張 楠，黃孝學(xué)，張子良，羅 玉，林君謙，王 濤*

（1中國藥科大學(xué)藥物科學(xué)研究院新藥篩選中心，南京 210009；2六安市人民醫(yī)院，六安 237000）

《中國居民營養(yǎng)與慢性病狀況報(bào)告（2020 年）》顯示，我國成年人中超重和肥胖比率分別為34.3%和16.4%，超重和肥胖已成為我國突出的營養(yǎng)問題之一，而肥胖伴有的糖脂代謝紊亂是糖尿病、脂肪肝、心腦血管等疾病的重要誘因。因此，改善肥胖狀態(tài)下的糖脂代謝紊亂，比減輕肥胖體重更為迫切[1]。當(dāng)前，盡管減重手術(shù)和部分藥物（如利拉魯肽和苯丁胺等）對于嚴(yán)重肥胖者具有減重作用，但存在較多的安全性風(fēng)險(xiǎn)，長期療效具有不確定性，尋找安全有效的肥胖及其糖脂代謝紊亂治療方法刻不容緩[2]。

多種小分子代謝產(chǎn)物對肥胖、糖尿病、心力衰竭、抑郁癥、肺缺血、腫瘤等復(fù)雜疾病表現(xiàn)出獨(dú)特的改善作用，包括脂質(zhì)、短鏈脂肪酸、氨基酸等；同時(shí)由于這些代謝產(chǎn)物在體內(nèi)可以完全轉(zhuǎn)化和利用，相比外源性化學(xué)藥物降低了對機(jī)體的代謝負(fù)擔(dān)，它們已日益成為候選藥物的源頭和促進(jìn)代謝健康的新策略[3-6]。1808 年 Berzelius 首次發(fā)現(xiàn)了肌肉中游離乳酸的存在。較長時(shí)間內(nèi)乳酸被認(rèn)為是機(jī)體糖酵解的無用產(chǎn)物，后來被證明是體內(nèi)糖異生的主要前體和重要的能量底物。近年研究揭示，乳酸也是一種信號(hào)分子，通過血液運(yùn)輸在各種細(xì)胞、組織和器官間穿梭，以信使的形式在機(jī)體代謝靈活性和代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)中發(fā)揮全面作用[7-9]，通過單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（monocarboxylate transporters,MCTs）家族和乳酸受體（GPR81），在糖脂代謝和炎癥調(diào)控中發(fā)揮重要作用，包括：抑制脂肪分解和脂肪酸β-氧化，增加組織胰島素敏感性和代謝靈活性，減輕巨噬細(xì)胞活化和炎癥因子釋放等[10-13]。

當(dāng)前，盡管已有多種可以增加胰島素敏感性及促進(jìn)葡萄糖代謝的藥物，但它們僅能通過糖代謝某個(gè)特定環(huán)節(jié)靶點(diǎn)進(jìn)行調(diào)節(jié)，單純性促進(jìn)葡萄糖的代謝和利用，尚缺乏可以系統(tǒng)性促進(jìn)糖代謝、抑制脂代謝，從生化機(jī)制上全面平衡糖脂代謝的藥物[14-16]。越來越多的證據(jù)表明，乳酸作為一種主要的可循環(huán)碳水能量物質(zhì)，通過平衡細(xì)胞內(nèi)NADH/NAD+的比例促進(jìn)線粒體功能，雙向調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)糖、脂代謝，在維持和調(diào)節(jié)各個(gè)組織器官的糖脂代謝和能量供應(yīng)平衡方面發(fā)揮重要作用[17-18]。鑒于糖脂代謝失衡和胰島素抵抗是肥胖相關(guān)代謝紊亂的主要特征，本研究采用高脂飼料誘發(fā)肥胖小鼠，考察不同給藥方案、途徑的外源性乳酸對該模型糖脂代謝和胰島素抵抗改善作用，探討肥胖性代謝失衡干預(yù)的新策略和新方法。

1 材 料

1.1 藥品與試劑

L-乳酸鈉（CAS: 867-56-1，純度98%，美國阿拉丁公司）；葡萄糖（西隴科學(xué)股份有限公司）；葡萄檢測試劑盒（氧化酶法，上海榮盛有限公司）；甘油三酯（TG）檢測試劑盒、乳酸（LA）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）；精蛋白生物合成人胰島素注射液，諾和靈30R；小鼠胰島素ELISA 試劑盒（瑞典Mercodia 公司）；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物科技研究所）；RNA 純化試劑盒、熒光定量 PCR 試劑盒(SYBR Green)（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）；標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料（江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司，4.0 kJ/g，脂肪含量7%）；TP24200 型高脂飼料（南通特洛菲飼料科技有限公司，23.0 kJ/g，脂肪含量60%）。

