秦譽(yù)寧，姚宇豪，RUBAYIZA Joshua，何書英

（中國藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，南京 211198）

肝素主要用于臨床上抗血栓治療。相關(guān)證據(jù)表明，使用肝素及低分子肝素可以為腫瘤患者帶來更大的生存優(yōu)勢，其通過抑制細(xì)胞增殖、遷移、血管生成等非凝血途徑發(fā)揮治療作用[1]。Afratis等[2]發(fā)現(xiàn)肝素衍生物在體外和體內(nèi)模型中可以調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的表達(dá)來顯著降低乳腺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移。但由于肝素結(jié)構(gòu)的多樣性和相對分子質(zhì)量的多分散性，臨床使用上會(huì)發(fā)生出血、血小板減少癥等不良反應(yīng)，限制了其在腫瘤治療方面的應(yīng)用[3]。而超低分子肝素和低分子肝素（low molecular weight heparin，LMWHs）是在未分級肝素的基礎(chǔ)上對其進(jìn)行降解分離純化所得到的一類低聚糖混合物，與肝素相比，具有更低的抗凝活性和更小的不良反應(yīng)。故近年來LMWHs 因其多樣化的抗腫瘤活性從而在腫瘤治療中引起了人們的廣泛關(guān)注[4]。

肝素寡糖（heparin-derived oligosaccharide，HDO）是指由未分級肝素降解并分離純化得到的一種低和窄相對分子質(zhì)量分布的寡糖片段。前期研究發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室自制的HDO[5]可以抑制小鼠黑色素瘤模型中血清血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的分泌及腫瘤的成管活性，并且對黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移具有抑制作用。除了VEGF介導(dǎo)的血管生成途徑，HDO是否還通過其他潛在靶點(diǎn)發(fā)揮抗腫瘤活性還有待進(jìn)一步研究。缺氧及缺氧誘導(dǎo)因子1（hypoxia-inducible factors-1，HIF-1）是促使VEGF 表達(dá)增加的主要驅(qū)動(dòng)因素，介導(dǎo)腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞的活化及血管生成[6]。此外，缺氧促使細(xì)胞啟動(dòng)代謝重編程，顯著上調(diào)細(xì)胞糖酵解能力，介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲確保腫瘤進(jìn)展[7]。血管內(nèi)皮細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境中一類重要的細(xì)胞類型，為腫瘤提供生長所需的氧氣和營養(yǎng)，也為腫瘤轉(zhuǎn)移提供了途徑。人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）常用于研究低氧、炎癥、感染反應(yīng)以及腫瘤相關(guān)血管生成等。該細(xì)胞主要供能方式是有氧糖酵解，因此本研究使用化學(xué)缺氧模擬劑CoCl2刺激HUVEC 細(xì)胞，擬探究在缺氧環(huán)境下，HDO 是否通過參與HIF-1 介導(dǎo)的糖酵解途徑來發(fā)揮抗腫瘤活性。本研究首先檢測了細(xì)胞葡萄糖攝取、乳酸積累、GLUT-1及LDHA 的表達(dá)來探究HDO 對HUVEC 細(xì)胞缺氧糖酵解的影響，之后通過對PI3K/Akt/HIF-1α 信號軸的檢測來初步探討HDO 緩解HUVEC 細(xì)胞缺氧糖酵解的潛在分子機(jī)制，為進(jìn)一步推進(jìn)肝素寡糖成為抗腫瘤藥物提供新的理論依據(jù)。

1 材 料

1.1 試 劑

HDO（實(shí)驗(yàn)室自制，3.2 kD）；CoCl2·6H2O（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；高糖DMEM 培養(yǎng)基、FBS、胰蛋白酶（美國Gibco 公司）；胰蛋白酶（安徽Biosharp 生物公司）；葡萄糖測試盒、乳酸測試盒、乳酸脫氫酶測試盒（南京建成生物工程研究所）；β-actin 抗體、抗GLUT-1 抗體、抗LDHA 抗體、抗PI3K 抗體、抗Akt抗體、抗p-Akt抗體、抗HIF-1α 抗體、HRP 標(biāo)記山羊抗兔二抗（美國Immunoway 公司）；0.45 μm 聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride,PVDF）膜、青霉素-鏈霉素雙抗溶液、ECL 化學(xué)發(fā)光液、BCA 蛋白定量試劑盒、預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)（Marker）、RIPA 裂解液強(qiáng)（上海碧云天生物公司）；TriQuick 總RNA 提取試劑（北京索萊寶公司）；180 kD 預(yù)染蛋白質(zhì)Marker、蛋白膠預(yù)混液（10%）、HiScript Ⅲ 1st Strand cDNA 合成試劑盒、ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（南京諾唯贊生物公司），其他試劑均為市售分析純。

