尹平平 許睿 周張 胡曉榆 于明良

(武漢市第四醫(yī)院麻醉科,湖北 武漢 430034)

芬太尼是人工合成的阿片受體激動劑,與其他阿片類藥物一樣,具有強效的鎮(zhèn)痛作用,但重復(fù)使用會引起機體對疼痛的敏感性增強,即阿片誘發(fā)的痛覺過敏(OIH)〔1〕,這種副作用嚴(yán)重干擾了臨床醫(yī)生對疼痛的管理和治療〔2〕,亟待探明其發(fā)生機制。N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDAR)廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng),包括杏仁核(CeA),且NMDAR與疼痛的發(fā)生密切相關(guān)〔3〕。研究表明,脊髓NMDAR可被細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)激活,使NMDAR磷酸化增加,導(dǎo)致其功能增強,最終參與炎性O(shè)IH的產(chǎn)生〔4〕,而下調(diào)脊髓NMDAR的表達(dá)可以減弱瑞芬太尼誘導(dǎo)的OIH〔5〕。研究證明,CeA內(nèi)ERK與OIH的產(chǎn)生有關(guān)〔6,7〕,但CeA內(nèi)NMDAR在OIH中的作用尚待進(jìn)一步研究。因此,本研究擬探討CeA內(nèi)NMDAR在芬太尼誘發(fā)的OIH大鼠中的作用,以便為臨床預(yù)防和治療OIH提供思路。

1 材料與方法

1.1動物選擇 健康清潔級(SPF級)雄性SD大鼠36只,體質(zhì)量70～110 g,由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院動物實驗中心提供,室溫飼養(yǎng),自由攝食和飲水,白天與黑夜時間12 h∶12 h。本實驗所用的大鼠均嚴(yán)格遵循中國衛(wèi)生機構(gòu)制定的實驗室動物應(yīng)用指南。

1.2實驗分組 實驗一：采用隨機數(shù)字表法,將24只SD大鼠隨機分為3組(n=8)：芬太尼+氯胺酮組(K1組)皮下注射芬太尼制備OIH模型,1 d后腹腔注射NMDAR拮抗劑氯胺酮(15 mg/kg);芬太尼誘發(fā)OIH組(H1組)皮下注射芬太尼制備OIH模型,1 d后腹腔注射等容量生理鹽水;對照組(C1組)皮下注射等容量生理鹽水,1 d后腹腔注射等容量生理鹽水。分別于皮下注射芬太尼或生理鹽水前(T0)、注射后1 d(T1)和腹腔注射氯胺酮或生理鹽水后30 min(T2)時檢測大鼠機械痛閾和熱痛閾。實驗二：將實驗一最后一次測痛結(jié)束的各組大鼠處死,取右側(cè)CeA區(qū)組織,Western印跡檢測NMDAR亞基NR2B磷酸化(P-NR2B)的表達(dá)。實驗三：另取12只雄性SD大鼠,隨機分為3組(n=4)：對照組(C2組)、芬太尼誘發(fā)OIH組(H2組)和芬太尼+氯胺酮組(K2組)按實驗一處理后,制備含有中央CeA的腦片,采用CeA區(qū)神經(jīng)元電生理記錄各組右側(cè)CeA區(qū)神經(jīng)元NMDAR微小興奮性突觸后電流(mEPSCs)的幅值和頻率。

1.3芬太尼誘發(fā)OIH模型的制備 枸櫞酸芬太尼(湖北宜昌人福藥業(yè)有限公司,批號1130411)使用前用生理鹽水配制。采用文獻(xiàn)〔8〕的方法制備芬太尼誘導(dǎo)的OIH模型。具體操作是：大鼠頸背部皮下注射芬太尼,每次60 μg/kg,共4次,給藥間隔15 min,累積藥量240 μg/kg。給藥期間及給藥后2 h內(nèi)注意給大鼠保暖及吸氧。