1.2 儀 器

CIMO DHG-9104A低溫高速組織研磨儀（武漢賽維爾生物科技有限公司）；21R 微量臺(tái)式高速離心機(jī)、VARIOSKAN LUX 多功能微孔板讀數(shù)儀（美國賽默飛世爾科技公司）；BSA124S-CW 電子分析天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；BX53 正置顯微鏡（日本奧林巴斯公司）。

1.3 動(dòng) 物

8 周齡雄性C57BL/6J 小鼠，SPF 級(jí)，體重（17±1）g，由上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物經(jīng)營部提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2018-0006。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合動(dòng)物倫理委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)。

2 方 法

2.1 乳酸給藥劑量及依據(jù)

文獻(xiàn)報(bào)道，人體或者小鼠運(yùn)動(dòng)后血清乳酸可以達(dá)到15 ～ 20 mmol/L[13,19]。為確定本實(shí)驗(yàn)乳酸給藥劑量，小鼠禁食12 h 后，分別灌胃（ig）和腹腔注射（ip）不同劑量的乳酸（500 ～ 1 000 mg/kg），監(jiān)測給藥4 h 內(nèi)的血清乳酸變化。結(jié)果顯示，小鼠灌胃和腹腔注射500 mg/kg 乳酸，分別在10、30 min 時(shí)血清乳酸大于15 mmol/L，小鼠血乳酸水平高于基礎(chǔ)乳酸值的維持時(shí)間分別約為1 h 和2 h。灌胃和腹腔注射1 000 mg/kg 乳酸，血乳酸達(dá)峰時(shí)間與500 mg/kg 劑量接近，但最大值僅小幅高于500 mg/kg 劑量。為此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇500 mg/kg 作為乳酸受試劑量，相當(dāng)于中高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后的血乳酸水平。

2.2 動(dòng)物分組、模型建立及藥物干預(yù)

適應(yīng)飼養(yǎng)期的小鼠全部給予標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料；試驗(yàn)期間普通飼料飼養(yǎng)小鼠給予標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料，其他組小鼠給予高脂飼料。小鼠購入適應(yīng)飼養(yǎng)1 周后，進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。

（1）外源性乳酸對肥胖性代謝紊亂進(jìn)程的阻斷作用（4 周實(shí)驗(yàn)） 鑒于肥胖人群中具有從代謝健康向代謝紊亂轉(zhuǎn)變的進(jìn)程，為此，考察外源性乳酸對這一代謝失衡進(jìn)程的預(yù)防和阻斷作用。

小鼠隨機(jī)分為4 組：對照組（control, CON）、對照+乳酸給藥組（control-lactate, CON-LAC）、高脂飲食模型組（high-fat diet, HFD）、高脂飲食+乳酸給藥組（high-fat diet -lactate, HFD-LAC），每組8 只。CON 與CON-LAC 組小鼠給予普通飼料喂養(yǎng)4 周，HFD 組與HFD-LAC 組小鼠給予高脂飼料喂養(yǎng)4 周。CON-LAC 與HFD-LAC 組小鼠連續(xù)4 周腹腔注射500 mg/(kg·d) L-乳酸鈉干預(yù)。

（2）不同給藥途徑外源性乳酸對肥胖性代謝紊亂模型的治療作用（8 周實(shí)驗(yàn)） 采用高脂飼料喂養(yǎng)8 周建立肥胖性代謝紊亂模型，造模4 周時(shí)給藥，考察不同給藥途徑外源性乳酸的治療和改善作用。

造模4 周后，肥胖小鼠隨機(jī)分為3 組，分別為高脂飲食模型組（HFD）、乳酸500 mg/kg 腹腔注射組（LAC-IP）和乳酸500 mg/kg 灌胃組（LAC-IG），每組8 只小鼠。另設(shè)8 只普通飼料對照組（CON）。各組小鼠每天給藥1 次，連續(xù)給藥4 周，CON 組和HFD組給予同容積蒸餾水。

