陳愛方 田霞 韓崢 朱慶曦 劉蒙 譚潔

(武漢市第三醫(yī)院消化內(nèi)科,湖北 武漢 430060)

肝纖維化是一個病理生理過程,其主要特征表現(xiàn)為細胞外基質(zhì)(ECM)過度沉積和肝臟小葉結(jié)構(gòu)紊亂,長期持續(xù)的肝纖維化可發(fā)展為肝硬化和肝癌〔1〕。肝星狀細胞(HSC)作為肝纖維化的主要細胞,其被激活后產(chǎn)生大量 ECM,在肝纖維化的進展過程中發(fā)揮著重要作用〔2,3〕。因此,抑制HSC活化成為抗纖維化治療的有吸引力的策略。MicroRNAs(miRNAs)是含有20～25個核苷酸的小RNA,其可以與 mRNA 的 3′-非翻譯區(qū) (UTR) 結(jié)合,參與轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控〔4〕。證據(jù)表明miRNA的失調(diào)參與了HSC活化及肝纖維化過程〔5〕。miR-27b-3p被認為是一種抗纖維化的 miRNA,已有研究報道過表達miR-27b-3p 通過抑制信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄激活蛋白(STAT)1抑制腎纖維化的進展〔6〕。但miR-27b-3p對HSC活化的影響未見報道。本研究通過生物信息學預測發(fā)現(xiàn)Wnt3a為miR-27b-3p的靶基因,但miR-27b-3p能否靶向Wnt3a調(diào)控HSC活化尚不明確,因此,本研究主要探究miR-27b-3p對HSC活化的影響及其相關(guān)作用機制。

1 材料與方法

1.1細胞來源 人HSC LX-2購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2主要試劑與儀器 miR-27b-3p模擬物(miR-27b-3p mimics)及其陰性對照(mimics NC)、Wnt3a過表達質(zhì)粒(pcDNA3.1-Wnt3a)及其陰性對照(pcDNA3.1)、Wnt3a小干擾RNA(si-Wnt3a)及其陰性對照(si-NC)均購自上海美軒生物科技有限公司;轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1購自廣州源生醫(yī)藥科技有限公司;胎牛血清(FBS)、杜爾伯科改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)、二喹啉甲酸(BCA)試劑盒、電化學發(fā)光(ECL)試劑盒、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒均購自上海碧云天生物有限公司;miRNA cDNA Synthesis Kit購自寶生物工程(大連)有限公司 ;miRNA熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)檢測試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司;LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒購自上海恒斐生物科技有限公司;α-平滑肌肌動蛋白(SMA)抗體購自Cell Signaling Technology公司;Wnt3a、β-catenin、c-myc、磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)兔多克隆抗體及辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔二抗均購自索萊寶生物科技有限公司;膠原蛋白(Collagen)Ⅰ、Collagen Ⅲ、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP)-1、細胞周期素(Cyclin)D1兔多克隆抗體均購自美國Abcam公司;熒光定量PCR儀購自上海蘊策生物科技有限公司;CO2培養(yǎng)箱購自北京宏達恒業(yè)科技有限公司。

1.3細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 使用含有10%FBS、100 U/ml鏈霉素和100 U/ml青霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)LX-2細胞,培養(yǎng)條件為：37 ℃、5%CO2。取生長良好的LX-2細胞,利用10 ng/ml TGF-β1〔7〕處理24 h以誘導活化,并命名為LX-2-A細胞。利用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒對LX-2-A細胞進行轉(zhuǎn)染,并分為7組：空白組(正常培養(yǎng)的LX-2-A細胞)、mimics NC組(轉(zhuǎn)染mimics NC)、miR-27b-3p mimics組(轉(zhuǎn)染miR-27b-3p mimics)、si-NC組(轉(zhuǎn)染si-NC)、si-Wnt3a組(si-Wnt3a)、miR-27b-3p mimics+pcDNA3.1組(共轉(zhuǎn)染miR-27b-3p mimics和pcDNA3.1)、miR-27b-3p mimics+Wnt3a組(共轉(zhuǎn)染miR-27b-3p mimics和pcDNA3.1-Wnt3a),在37 ℃、含有 5%CO2的培養(yǎng)箱中進行轉(zhuǎn)染。

