢測(cè)細(xì)胞MDA水平與SOD活性,操作步驟按照試劑盒說(shuō)明書。

1.5CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖 各組HBVEC以2×103個(gè)/孔接種于96孔板,培養(yǎng)24 h后,每孔分別加入10 μl CCK-8溶液于37 ℃條件下孵育2 h,檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm處OD值并計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況 HBVEC以1×104個(gè)/孔接種于6孔板中,繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,用胰蛋白酶消化后收集細(xì)胞,按照凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書操作,分別加入200 μl結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞,再分別加入5 μl膜聯(lián)蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素(Annexin Ⅴ-FITC)和碘化丙啶(PI),室溫避光孵育20 min,快速使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.7雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)circZNF652與miR-17-5p的靶向關(guān)系 攜帶circZNF652與miR-17-5p結(jié)合位點(diǎn)序列克隆至pMIR-REPORT熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒中,即合成野生型載體WT-circZNF652,用Quickchange XL位點(diǎn)定向誘變?cè)噭┖袠?gòu)建突變體報(bào)告基因(MUT-circZNF652),HBVEC接種于96孔板(2×103個(gè)/孔),分別將miR-17-5p mimics、miR-NC質(zhì)粒與WT-circZNF652或MUT-circZNF652共轉(zhuǎn)染,48 h后收集細(xì)胞并檢測(cè)細(xì)胞熒光素酶活性。

1.8Western印跡檢測(cè)CHOP、Caspase-12蛋白表達(dá) 預(yù)冷RIPA裂解液用于提取各組HBVEC蛋白100 ℃條件下煮沸變性,10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進(jìn)行電泳分離蛋白,并進(jìn)行轉(zhuǎn)膜、封閉,在4 ℃條件下與CHOP(1∶1 000)、Caspase-12(1∶1 000)及內(nèi)參GAPDH(1∶1 000)一抗共同孵育過(guò)夜,然后在室溫條件下與二抗(1∶2 000)共同孵育1 h,用ImageJ軟件分析蛋白條帶。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1OGD誘導(dǎo)的HBVEC中circZNF652與miR-17-5p表達(dá)量比較 OGD組circZNF652水平(2.59±0.40)明顯高于Con組(1.00±0.05;t=11.833,P<0.001),miR-17-5p水平(0.32±0.06)明顯低于Con組(1.00±0.07;t=22.127,P<0.001)。

2.2干擾circZNF652對(duì)OGD誘導(dǎo)的HBVEC氧化應(yīng)激、增殖及凋亡的影響 OGD組細(xì)胞LDH、MDA水平、凋亡率、CHOP、Caspase-12蛋白水平均明顯高于Con組,SOD活性和存活率明顯低于Con組;OGD+si-circZNF652組miR-17-5p水平、SOD活性、存活率明顯高于OGD+si-NC組,LDH和MDA水平、凋亡率、CHOP、Caspase-12蛋白水平明顯低于OGD+si-NC組(均P<0.05),見(jiàn)表1、圖1、圖2。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率

1～8：Con組、OGD組、OGD+si-NC組、OGD+si-circZNF652組、OGD+miR-NC組、OGD+miR-17-5p組、OGD+si-circZNF652+anti-miR-NC組、OGD+si-circZNF652+anti-miR-17-5p組圖2 Western印跡檢測(cè)各組CHOP、Caspase-12蛋白表達(dá)

表1 干擾circZNF652對(duì)OGD誘導(dǎo)的HBVEC氧化應(yīng)激、增殖及凋亡的影響

2.3miR-17-5p過(guò)表達(dá)對(duì)OGD誘導(dǎo)的HBVEC氧化應(yīng)激、增殖及凋亡的影響 與OGD+miR-NC組比較,OGD+miR-17-5p組LDH、MDA、凋亡率及CHOP、Caspase-12蛋白水平明顯降低,SOD活性和細(xì)胞存活率明顯升高(均P<0.05),見(jiàn)圖1、圖2、表2。

表2 miR-17-5p過(guò)表達(dá)對(duì)OGD誘導(dǎo)的HBVEC氧化應(yīng)激、增殖及凋亡的影響

2.4抑制miR-17-5p表達(dá)可部分逆轉(zhuǎn)干擾circZNF652對(duì)OGD誘導(dǎo)的HBVEC氧化應(yīng)激、增殖及凋亡的作用 與OGD+si-circZNF652+anti-miR-NC組比較,OGD+si-circZNF652+anti-miR-17-5p組miR-17-5p表達(dá)水平、SOD活性、細(xì)胞存活率明顯降低,LDH、MDA水平、凋亡率及CHOP、Caspase-12蛋白水平明顯升高(均P<0.05),見(jiàn)圖1、圖2、表3。