2.3 體重和攝食量測量

每日固定時(shí)間補(bǔ)充飼料，稱量剩余飼料及補(bǔ)充飼料，記錄小鼠的攝食量，計(jì)算各組小鼠平均日攝食量。每周測量小鼠體重，監(jiān)測小鼠體重增長情況。

2.4 口服糖耐量試驗(yàn)

給藥結(jié)束時(shí)，小鼠禁食不禁水12 h 后，灌胃2 g/kg 葡萄糖溶液，分別在灌胃葡萄糖0、15、30、60、120 min 進(jìn)行眼眶取血，全血于200 μL 離心管中常溫靜置30 min后，4 ℃，3 500 r/min離心15 min，吸取上層血清至200 μL EP 管中，按試劑盒說明測定血糖和血清乳酸，計(jì)算血糖-時(shí)間曲線下面積及血清乳酸-時(shí)間曲線下面積。

2.5 空腹胰島素水平及胰島素耐量檢測

8周實(shí)驗(yàn)給藥結(jié)束時(shí)，取口服糖耐量實(shí)驗(yàn)0 min血清測定空腹胰島素水平，根據(jù)空腹血糖、胰島素水平計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）。HOMAIR = 空腹血糖濃度 × 空腹胰島素濃度/22.5。

8 周實(shí)驗(yàn)給藥結(jié)束（與糖耐量實(shí)驗(yàn)間隔2 d），小鼠禁食不禁水6 h 后，腹腔注射 0.75 U/kg 的胰島素，分別測定給予胰島素0，15、30、60、120 min后小鼠的血糖，計(jì)算血糖-時(shí)間曲線下面積及胰島素給藥后15 min內(nèi)的曲線斜率。

2.6 血生化及肝糖原測定

小鼠禁食過夜后，摘眼球取血，根據(jù)試劑盒說明書測定乳酸、葡萄糖和甘油三酯水平。

小鼠肝臟用生理鹽水漂洗干凈，濾紙吸干，稱取肝臟組織30 mg，按照試劑盒說明書進(jìn)行肝糖原檢測。

2.7 脂肪組織質(zhì)量及組織形態(tài)學(xué)

取小鼠腹股溝脂肪（inguinal adipose tissue,ING）、附睪脂肪（epididymis adipose tissue, EAT），稱重，計(jì)算脂肪指數(shù)，即脂肪占體重的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。剪取小鼠ING、EAT 中間部分，在4%甲醛中固定48 h，常規(guī)石蠟包埋、切片，蘇木精-伊紅（HE）染色，光學(xué)顯微鏡下觀察和拍照，比較各組脂肪細(xì)胞形態(tài)的變化。

2.8 脂肪組織中脂肪酸代謝相關(guān)基因的表達(dá)水平

稱取ING 組織50 mg，按照試劑盒說明書提取總RNA，使用超微量核酸蛋白測定儀檢測RNA 濃度，在逆轉(zhuǎn)錄儀上將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法測定cDNA 樣品中的乙酰輔酶A 羧化酶 1（acetyl-CoA carboxylase 1, Acc1）、脂肪酸合酶（fatty acid synthase, Fas）、脂肪甘油三酯脂肪酶（adipose triglyceride lipase, Atgl）、激素敏感性脂肪酶（hormone sensitive lipase, Hsl）代謝相關(guān)基因mRNA 的表達(dá)水平。反應(yīng)條件: 95℃，5 min；95 ℃，10 s，60 ℃，30 s，95 ℃，15 s，40 個(gè)循環(huán)。以β-actin 作為內(nèi)參，計(jì)算相對量，采用2-ΔΔCT方法分析。引物設(shè)計(jì)見表1。

Table 1 Oligo nucleotide primers used for Real time-PCR

2.9 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所得結(jié)果均以xˉ ±s的形式表示，用GraphPad Prism 6 作圖，組間比較采用One-Way ANOVA 分析方法。組間數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用LSD-t檢驗(yàn)，以P ＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 對小鼠體重和攝食量的影響（4周預(yù)防實(shí)驗(yàn)）

如圖1-A 所示，與CON 組相比，HFD 組小鼠體重增加，且從第1 周起呈穩(wěn)步上升趨勢，證明有效誘導(dǎo)代謝失衡，CON-LAC 組小鼠體重?zé)o明顯變化，表明乳酸不會(huì)影響正常飲食小鼠的體重；HFD 與HFD-LAC 組小鼠體重?zé)o明顯差異。如圖1-B 所示，HFD 組小鼠的攝食量明顯高于CON 組（P＜0.001）；HFD-LAC 組小鼠的攝食量低于HFD 組（P＜ 0.05）。結(jié)果表明乳酸在不改變代謝失衡小鼠體重的情況下，改善了小鼠多食癥狀。