1.4qRT-PCR檢測細胞中miR-27b-3p表達 使用Trizol試劑提取總RNA,并使用Nanodrop2000測量總RNA濃度。使用miRNA cDNA Synthesis Kit將500 ng RNA逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA,然后利用miRNA熒光定量PCR檢測試劑盒進行擴增反應,以U6為內(nèi)參,通過2-ΔΔCt法計算miR-27b-3p的相對表達水平。引物序列為：U6正向引物：5′-GCACCTTAGGCTGAACA-3,反向：5′-AGCTTATGCCGAGCTCTTGT-3′;miR-27b-3p正向引物：5′-CTC-TCTAACAAGGTGCAGAG-CT-3′,反向：5′-TTCTCTTCAGGTGCAGAACTTAG-3′。

1.5細胞對數(shù)試劑盒(CCK)-8法檢測細胞增殖 收集各組細胞懸液,以2×104個/孔的密度加入 96 孔板中,分別在細胞轉(zhuǎn)染的0、24、48 h向每孔加入10 μl CCK-8溶液,37 ℃孵育2 h,利用酶標儀檢測450 nm處吸光度(OD)值。

1.6免疫熒光染色法觀察細胞中α-SMA表達 將各組細胞以2×104個/孔的密度接種到Millicell EZ SLIDE培養(yǎng)板中,孵育24 h后,用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次,每次3 min;用4%多聚甲醛溶液固定10 min,用PBS洗滌3次,每次3 min,然后用0.5% Triton X-100冰上處理20 min;PBS洗3次,每次3 min,用3%牛血清白蛋白(BSA)在室溫下封閉1 h;加入一抗α-SMA(1∶500)在4 ℃下孵育過夜。 第二天,加入熒光二抗并在37 ℃下孵育1 h。用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)復染5 min,再用 PBS洗3次,每次3 min。 每孔隨機選取3個視野利用熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.7Western印跡檢測蛋白表達 將各組細胞在RIPA緩沖液中裂解以提取細胞總蛋白。使用BCA試劑盒測量細胞裂解物中的蛋白質(zhì)濃度。使用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離50 μg蛋白質(zhì)。將分離的等量蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。將膜在5%脫脂奶粉中室溫封閉1 h。然后加入一抗Wnt3a(1∶1 000)、Collagen Ⅰ(1∶2 000)、Collagen Ⅲ(1∶1 000)、TIMP-1(1∶1 000)、β-連環(huán)蛋白(catenin,1∶2 000)、c-myc(1∶2 000)、細胞周期素(Cyclin)D1(1∶1 000)、GAPDH(1∶1 000)在4 ℃下孵育過夜,次日,用Tris鹽酸緩沖液吐溫(TBST)洗滌3次后,加入HRP標記的羊抗兔二抗(1∶500)在室溫下孵育1 h。使用ECL溶液觀察蛋白質(zhì)條帶,使用Image J 軟件分析蛋白質(zhì)條帶的灰度值。

1.8雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?分別構(gòu)建Wnt3a野生型和突變型 3′-UTR 區(qū)質(zhì)粒,并命名為WT-Wnt3a、MUT-Wnt3a。嚴格按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒操作說明書將WT-Wnt3a和MUT-Wnt3a 分別與mimics NC或miR-27b-3p mimics共轉(zhuǎn)染到 LX-2 細胞中。轉(zhuǎn)染48 h后,采用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)評估熒光素酶活性。

1.9統(tǒng)計學分析 采用SPSS25.0軟件和GraphPad Prism進行統(tǒng)計分析,單因素方差分析用于多組間比較,進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1miR-27b-3p在LX-2及LX-2-A細胞中的表達 與LX-2細胞比較,LX-2-A細胞綠色熒光強度顯著升高,表示α-SMA蛋白表達水平升高,提示TGF-β1誘導LX-2細胞活化成功,見圖1,與LX-2細胞(1.00±0.00)比較,LX-2-A細胞中miR-27b-3p表達水平(0.32±0.02)顯著降低(P<0.05)。