1.2 儀 器

Biofuge Stratos 高速冷凍離心機(jī)、QuantStudio 3實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀、Nanodrop 2000 超微量分光光度計(jì)、Multiskan FC 酶標(biāo)儀（美國Thermo 公司）；T100 梯度PCR 儀（美國Bio-Rad 公司）；Tanon 5200全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)（上海Tanon 公司）。

2 方 法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)分組及缺氧模型建立

HUVEC 細(xì)胞在含10% FBS 的高糖DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)箱參數(shù)設(shè)置為37 ℃、5% CO2、飽和濕度。傳代周期：2 ～ 3 d。

實(shí)驗(yàn)分為對照（control）組（無血清DMEM 培養(yǎng)基）、模型（model）組（無血清DMEM 培養(yǎng)基+50μmol/L CoCl2）及HDO 給藥組（模型組基礎(chǔ)上分別添加0.01、0.1、1 μmol/L HDO）。將處于對數(shù)生長期且狀態(tài)良好的HUVEC 細(xì)胞常規(guī)消化處理，并調(diào)整細(xì)胞密度鋪6 孔板，待細(xì)胞貼壁生長至70% ～80%融合時(shí)，棄去舊培養(yǎng)基并分別加入各分組培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 葡萄糖攝取和乳酸含量的檢測

細(xì)胞培養(yǎng)和分組情況同“2.1”項(xiàng)。細(xì)胞處理24 h 后，收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，1 000 r/min，離心5 min，吸取上清液，分別使用葡萄糖測試盒和乳酸測試盒測定計(jì)算葡萄糖攝取量和乳酸含量。

2.3 乳酸脫氫酶活力的檢測

細(xì)胞培養(yǎng)和分組情況同“2.1”項(xiàng)。細(xì)胞處理24 h 后，胰酶消化收集各組細(xì)胞并用PBS 清洗2次，隨后每組細(xì)胞加入PBS 溶液0.2 mL，冰浴，超聲破碎裂解細(xì)胞，功率300 W，每次4 s，重復(fù)3 次，間隔30 s。隨后取細(xì)胞勻漿液按照BCA 法測定蛋白濃度，并使用乳酸脫氫酶測試盒測定計(jì)算乳酸脫氫酶酶活力。

2.4 蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞培養(yǎng)及分組情況同“2.1”項(xiàng)。細(xì)胞處理24 h 后，胰酶消化收集各組細(xì)胞，用預(yù)冷PBS 洗滌細(xì)胞2 次，3 000 r/min，4 ℃離心10 min，棄去上清液；加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA細(xì)胞裂解液，提取細(xì)胞總蛋白；采用BCA 法測定蛋白含量；之后按照蛋白膠預(yù)混液試劑盒說明書進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳；電泳結(jié)束后立即轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF 膜； 5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；4 ℃ 孵育HIF-1α、GLUT-1、LDHA、PI3K、Akt、p-Akt 一抗（稀釋比1∶500）過夜；TBST 洗膜4 次，每次5 min；室溫孵育二抗（稀釋比1∶5 000）1 h；TBST 洗膜4 次，每次5 min；加ECL 曝光液用化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)采集圖像。

2.5 RNA分離提取及qRT-PCR

細(xì)胞培養(yǎng)及分組情況同“2.1”項(xiàng)。細(xì)胞處理24 h 后，按照TriQuick 總RNA 提取試劑說明書提取細(xì)胞總RNA，采用Nanodrop 測定濃度及純度，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑按照說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，在NCBI 上查找各目的基因mRNA 序列，設(shè)計(jì)引物序列如表1，由生工生物公司合成序列。按照ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 說明書進(jìn)行qPCR反應(yīng)，設(shè) 3個(gè)復(fù)孔。