Figure 1 Effect of lactate (500 mg/kg, ip) on body weight, food intake in mice (±s, n = 8)A: Body weight curve; B: Food intake curve

3.2 對小鼠口服葡萄糖耐量的影響（4周預(yù)防實(shí)驗(yàn)）

如圖2-A，B 所示，CON 組小鼠灌胃葡萄糖后，血糖在15 min時(shí)達(dá)峰，之后逐漸下降，120 min時(shí)恢復(fù)到基礎(chǔ)水平。與CON 組相比，HFD 組口服糖耐量（oral glucose tolerance test, OGTT）曲線顯著抬高、AUC 顯著增加（P＜ 0.001），提示高脂飲食誘發(fā)小鼠糖耐量受損，CON-LAC 組小鼠的曲線和AUC未發(fā)生明顯變化；與HFD 組相比，HFD-LAC 組小鼠在15, 60 min 處的血糖和AUC 的降低有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜ 0.01，P＜ 0.05，P＜ 0.05），提示乳酸僅對代謝失衡小鼠的糖耐量具有一定改善作用。

此外，如圖2-C，D 所示，與CON 組相比，HFD組血清乳酸濃度-時(shí)間曲線顯著降低（P＜ 0.01），提示高脂飲食誘導(dǎo)小鼠葡萄糖轉(zhuǎn)化（糖酵解）受損。與HFD 組相比，HFD-LAC 組血清乳酸濃度-時(shí)間曲線抬高，AUC 顯著增加（P＜ 0.01），提示乳酸能夠抑制代謝失衡小鼠葡萄糖轉(zhuǎn)化（糖酵解）受損。

Figure 2 Effect of lactate (500 mg/kg, ip) on glucose tolerance in mice (±s, n = 8)

3.3 對小鼠血生化及肝糖原水平的影響（4 周預(yù)防實(shí)驗(yàn)）

如圖3-A、B、C 所示，與CON 組相比，HFD 組小鼠空腹血糖顯著升高（P＜ 0.001），血乳酸水平顯著降低（P＜ 0.01），肝糖原水平升高（P＜ 0.05），這些變化均表明高脂飲食顯著抑制了小鼠的葡萄糖代謝利用；與HFD 組相比，HFD-LAC 組小鼠空腹血糖和肝糖原水平降低（P＜ 0.05），同時(shí)乳酸水平顯著降低（P＜ 0.01），提示乳酸對高脂飲食小鼠糖代謝具有顯著恢復(fù)作用。如圖3-D、E 所示，與CON 組相比，HFD 組小鼠空腹血清TG 水平僅輕度升高，提示高脂飼養(yǎng)4周尚處于代謝靈活性的代償期，攝入的過多脂肪在禁食狀態(tài)下被優(yōu)先代謝利用，尚未引起顯著的血清TG 升高。CON-LAC 組小鼠空腹血清TG 水平高于CON 組（P＜ 0.05）；HFDLAC 組小鼠空腹血清TG 水平高于HFD 組（P＜0.05），顯示乳酸對脂肪酸代謝利用具有一定抑制作用。

Figure 3 Effect of lactate (500 mg/kg, ip) on serum glucose, lactate, triglycerides, and liver glycogen levels in mice (±s, n = 8)A: Fasting glucose; B: Serum TC; C: Serum TG; D: Serum lactate; E: Liver glycogen

3.4 對小鼠脂肪組織質(zhì)量及組織病理學(xué)的影響（4周預(yù)防實(shí)驗(yàn)）

如圖4-A，B 所示，與CON 組相比，HFD 組EAT質(zhì)量增加（P＜ 0.05），EAT/ING 升高（P＜ 0.05），CON-LAC 組小鼠ING 和EAT 質(zhì)量變化不顯著，EAT/ING 輕度降低；與HFD組相比，HFD-LAC組小鼠的ING 質(zhì)量極顯著增加（P＜ 0.001），EAT 質(zhì)量變化不明顯，因EAT/ING 極顯著降低（P＜ 0.001）。EAT 屬于內(nèi)臟脂肪組織，而ING 屬于皮下脂肪組織，由此提示，在肥胖發(fā)生過程中，乳酸給藥可使得體內(nèi)脂肪分布發(fā)生變化，使得ING 質(zhì)量增加且增大ING分布的比率。