表3 抑制miR-17-5p表達(dá)可部分逆轉(zhuǎn)干擾circZNF652對(duì)OGD誘導(dǎo)的HBVEC氧化應(yīng)激、增殖及凋亡的作用

2.5circZNF652靶向調(diào)控miR-17-5p circZNF652與miR-17-5p存在結(jié)合位點(diǎn),見(jiàn)圖3。轉(zhuǎn)染野生型載體WT-circZNF652細(xì)胞共轉(zhuǎn)染miR-17-5p mimics后熒光素酶活性(0.29±0.04)較共轉(zhuǎn)染miR-NC(1.01±0.04)明顯降低(t=38.184;P<0.001),而轉(zhuǎn)染突變型載體MUT-circZNF652細(xì)胞熒光素酶活性(1.01±0.04)較共轉(zhuǎn)染miR-NC(1.00±0.03)無(wú)明顯差異(t=0.600,P=0.557)。

圖3 circZNF652靶向結(jié)合miR-17-5p

3 討 論

circRNA具有普遍性、穩(wěn)定性與特異性等特點(diǎn),其基因序列上富含多個(gè)miRNA結(jié)合位點(diǎn),可通過(guò)吸附miRNA而調(diào)節(jié)靶mRNA轉(zhuǎn)錄后水平,進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)及發(fā)育等生物學(xué)過(guò)程,目前circRNA在腦血管疾病中表達(dá)異常,并可能參與其發(fā)生及發(fā)展過(guò)程,如circ_2858在腦膜炎中上調(diào),并可通過(guò)調(diào)控miR-93-5p而增加血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)A進(jìn)而破壞血腦屏障〔8,9〕。沉默circRNA細(xì)胞周期依賴激酶抑制劑2B基因的反義非編碼基因(ANRIL)通過(guò)充當(dāng)miR-622的海綿分子而減輕氧葡萄糖剝奪/復(fù)氧誘導(dǎo)的人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷〔10〕。

有報(bào)道指出,circZNF652在腎癌、肝癌等腫瘤細(xì)胞中上調(diào),并促進(jìn)細(xì)胞惡性生物學(xué)行為〔11,12〕。本研究結(jié)果提示,circZNF652高表達(dá)量可能促進(jìn)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷。本研究與季兆潔等〔13〕結(jié)果相似,提示成功建立HBVEC損傷模型。本研究結(jié)果提示,干擾circZNF652表達(dá)可抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)而減輕OGD誘導(dǎo)的HBVEC氧化損傷。當(dāng)大腦損傷時(shí)會(huì)誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)進(jìn)而促使神經(jīng)細(xì)胞凋亡,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是蛋白質(zhì)合成與分泌的重要場(chǎng)所,當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)氧化應(yīng)激反應(yīng)時(shí)可造成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)生理功能紊亂而引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,進(jìn)而激活細(xì)胞凋亡途徑最終促使細(xì)胞凋亡,CHOP是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)志性蛋白,其表達(dá)水平升高可激活細(xì)胞凋亡途徑,同時(shí)研究表明,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑與Caspase-12蛋白有關(guān)〔14,15〕。本研究結(jié)果提示,干擾circZNF652表達(dá)可通過(guò)抑制氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激而抑制細(xì)胞凋亡,并可促進(jìn)細(xì)胞增殖進(jìn)而保護(hù)OGD誘導(dǎo)的HBVEC損傷。本研究還提示,circZNF652可能通過(guò)調(diào)控miR-17-5p而損傷HBVEC。研究表明,LncRNA通過(guò)調(diào)節(jié)miR-17-5p/Toll樣受體(TLR)4促進(jìn)脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎性損傷〔16〕。抑制LncRNA肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本(MALAT)1通過(guò)靶向miR-17-5p/叉頭盒蛋白(FOX)A1軸可減輕脂多糖誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞損傷〔17〕。miR-17-5p過(guò)表達(dá)通過(guò)靶向E2F1而抑制細(xì)胞凋亡從而減輕高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷〔18〕。表明miR-17-5p高表達(dá)可能對(duì)細(xì)胞損傷發(fā)揮保護(hù)作用。本研究結(jié)果提示,circZNF652可靶向調(diào)控miR-17-5p而造成OGD誘導(dǎo)的HBVEC損傷。

綜上,OGD誘導(dǎo)的HBVEC中circZNF652表達(dá)水平升高,miR-17-5p表達(dá)水平降低,干擾circZNF652表達(dá)可促進(jìn)miR-17-5p表達(dá),二者之間存在靶向調(diào)控關(guān)系,干擾circZNF652表達(dá)可通過(guò)上調(diào)miR-17-5p促進(jìn)細(xì)胞增殖,并抑制氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、凋亡進(jìn)而減輕OGD誘導(dǎo)的HBVEC損傷,但其具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。