Table 1 Primer sequences

2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

以上所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均使用GraphPad Prism 5.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和作圖，每組數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，兩組獨(dú)立樣本之間使用t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性差異分析，P＜ 0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 肝素寡糖抑制缺氧HUVEC 細(xì)胞的葡萄糖攝取

在腫瘤細(xì)胞、快速增殖的組織細(xì)胞及缺氧環(huán)境下的正常細(xì)胞中，細(xì)胞需要從外部攝取更多葡萄糖用于支持自身對能量的過度需求[8]。葡萄糖攝取在臨床上被利用來診斷癌癥，或通過利用放射性標(biāo)記的葡萄糖類似物評估腫瘤反應(yīng)[9]。使用CoCl2缺氧刺激HUVEC細(xì)胞，觀察到細(xì)胞對葡萄糖的攝取量明顯升高（P＜ 0.05），而在缺氧條件下加入不同濃度HDO 藥物處理后，可以呈劑量依賴性地抑制葡萄糖的攝取能力。0.1、1 μmol/L HDO 的抑制率分別為47.7%與47.0%（圖1）。

Figure 1 Heparin-derived oligosaccharide (HDO) inhibited glucose uptake in hypoxic HUVEC cells (xˉ± s, n = 3)

3.2 肝素寡糖抑制缺氧HUVEC細(xì)胞的乳酸積累

乳酸是糖酵解的代謝產(chǎn)物，能以多種方式促進(jìn)腫瘤進(jìn)展，包括促腫瘤生長轉(zhuǎn)移、血管生成、腫瘤浸潤與腫瘤免疫等[10-11]。與常氧相比，缺氧刺激會(huì)顯著上調(diào)HUVEC 細(xì)胞的乳酸含量（P＜ 0.01），而不同濃度HDO 藥物作用后可以不同程度地抑制乳酸積累（P＜ 0.05）從而抑制HUVEC 細(xì)胞的糖酵解水平達(dá)到緩解腫瘤侵襲的作用，0.01、0.1、1 μmol/L HDO 對乳酸積累的抑制率分別為18.8%，18.2%和15.9%（圖2）。

Figure 2 HDO inhibited lactic acid accumulationin in hypoxic HUVEC cells (xˉ± s, n = 3)

3.3 肝素寡糖抑制缺氧HUVEC 細(xì)胞中GLUT-1的表達(dá)

GLUT-1的高水平表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的惡性生長和不良預(yù)后密切相關(guān)[12]，如圖顯示，與對照組相比，模型組誘導(dǎo)HUVEC 細(xì)胞缺氧后，GLUT-1的mRNA相對表達(dá)量被顯著上調(diào)，在不同濃度HDO 藥物作用后，由于缺氧上調(diào)的GLUT-1 的基因轉(zhuǎn)錄水平均得到了不同程度的逆轉(zhuǎn)（圖3-A）。而在蛋白表達(dá)水平上，同模型組相比，低濃度及中濃度HDO作用后可以下調(diào)GLUT-1的蛋白表達(dá)，高濃度的HDO治療組并沒有顯著抑制GLUT-1 蛋白表達(dá)的效果（圖3-B，3-C）。以上結(jié)果說明，HDO 可以通過下調(diào)HUVEC 細(xì)胞中GLUT-1 的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平來抑制HUVEC 細(xì)胞對葡萄糖的攝取能力從而影響細(xì)胞自身的能量供應(yīng)。

Figure 3 HDO inhibited the expression of GLUT-1 in hypoxic HUVEC cells (xˉ± s, n = 3)