圖4-C 顯示ING 和EAT 組織病理學(xué)結(jié)果，與CON 組相比，HFD 組ING 和EAT 脂肪細(xì)胞面積顯著肥大，形狀呈不規(guī)則圓形，排列較雜亂；CONLAC 組小鼠脂肪細(xì)胞略增大，但形狀規(guī)則、排列緊密；而HFD-LAC 組小鼠過度肥大的脂肪細(xì)胞面積縮小，排列整齊緊密，顯示出一定的改善作用。

Figure 4 Effect of lactate (500 mg/kg, ip) on fat weight and histopathology in mice (±s, n = 8)

3.5 對小鼠ING 脂肪酸代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響（4周預(yù)防實(shí)驗(yàn)）

ING 在全身脂肪分解輸出和合成儲(chǔ)存中具有重要地位。ING 中富含Atgl 和Hsl，它們受某些激素（如腎上腺素、胰高血糖素、前列腺素等）和信號(hào)的調(diào)節(jié)催化TG 水解釋放甘油和游離脂肪酸（free fatty acid, FFA）；而Acc1 和Fas 作為合成脂肪酸關(guān)鍵酶，影響著FFA 的產(chǎn)生。如圖5 所示，與CON 組相比，HFD 組Atgl、Hsl、Fas的mRNA 表達(dá)水平上調(diào)（P＜ 0.01，P＜ 0.001，P＜ 0.05），表明造模4 周階段，HFD 小鼠ING 中脂肪的分解/合成代謝均處于旺盛狀態(tài)。與CON 組相比，CON-LAC 組Atgl表達(dá)下調(diào)（P＜ 0.01），Hsl表達(dá)上調(diào)（P＜ 0.05）；與HFD組相比，HFD-LAC 組Atgl、Hsl、Acc1和Fas表達(dá)水平下調(diào)（P＜ 0.05，P＜ 0.01，P＜ 0.05，P＜ 0.01）。表明乳酸能夠下調(diào)代謝失衡小鼠ING 中脂質(zhì)分解及合成相關(guān)基因，表現(xiàn)為一定的脂質(zhì)代謝抑制特征。

Figure 5 Effect of lactate (500 mg/kg, ip) on the expression of fatty acid metabolism related genes in ING (±s, n = 8)

3.6 對肥胖小鼠體重和攝食量的影響（8 周治療實(shí)驗(yàn)）

如圖6-A 所示，與CON 組相比，HFD 組小鼠體重增加（P＜ 0.05），提示小鼠肥胖；與HFD組相比，LAC-IP 組和LAC-IG 組小鼠自第4 周給藥開始，出現(xiàn)體重減輕，但是未達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異（P＞0.05）。如圖6-B 所示，HFD 組小鼠攝食量明顯高于CON組（P＜ 0.001）； LAC-IP 組和LAC-IG 組小鼠的攝食量低于HFD 組（差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）。結(jié)果表明乳酸能夠改善小鼠肥胖。

Figure 6 Effect of lactate (500 mg/kg, ip and ig) on body weight and food intake in HFD mice (±s, n = 8)

3.7 對肥胖小鼠葡萄糖耐量的影響（8周治療實(shí)驗(yàn)）

如圖7-A，B 所示，與CON 組相比，HFD 組血糖-時(shí)間曲線極顯著抬高（P＜ 0.001），表現(xiàn)為明顯的糖耐量受損。與HFD 組相比，LAC-IG 組的血糖在15，60，120 min 有一定程度的降低（P＜ 0.05，P＜ 0.01，P＜ 0.01），AUC 顯著降低（P＜ 0.01），LAC-IP 組各時(shí)間點(diǎn)的血糖和AUC 下降顯著，表明乳酸能夠改善肥胖小鼠的糖耐量受損，尤其是腹腔注射途徑。

如圖7-C 所示，與CON 組相比，HFD 組葡萄糖注射15 min 內(nèi)的乳酸變化低平，提示葡萄糖轉(zhuǎn)化（糖酵解）受損，未能將攝入的葡萄糖急性轉(zhuǎn)化為乳酸。與HFD 組相比，LAC-IP 和LAC-IG 組15 min內(nèi)的乳酸變化均抬高，表現(xiàn)出對葡萄糖轉(zhuǎn)化（糖酵解）的改善作用。但是，CON，LAC-IP 與LAC-IG 組在30 min 時(shí)間點(diǎn)的乳酸水平均出現(xiàn)大幅度下降，導(dǎo)致AUC 各組間基本接近（圖7-D）。30 min 時(shí)間點(diǎn)的乳酸下降不符合生理現(xiàn)象，可能是實(shí)驗(yàn)中某些因素引起，具體原因尚不明確。