1.4疼痛行為測定 分別于T0、T1和T2時測定大鼠的機械痛閾和熱痛閾。測定機械痛閾時,具體方法是將大鼠置于金屬籠內(nèi),靜置30 min后,用不同壓力的von Frey絲(North Coast公司,美國)垂直刺激大鼠左足掌面,力度以von Frey絲輕微彎曲為準(zhǔn),持續(xù)10 s或直至出現(xiàn)縮足反應(yīng)。當(dāng)大鼠在規(guī)定時間內(nèi)出現(xiàn)縮足反應(yīng),則記為陽性。采用up-and-down方法計算50%縮足反應(yīng)閾即為機械痛閾值。測定熱痛閾時,采用的熱痛刺激儀(BME-410C)購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程研究所。具體方法是將大鼠置于底部為玻璃板的透明小室中,安靜放置30 min后,使用輻射燈對準(zhǔn)大鼠左足掌正中照射,自動記錄大鼠的縮足潛伏期作為熱痛閾,停止時間為15 s,以免造成大鼠左足掌組織損傷。

1.5Western印跡檢測CeA組織P-NR2B的表達(dá) 測痛完畢后處死大鼠,并取出右側(cè)CeA區(qū)組織凍存于-80 ℃冰箱備用。取適量組織稱重后,加入一定量含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液(碧云天,中國)并勻漿,12 000 r/min,4 ℃離心10 min取上清,二喹啉甲酸(BCA)法測蛋白濃度。加入十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)上樣緩沖液(碧云天,中國),95 ℃煮沸8～10 min使蛋白變性,制備SDS-PAGE(10%),電泳后濕轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。5%脫脂奶粉TBST緩沖液室溫震蕩封閉1 h后洗膜,加入封閉液稀釋的兔抗P-NR2B抗體 (1∶500稀釋,Millipore公司,德國)和小鼠抗GAPDH(1∶500,博士德,中國),4 ℃孵育過夜,洗膜,加入TBST稀釋的辣根過氧化酶(HRP)-山羊抗兔和HRP-山羊抗小鼠的二抗(1∶5 000),室溫孵育2 h,洗膜后在避光條件下將電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒中的A、B兩種試劑等體積混合,振蕩混勻后均勻加到膜上,用化學(xué)發(fā)光凝膠圖像系統(tǒng)拍照。P-NR2B表達(dá)量以P-NR2B與GAPDH光密度的比值表示。

1.6全細(xì)胞膜片鉗實驗 全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄大鼠CeA區(qū)神經(jīng)元NMDAR mEPSCs。采用LEICA VT1000 S切片機,將含有CeA區(qū)的大鼠右腦組織塊冠狀切成厚度為350 μm的腦片。切片液成分(mmol/L)：213蔗糖,3 KCl,1 NaH2PO4,0.5 CaCl2,5 MgCl2,26 NaHCO3和10葡萄糖,切片液溫度為4 ℃。將切片所得的含有CeA區(qū)的腦片在25 ℃的人工腦脊液(ACSF)中孵育,時間至少1 h,人工ACSF成分(mmol/L)：125 NaCl,5 KCl,1.2 NaH2PO4,2.6 CaCl2,1.3 MgCl2,26 NaHCO3和10葡萄糖。其中切片液及人工ACSF均為氧飽和溶液,且調(diào)節(jié)PH至7.2～7.4,滲透壓維持在290～310 mOsm。使用的持續(xù)灌流ACSF的溫度控制在31 ℃,灌流速度為2 ml/min。膜片鉗放大器為HEKA EPC-10 (Molecular Devices),記錄軟件為patchmaster (Molecular Devices),應(yīng)用紅外線微分干涉相差顯微鏡在可視化模式下記錄CeA區(qū)神經(jīng)元mEPSCs。確認(rèn)封接電阻(>2 GΩ)和串聯(lián)電阻(<20 MΩ)以保證細(xì)胞封接質(zhì)量。記錄電極為玻璃微電極(WPI),電極內(nèi)液成份(mmol/L)：100葡萄糖酸鉀、30 KCl、5 NaCl、1 MgCl2、10 HEPES、 3 EGTA、2 Na2-ATP,用1 mmol/L NaOH調(diào)節(jié)PH值為7.4。持續(xù)灌流ACSF中加入 50 μmol/L木防已苦毒素(PTX)阻斷抑制性突觸后電流,1 μmol/L河豚毒素(TTX,阻斷動作電位)和20 μmol/L CNQX(AMPA受體和海人藻受體的拮抗劑),且鉗制電壓+60 mV的條件下進(jìn)行CeA區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞的高阻封接,從而獲得NMDA受體mEPSCs。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS21．0軟件進(jìn)行方差分析、t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1芬太尼誘發(fā)的OIH可以被NMDAR拮抗劑所逆轉(zhuǎn) H1組T1、T2時及K1組T1時機械縮足閥值和熱縮足潛伏期均明顯低于本組T0時(均P<0.05);與C1組比較,H1組T1、T2時、K1組T1時機械縮足閾值和熱縮足潛伏期均明顯降低(P<0.05);而給予氯胺酮后可逆轉(zhuǎn)OIH,即與H1組比較,K1組T2時機械痛閾和熱縮足潛伏期均明顯升高(均P<0.05),見表1。