圖1 免疫熒光法觀察細胞中α-SMA表達(×1000)

2.2各組LX-2-A細胞中miR-27b-3p及Wnt3a蛋白表達 與空白組、mimics NC組比較,miR-27b-3p mimics組miR-27b-3p表達水平顯著升高,Wnt3a蛋白表達水平顯著降低(P<0.05);與空白組、si-NC組比較,si-Wnt3a組miR-27b-3p表達水平無顯著變化(P>0.05),Wnt3a蛋白表達水平顯著降低(P<0.05);與miR-27b-3p mimics組、miR-27b-3p mimics+pcDNA3.1組比較,miR-27b-3p mimics+Wnt3a組miR-27b-3p表達水平無顯著變化(P>0.05),Wnt3a蛋白表達水平顯著升高(P<0.05),見圖2和表1。

表1 各組LX-2-A細胞增殖能力及miR-27b-3p、Wnt3a蛋白表達

1～7：空白組、mimics NC組、miR-27b-3p mimics組、si-NC組、si-Wnt3a組、miR-27b-3p mimics+pcDNA3.1組、miR-27b-3p mimics+Wnt3a組,圖4、5同圖2 Western印跡檢測各組Wnt3a蛋白表達

2.3各組LX-2-A細胞增殖能力比較 與空白組、mimics NC組比較,miR-27b-3p mimics組LX-2-A細胞在24、48 h的OD值顯著降低(P<0.05);與空白組、si-NC組比較,si-Wnt3a組LX-2-A細胞在24、48 h的OD值顯著降低(P<0.05);與miR-27b-3p mimics組、miR-27b-3p mimics+pcDNA3.1組比較,miR-27b-3p mimics+Wnt3a組LX-2-A細胞在24、48 h的OD值顯著升高(P<0.05),見表1。

2.4各組LX-2-A細胞中α-SMA表達 免疫熒光結(jié)果顯示,與空白組、mimics NC組比較,miR-27b-3p mimics組LX-2-A細胞綠色熒光強度顯著降低,表示α-SMA蛋白表達水平降低;與空白組、si-NC組比較,si-Wnt3a組LX-2-A細胞綠色熒光強度明顯降低,表示α-SMA蛋白表達水平降低;與miR-27b-3p mimics組、miR-27b-3p mimics+pcDNA3.1組比較,miR-27b-3p mimics+Wnt3a組LX-2-A細胞綠色熒光強度明顯增強,表示α-SMA蛋白表達水平升高,見圖3。

圖3 免疫熒光法觀察LX-2-A細胞中α-SMA表達(×1000)

2.5各組LX-2-A細胞活化相關(guān)蛋白表達 與空白組、mimics NC組比較,miR-27b-3p mimics組Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、TIMP-1蛋白表達水平顯著降低(P<0.05);與空白組、si-NC組比較,si-Wnt3a組Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、TIMP-1蛋白表達水平顯著降低(P<0.05);與miR-27b-3p mimics組、miR-27b-3p mimics+pcDNA3.1組比較,miR-27b-3p mimics+Wnt3a組Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、TIMP-1蛋白表達水平顯著升高(P<0.05),見圖4和表2。

表2 各組LX-2-A細胞中Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、TIMP-1、β-catenin、c-myc、CyclinD1蛋白表達

圖4 Western印跡檢測Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、TIMP-1蛋白表達

2.6各組LX-2-A細胞中Wnt/β-catenin通路相關(guān)蛋白表達 與空白組、mimics NC組比較,miR-27b-3p mimics組β-catenin、c-myc、CyclinD1蛋白表達水平顯著降低(P<0.05);與空白組、si-NC組比較,si-Wnt3a組β-catenin、c-myc、CyclinD1蛋白表達水平顯著降低(P<0.05);與miR-27b-3p mimics組、miR-27b-3p mimics+pcDNA3.1組比較,miR-27b-3p mimics+Wnt3a組β-catenin、c-myc、CyclinD1蛋白表達水平顯著升高(P<0.05),見表2和圖5。