Figure 7 Effect of lactate (500 mg/kg, ip and ig) on glucose tolerance in HFD mice (±s, n = 8)

3.8 對肥胖小鼠胰島素耐量和胰島素抵抗指數(shù)的影響（8周治療實(shí)驗(yàn)）

如圖8 所示，與CON 組相比，HFD 組各時(shí)間點(diǎn)的血糖明顯高于CON 組（P＜ 0.001），且胰島素注射后15 min 內(nèi)降糖速率減弱（P＜ 0.05），提示胰島素耐量受損，此外，HFD 組空腹胰島素水平及胰島素抵抗指數(shù)均顯著升高，總體表現(xiàn)為胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)。與HFD 組相比，LAC-IP和LAC-IG 組小鼠的胰島素耐量顯著降低，同時(shí)空腹胰島素水平及胰島素抵抗指數(shù)也有改善趨勢。

Figure 8 Effect of lactate (500 mg/kg, ip and ig) on insulin tolerance and HOMA-IR in HFD mice (±s, n = 8)

3.9 對肥胖小鼠血生化及肝糖原水平的影響（8周治療實(shí)驗(yàn)）

如圖9 所示，與CON 組相比，HFD 組小鼠空腹血糖極顯著升高（P＜ 0.001），血乳酸、肝糖原、TC和TG 水平均未見顯著變化；LAC-IP 和LAC-IG 組能降低肥胖小鼠空腹血糖（P＜ 0.05，P＜ 0.01），對血乳酸、肝糖原、TC和TG水平未見顯著變化。

3.10 對肥胖小鼠脂肪組織質(zhì)量及組織病理學(xué)的影響（8周治療實(shí)驗(yàn)）

如圖10-A、B 所示，與CON 相比，HFD 組ING和EAT 質(zhì)量均顯著增加（P＜ 0.001），EAT/ING 降低（P＜ 0.05）。與HFD 組相比，LAC-IP 和LAC-IG組小鼠的ING 和EAT 質(zhì)量變化不顯著，LAC-IP 組的EAT/ING 有升高趨勢（P＞0.05）。由此提示，乳酸具有促進(jìn)肥胖小鼠白色脂肪蓄積的趨勢。

如圖10-C 的ING 和EAT 組織病理學(xué)結(jié)果顯示，與CON 組比較，HFD 組ING 和EAT脂肪細(xì)胞面積增大（ING 脂肪細(xì)胞部分增大，而EAT 脂肪細(xì)胞則顯著肥大），形狀呈不規(guī)則圓形，排列較雜亂；乳酸兩種給藥途徑均可進(jìn)一步增大ING 脂肪細(xì)胞，同時(shí)排列規(guī)則整密；而使得過度肥大的EAT 脂肪細(xì)胞面積縮小，排列整齊緊密，這表征了較大的儲(chǔ)脂潛力。由此可見，隨著造模時(shí)間延長，肥胖小鼠ING 和EAT 的脂肪細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)的病變程度有所不同，而乳酸對不同病變程度的改善作用也具有差異化。

Figure 10 Effect of lactate (500 mg/kg, ip and ig) on fat weight and histopathology in HFD mice (±s, n = 8)

3.11 對肥胖小鼠ING 脂肪酸代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響（8周治療實(shí)驗(yàn)）

如圖11 所示，與CON 組相比，HFD 組Atgl、Hsl的mRNA 表達(dá)水平明顯上調(diào)（P＜ 0.01），而Acc1、Fas的mRNA 表達(dá)水平未見明顯變化，表明造模8周階段，HFD 組小鼠ING 中脂肪分解活躍，而脂肪酸合成未見顯著改變。乳酸兩種途徑給藥均可下調(diào)肥胖小鼠Atgl、Hsl的mRNA 表達(dá)水平（P＜ 0.05，P＜ 0.01），對Acc1、Fas的mRNA 表達(dá)水平未見明顯影響，提示乳酸能夠減弱肥胖小鼠ING 的脂肪分解能力。