3.4 肝素寡糖對HUVEC細(xì)胞LDHA表達(dá)的影響

LDH 催化糖酵解途徑的最后一步，可以將丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸。研究證明，LDHA 在許多類型的癌癥中過度表達(dá)，靶向LDHA 會(huì)抑制腫瘤進(jìn)展[13]。HUVEC 細(xì)胞被CoCl2缺氧刺激后與對照組相比，LDHA 的mRNA 水平顯著升高，在缺氧條件下經(jīng)過HDO 藥物作用24 h 后，僅低濃度HDO 處理組可以顯著下調(diào)LDHA的mRNA水平，中濃度與高濃度給藥組對LDHA 基因轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有顯著影響(圖4-A)。在蛋白表達(dá)水平上，僅中濃度HDO 處理組可以顯著逆轉(zhuǎn)由于缺氧刺激導(dǎo)致的HUVEC 細(xì)胞LDHA 蛋白相對表達(dá)量的上調(diào)(圖4-B，4-C)。CoCl2處理HUVEC 細(xì)胞后可以顯著上調(diào)LDH 酶活力，經(jīng)過不同濃度HDO藥物治療后可以不同程度地抑制LDH 酶活力（圖4-D）。該結(jié)果說明HDO 可以通過調(diào)控LDHA 的mRNA 和蛋白的相對表達(dá)量及影響LDH 的酶活力來下調(diào)HUVEC 細(xì)胞乳酸的生成量，從而緩解腫瘤局部浸潤與侵襲進(jìn)展。

Figure 4 HDO inhibited the expression of LDHA in hypoxic HUVEC cells xˉ± s, n = 3)

3.5 肝素寡糖抑制缺氧HUVEC細(xì)胞中HIF-1α的表達(dá)

HIF-1 是細(xì)胞適應(yīng)氧穩(wěn)態(tài)的主要調(diào)節(jié)因子，HIF-1α 在常氧中幾乎不表達(dá)，而缺氧會(huì)誘導(dǎo)HIF-1α 的發(fā)生從而與穩(wěn)定表達(dá)的HIF-1β 形成復(fù)合物，該復(fù)合物進(jìn)一步通過與下游靶基因啟動(dòng)子上的缺氧反應(yīng)元件結(jié)合調(diào)控細(xì)胞內(nèi)諸多基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)從而使細(xì)胞適應(yīng)缺氧環(huán)境。缺氧刺激HUVEC 細(xì)胞24 h可以顯著升高HIF-1α的mRNA 相對表達(dá)水平，而HDO 治療后可以抑制缺氧導(dǎo)致的HIF-1α mRNA 相對表達(dá)水平的上調(diào)并且這種抑制作用具有劑量依賴性（圖5-A）。在蛋白表達(dá)水平上，對照組常氧環(huán)境下，HUVEC 細(xì)胞中HIF-1α 的蛋白表達(dá)水平極低，在細(xì)胞經(jīng)過CoCl2缺氧誘導(dǎo)后HIF-1α 的蛋白表達(dá)水平被顯著上調(diào)，但在不同濃度HDO 藥物治療作用后，由缺氧刺激導(dǎo)致的HIF-1α 蛋白表達(dá)水平升高被不同程度地逆轉(zhuǎn)（圖5-B，5-C）。

Figure 5 HDO inhibited the expression of HIF-1α in hypoxic HUVEC cells (xˉ± s, n = 3)

3.6 肝素寡糖抑制缺氧HUVEC 細(xì)胞中PI3K/Akt信號通路的激活

PI3K/Akt 在許多細(xì)胞中介導(dǎo)細(xì)胞增殖、代謝及炎癥等多種病理生理過程。許多靶向PI3K/Akt通路的抑制劑已經(jīng)顯示出下調(diào)HIF-1表達(dá)的作用。PI3K-Akt 通路與血管生成及細(xì)胞糖酵解之間的聯(lián)系已在許多研究中得到證實(shí)。因此本研究接下來通過Western blot 實(shí)驗(yàn)，檢測HDO 對缺氧HUVEC細(xì)胞中PI3K/Akt通路的影響。CoCl2缺氧刺激可以顯著誘導(dǎo)HUVEC 細(xì)胞中PI3K 的表達(dá)及Akt 的磷酸化，在加入HDO 藥物治療后可以顯著抑制PI3K/Akt通路的激活，其中高濃度HDO的抑制效果最好（圖6）。由此可見PI3K/Akt 通路確實(shí)參與并促使了CoCl2誘導(dǎo)的HUVEC 細(xì)胞的異常損傷，而HDO可以通過影響PI3K/Akt 通路的激活來減輕HUVEC細(xì)胞的損傷程度。