圖5 Western印跡檢測β-catenin、c-myc、Cyclin D1蛋白表達

2.7雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?通過Targetscan網(wǎng)站預測發(fā)現(xiàn)miR-27b-3p與Wnt3a存在結(jié)合位點,見圖6。雙熒光素酶報告基因結(jié)果顯示,與mimics NC和WT-Wnt3a共轉(zhuǎn)染組比較,miR-27b-3p mimics和WT-Wnt3a共轉(zhuǎn)染組LX-2細胞熒光素酶活性顯著降低(P<0.05);與mimics NC和MUT-Wnt3a共轉(zhuǎn)染組比較,miR-27b-3p mimics和MUT-Wnt3a共轉(zhuǎn)染組LX-2細胞熒光素酶活性無顯著性變化(P>0.05),見表3。

表3 LX-2細胞中熒光素酶活性比較

圖6 miR-27b-3p與Wnt3a的結(jié)合位點

3 討 論

在正常肝臟中,HSC 處于靜止狀態(tài),然而,在受損的肝臟中,HSC被激活并轉(zhuǎn)分化為表達α-SMA標記的成肌纖維細胞〔8〕。活化的HSC合成并分泌Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、TIMP-1等多種ECM,造成肝臟組織內(nèi)ECM過度沉積,最終導致肝纖維化〔9〕。TGF-β1 是一種重要的促纖維化因子和肝纖維化發(fā)病機制中的主要介質(zhì),可導致 HSC 活化,從而加劇 ECM 的積累〔10〕。本研究結(jié)果提示,10 ng/ml TGF-β1誘導的LX-2細胞活化模型構(gòu)建成功。

研究表明,miRNAs對于HSC 的活化、肝纖維化發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用〔11〕。徐靜等〔12〕報道過表達miR-373通過抑制TGF-βⅡ型受體表達抑制HSC活化;武彥虎等〔13〕表明miR-519d-3p具有抑制HSC活化,促進HSC凋亡,抑制肝纖維的作用。本研究結(jié)果提示,過表達miR-27b-3p可抑制LX-2-A細胞活化。

Wnt/β-catenin信號通路參與了肝纖維化進程〔14〕。如白靈芝提取物通過抑制Wnt/β-catenin信號通路的激活抑制HSC的增殖與活化〔15〕;松芪水合物通過抑制 Wnt/β-catenin 通路抑制HSC活化〔16〕;CD73沉默抑制了HSC活化并促進活化HSC的凋亡,該機制與抑制Wnt/β-catenin 通路有關(guān)〔17〕。本研究結(jié)果提示,過表達miR-27b-3p可抑制LX-2-A細胞活化,可能與抑制Wnt/β-catenin 通路有關(guān)。已有研究報道,Wnt3a能夠促進子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞纖維化〔18〕;過表達miR-27a-3p通過下調(diào)Wnt3a表達抑制肺成纖維細胞中Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ表達〔19〕。本研究結(jié)果提示,過表達miR-27b-3p可能靶向抑制Wnt3a表達,阻斷Wnt/β-catenin 通路,進而抑制LX-2-A細胞活化。為了驗證該推測,本研究利用Wnt3a過表達物進行干預miR-27b-3p mimics,結(jié)果發(fā)現(xiàn),上調(diào)Wnt3a表達逆轉(zhuǎn)了過表達miR-27b-3p對LX-2-A細胞活化的抑制作用,以上結(jié)果說明過表達miR-27b-3p通過靶向下調(diào)Wnt3a表達,抑制Wnt/β-catenin通路激活,進而抑制LX-2-A細胞活化。Lv等〔20〕研究表明過表達miR-27b-3p通過靶向下調(diào)Wnt3a表達,抑制Wnt/β-catenin信號通路進而減輕心房顫動大鼠心房纖維化。本研究與其研究結(jié)果一致。

綜上所述,過表達miR-27b-3p通過靶向下調(diào)Wnt3a表達,抑制Wnt/β-catenin通路激活,進而抑制LX-2-A細胞活化。