Figure 11 Effect of lactate (500 mg/kg, ip and ig) on the expression of fatty acid metabolism related genes in ING of HFD mice (±s, n = 8)

4 討 論

生理狀態(tài)下，脂肪組織通過脂解作用可以釋放FFA 和甘油入血，為組織代謝提供能量物質(zhì)；而當(dāng)脂肪組織的脂肪儲(chǔ)存量超過閾值時(shí)，則會(huì)引起脂肪組織代謝障礙，進(jìn)而誘發(fā)肥胖及糖脂代謝失衡。GPR81 是在脂肪組織高表達(dá)的孤兒 G 蛋白偶聯(lián)受體[20]。2008 年，研究發(fā)現(xiàn)乳酸是 GPR81 激動(dòng)劑，通過 GPR81 抑制細(xì)胞內(nèi)cAMP 合成，增強(qiáng)胰島素抗脂解作用，發(fā)揮改善代謝異常的作用[12,21-22]。盡管乳酸通過GPR81 抑制脂解的生理作用已有多項(xiàng)研究證據(jù)，但外源性乳酸是否可以改善肥胖性糖脂代謝失衡，尚未見明確報(bào)道。

在預(yù)防性試驗(yàn)中，乳酸干預(yù)4周能夠改善高脂誘發(fā)的代謝紊亂。8 周的治療性試驗(yàn)結(jié)果也同樣確證了外源乳酸可顯著改善肥胖小鼠的糖脂代謝紊亂。在兩部分試驗(yàn)中，外源性乳酸雖然不能減輕肥胖小鼠的體重，且給藥后部分脂肪組織的質(zhì)量甚至有所增加，但在機(jī)體脂肪分布方面卻均可以對抗模型小鼠的改變。此外，脂肪組織病理學(xué)表明，乳酸給藥可明顯改善脂肪細(xì)胞形態(tài)與分布；不同給藥途徑的乳酸均能顯著下調(diào)脂肪組織中脂解基因的表達(dá)。由此可見，外源性乳酸對于肥胖小鼠脂肪組織的干預(yù)作用，主要表現(xiàn)為抑制脂解，同時(shí)促進(jìn)體內(nèi)脂肪細(xì)胞的儲(chǔ)脂功能，維持機(jī)體脂肪組織健康，減少體內(nèi)異位脂質(zhì)沉積。

高脂飲食帶來體內(nèi)脂代謝亢進(jìn)，一方面直接抑制了大多數(shù)器官組織的糖代謝，另一方面誘發(fā)胰島素抵抗而進(jìn)一步惡化糖代謝功能，最終導(dǎo)致嚴(yán)重的糖脂代謝失衡[23]。著眼于提升及恢復(fù)已經(jīng)被壓低的糖代謝理論上是肥胖性代謝紊亂的有效干預(yù)策略。本實(shí)驗(yàn)中，高脂飼料造模的肥胖小鼠出現(xiàn)明顯的糖代謝障礙，包括空腹血糖升高、糖耐量受損和胰島素抵抗等，不同給藥方案和給藥途徑的乳酸均能顯著改善這些糖代謝障礙，糾正糖脂代謝失衡。簡而言之，乳酸可以促進(jìn)肥胖小鼠的糖脂代謝紊亂向糖脂代謝平衡狀態(tài)轉(zhuǎn)歸，維持機(jī)體健康。

綜上，本研究證實(shí)了外源性乳酸對于高脂飼料誘導(dǎo)小鼠肥胖性代謝失衡的改善作用，主要作用特征為增強(qiáng)糖代謝而抑制脂代謝，同時(shí)維持脂肪細(xì)胞的健康形態(tài)和重塑脂肪組織分布，改善模型小鼠系統(tǒng)性胰島素抵抗。盡管肥胖引起的代謝異常是治療的病理核心，而減重也是肥胖干預(yù)的重要目標(biāo)，本實(shí)驗(yàn)中乳酸給藥在改善代謝障礙的同時(shí)未能減輕肥胖小鼠體重及脂肪組織質(zhì)量，因此尚需進(jìn)一步研究來更加精準(zhǔn)和系統(tǒng)地探究乳酸改善肥胖性代謝失衡的作用機(jī)制及評價(jià)長期療效。或許，基于乳酸代謝調(diào)節(jié)機(jī)制而開發(fā)其結(jié)構(gòu)類似物有望成為代謝失衡性肥胖人群的有效治療藥物。