表1 各組不同時間點機械縮足閾值和熱縮足潛伏期比較

2.2芬太尼誘發(fā)的OIH與大鼠CeA中P-NR2B的過度表達(dá)有關(guān) 與C1組CeA區(qū)P-NR2B水平(0.28±0.01)相比,H1組(0.48±0.05)明顯增多(P<0.05),K1組(0.28±0.02)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 Western印跡檢測3組P-NR2B水平

2.3芬太尼誘發(fā)的OIH大鼠CeA區(qū)神經(jīng)元NMDAR介導(dǎo)的突觸傳遞發(fā)生改變 CeA區(qū)神經(jīng)元電生理記錄示,與C2組比較,H2組CeA區(qū)NMDAR mEPSCs幅值及頻率均明顯增加(均P<0.05),而K2組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。見表2、圖2。

圖2 各組NMDAR mEPSCs的典型波形(10 s)

表2 各組mEPSCs的幅值和頻率比較

3 討 論

阿片藥物芬太尼主要用于臨床麻醉和鎮(zhèn)痛,但其有潛在的誘發(fā)OIH的風(fēng)險,即采用阿片藥物鎮(zhèn)痛,卻反而引起機體對疼痛的敏感性增加〔9〕。這種矛盾的現(xiàn)象給臨床使用阿片類藥物帶來了困惑,亟待探明其機制,以指導(dǎo)臨床用藥和治療OIH。NMDAR廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng),參與多種疼痛機制的調(diào)節(jié)〔10〕,包括神經(jīng)病理性疼痛和中樞痛敏。已有研究表明,脊髓NMDAR參與阿片藥物瑞芬太尼誘導(dǎo)的OIH的產(chǎn)生〔11〕,但NMDAR是否參與脊髓上中樞神經(jīng)系統(tǒng)來調(diào)節(jié)OIH尚待研究。本研究結(jié)果表明CeA NMDAR可能與芬太尼誘發(fā)的OIH產(chǎn)生有關(guān)。值得注意的是,NMDAR的拮抗劑氯胺酮,除了具有分離麻醉的特性外,還具有鎮(zhèn)痛、抗炎和抗抑郁的作用。不同劑量的氯胺酮所產(chǎn)生的作用不同,研究表明,氯胺酮產(chǎn)生麻醉作用所需的劑量遠(yuǎn)大于其產(chǎn)生鎮(zhèn)痛、抗炎和抗抑郁作用所需的劑量〔12〕。鑒于氯胺酮的鎮(zhèn)痛作用與給藥劑量有關(guān),本研究OIH大鼠單次腹腔注射低劑量(15 mg/kg)氯胺酮,該劑量遠(yuǎn)低于產(chǎn)生麻醉作用所需的氯胺酮。且氯胺酮小鼠腹腔注射后的半衰期是13～25 min〔13～15〕,在注射30 min后,大鼠并未出現(xiàn)麻醉相關(guān)表現(xiàn),大鼠完全清醒,活動自如,推斷氯胺酮此時主要產(chǎn)生的是鎮(zhèn)痛作用。在Abelaira等〔16〕研究中,給予大鼠15 mg/kg單次劑量的氯胺酮30 min后,即開始進(jìn)行大鼠強迫游泳的行為學(xué)測試,說明大鼠是完全清醒的,也與本文觀察的結(jié)果一致。該研究結(jié)果提示,NMDAR拮抗劑氯胺酮可以改善OIH大鼠的疼痛閾值,產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用,從而緩解OIH。