Figure 6 HDO inhibited the activation of PI3K/Akt signaling pathway in hypoxic HUVEC cells (xˉ± s, n = 3)

4 討 論

在腫瘤細(xì)胞、快速增殖的組織細(xì)胞及處于缺氧環(huán)境下的正常細(xì)胞會(huì)利用糖酵解作為主要的供能方式。該方式可以將細(xì)胞攝入的大量葡萄糖轉(zhuǎn)化為乳酸從而滿足細(xì)胞的能量需求及合成代謝需求，此外，細(xì)胞糖酵解過程中產(chǎn)生的大量乳酸可以分解破壞細(xì)胞外基質(zhì)促使細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移[14]。缺氧和HIF會(huì)影響腫瘤細(xì)胞代謝途徑，參與葡萄糖攝取和糖酵解過程的許多酶都是HIF的靶基因，通過上調(diào)相關(guān)酶的表達(dá)以進(jìn)一步增加腫瘤細(xì)胞糖酵解能力，從而促使腫瘤細(xì)胞增殖存活，并更具侵襲性，顯示出更差的預(yù)后[15]。

大量數(shù)據(jù)表明肝素及低相對分子質(zhì)量肝素具有抗凝活性以外的抗腫瘤活性。前期實(shí)驗(yàn)室通過亞硝酸降解未分級肝素并分離純化后得到一種相對分子質(zhì)量約為3 200 的十二糖片段——肝素寡糖（HDO），并表明此HDO具有抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及血管生成的作用[16-17]，而本研究則探討了此HDO 對HUVEC 細(xì)胞缺氧糖酵解的影響，進(jìn)一步為其成為抗腫瘤藥物提供一部分理論依據(jù)。

GLUT-1 是一種限速葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可以將胞外葡萄糖運(yùn)輸至胞內(nèi)，在腫瘤細(xì)胞及增殖迅速的正常細(xì)胞中GLUT1的過表達(dá)與細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[18]。此外，在缺氧的情況下，葡萄糖分解生成的丙酮酸會(huì)在乳酸脫氫酶（LDH）的作用下被還原為無氧糖酵解的最終產(chǎn)物——乳酸。研究表明，LDHA 在腫瘤細(xì)胞中通常被顯著上調(diào)，而靶向抑制LDHA 會(huì)減弱腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移[19-21]。而HDO 可以抑制缺氧HUVEC 細(xì)胞中GLUT-1 及LDHA 的表達(dá)進(jìn)一步下調(diào)細(xì)胞對胞外葡萄糖的攝取及乳酸的生成能力，從而影響HUVEC 細(xì)胞缺氧糖酵解途徑。

PI3K/Akt 調(diào)節(jié)廣泛的細(xì)胞活動(dòng)，包括細(xì)胞存活、增殖、代謝、運(yùn)動(dòng)和腫瘤進(jìn)展。Xiao等[22]發(fā)現(xiàn)加入外源性的PDGF 可以激活PI3K/Akt/mTOR/HIF-1α 信號通路從而促進(jìn)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖及Warburg 效應(yīng)。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)缺氧誘導(dǎo)的損傷可以通過某些作用于PI3K / Akt 信號通路的藥物來治療[23]。本研究表明此HDO 可以抑制PI3K/Akt/HIF-1α通路的激活。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)HDO通過影響HUVEC細(xì)胞糖酵解途徑從而發(fā)揮抗腫瘤活性，具體來說，HDO可以抑制PI3K/Akt/HIF-1α通路的激活進(jìn)一步調(diào)控下游靶基因GLUT-1 及LDHA 的表達(dá)，從而抑制HUVEC 細(xì)胞的葡萄糖攝取及乳酸生成能力。該研究為推進(jìn)HDO在抗腫瘤及治療缺氧損傷相關(guān)疾病中的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但還應(yīng)對以下幾點(diǎn)繼續(xù)深入探究：（1）HDO 調(diào)控HIF-1α 表達(dá)的具體機(jī)制；（2）HDO 在缺氧損傷引起的細(xì)胞凋亡、腫瘤細(xì)胞免疫逃逸中的作用；（3）HDO 在體內(nèi)缺氧模型中的作用。