NR2B是NMDAR執(zhí)行調(diào)節(jié)功能的重要亞基,其磷酸化水平與NMDAR介導(dǎo)產(chǎn)生的慢性疼痛密切相關(guān)〔17〕,在NR2B亞基激活Ca2+內(nèi)流之后,特定的鳥嘌呤核苷酸交換因子(GEFs)會刺激ERK的磷酸化(pERK)。pERK隨后從神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核。在細(xì)胞核中,pERK刺激核糖體激酶2,導(dǎo)致133絲氨酸上的環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)磷酸化(pCREB)。pCREB進(jìn)一步調(diào)節(jié)含有CRE的某些基因與CREB結(jié)合位點結(jié)合。通過與c-fos,神經(jīng)激肽/P物質(zhì)受體,腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF),降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)和環(huán)氧化酶(COX)-2等結(jié)合,導(dǎo)致傷害性感受反應(yīng)的產(chǎn)生。這些神經(jīng)調(diào)節(jié)劑會引發(fā)更多的NR2B亞基的激活,導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)的可塑性改變,這條途徑的最終結(jié)果是OIH和異常性疼痛的產(chǎn)生。本研究發(fā)現(xiàn),OIH時,NMDAR亞基P-NR2B表達(dá)增加,給予NMDAR拮抗劑氯胺酮后,P-NR2B表達(dá)降低,可以逆轉(zhuǎn)OIH。

已有研究表明,NR2B亞基在NMDAR調(diào)控神經(jīng)元突觸可塑性中起關(guān)鍵性作用,其表達(dá)水平與NMDAR產(chǎn)生的興奮性突觸傳遞正相關(guān)〔18〕。本研究中,OIH大鼠CeA NMDAR mEPSCs的幅值和頻率增加,給予NMDAR拮抗劑氯胺酮后,可以減少OIH大鼠CeA NMDAR介導(dǎo)的mEPSCs的幅值和頻率。mEPSCs的幅值體現(xiàn)的是作用于突觸后膜神經(jīng)遞質(zhì)釋放量,而mEPSCs的頻率體現(xiàn)的是突觸前膜神經(jīng)遞質(zhì)釋放概率,該研究結(jié)果提示OIH大鼠CeA神經(jīng)元間突觸傳遞功能增強,CeA神經(jīng)元間可能發(fā)生了功能上的突觸可塑性,且這種改變與NMDAR有關(guān)。本研究結(jié)果證實了阿片藥物芬太尼可能通過某種途徑作用于大鼠CeA神經(jīng)元上的NMDAR亞基NR2B,從而調(diào)控神經(jīng)元間突觸傳遞,使CeA發(fā)生突觸可塑性,從而產(chǎn)生OIH。但NMDAR是通過何種途徑調(diào)控大鼠OIH的產(chǎn)生尚待進(jìn)一步研究。