姚 磊，屈琳琳，范代娣*

（1西北大學(xué)化工學(xué)院，西安 710069；2西北大學(xué)生物醫(yī)藥研究院，西安 710069）

特發(fā)性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一種慢性進(jìn)展的纖維化間質(zhì)性肺炎，其特征是肺功能下降[1]，但是因其病因不明，沒有較好的治療方法，導(dǎo)致患者的病死率較高，平均生存期僅有2 ～ 3 年[2]。此外，在過去的幾十年里，這種疾病的發(fā)病率逐年增加[3]，在治療方法上，臨床主要使用的是激素類藥物、免疫抑制劑和抗氧化類藥物治療IPF[4]，但是效果并不明顯，且長期使用藥物的不良反應(yīng)大[5]。而對于終末期的IPF 患者，最有效的方法是肺移植[6]，但由于供體不足和價格昂貴，在臨床應(yīng)用方面受到了很大的限制。因此，尋找安全高效緩解IPF藥物迫在眉睫。

在中藥中，人參（Panaxginseng）是一種性能優(yōu)良的稀有藥材。它具有療效高、性質(zhì)溫和、不良反應(yīng)小、安全性高等特點，在醫(yī)療保健等方面得到了廣泛的青睞[7]。人參在傳統(tǒng)中草藥體系中有極大的應(yīng)用價值[8]。多項研究證實，人參可以治療多種疾病，如糖尿病[9]、神經(jīng)性疾病[10-11]、腸道潰瘍[12]、炎癥[13]以及各種腫瘤[14-15]。目前已分離的人參主要活性成分有人參皂苷、多肽、多糖、黃酮類化合物等[16-17]，其中人參皂苷含量豐富，活性高，受到廣泛關(guān)注。研究證實，人參總皂苷能夠調(diào)控TGF-β1/Smad信號通路和MMP 途徑改善博來霉素誘導(dǎo)的IPF 模型，其中，人參總皂苷通過下調(diào)金屬蛋白酶-1、MMP-2、MMP-9、Smad2、Smad3 以及TGF-β1，上調(diào)Smad7 的表達(dá)改善IPF[18]；此外，人參皂苷Rg1 可以通過抑制TGF-β1/Smad 途徑緩解煙霧誘導(dǎo)的氣道纖維化[19]；人參皂苷Rg3 可以通過抑制HIF-1α 的核定位來緩解IPF導(dǎo)致的肺功能衰退[20]。

因此，本研究分別通過體內(nèi)外IPF 模型，通過檢測羥脯氨酸（hydroxyproline，HYP）含量及纖維化相關(guān)基因表達(dá)量探究稀有人參皂苷對IPF的影響。

1 材 料

1.1 試 劑

注射用博來霉素（bleomycin，BLM，批號：H20055883，瀚輝制藥有限公司）；HYP 試劑盒（貨號：BC0255，北京索萊寶科技有限公司）；轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor，TGF- β1，美國Pepro Tech 公司）；Trizol、第一鏈反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Thermo Fisher 公司）；氯仿、異丙醇（阿拉丁控股集團(tuán)有限公司）；qPCR 試劑盒（瑞士Roche 公司）；稀有人參皂苷Rk1、Rk3、Rh4、Rg5（純度≥98%，通過HPLC 與標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行對比）由西北大學(xué)生物醫(yī)藥研究院提供。

1.2 儀 器

TS100 倒置熒光顯微鏡（日本Nikon 公司）；TGL16-WS 臺式高速離心機(jī)（美國貝克曼公司）；PS100 超聲波清洗機(jī)（寧波恒大設(shè)備公司）；XS2 酶標(biāo)儀（美國BioTek 公司）；TEC2800 石蠟包埋機(jī)（上海精密儀器儀表公司）；YD-1508A 組織切片機(jī)（北京佳源興業(yè)科技有限公司）。

1.3 細(xì)胞與動物

人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5（上海富恒生物科技有限公司）； SPF 級C57BL/6 小鼠，雄性，周齡為6 ～ 8周，體重（20 ± 2）g，購自江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司。本課題中動物實驗嚴(yán)格按照《中華人民共和國動物倫理指南》操作，獲西北大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號：NWU-AWC-20220903M）。

2 方 法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與IPF模型建立

MRC-5 細(xì)胞在MEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，二氧化碳培養(yǎng)箱設(shè)置為37 ℃、5% CO2和95%濕度，每2天傳代1次，傳代比例為1∶2。

使用轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1，10 ng/mL）處理MRC-5細(xì)胞24 h，誘導(dǎo)建立特發(fā)性肺纖維化模型。

2.2 MTT法檢測細(xì)胞毒性

將細(xì)胞收集后使用血細(xì)胞計數(shù)板進(jìn)行計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度至每毫升1 × 105個細(xì)胞，將調(diào)整好濃度的細(xì)胞懸液均勻鋪在96孔板中，布板結(jié)束后，放入37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 后，將稀有人參皂苷單體粉末進(jìn)行溶解、稀釋，加入96 孔板中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。去除培養(yǎng)液，隨后向每孔加入MTT 溶液150μL，放入培養(yǎng)箱孵育2 ～ 4 h，孵育結(jié)束后，去除MTT 溶液，隨后向每孔加入二甲基亞砜（DMSO）溶液150 μL，使用酶標(biāo)儀測量490 nm 的波長下的吸收度。

2.3 IPF小鼠模型的建立及分組處理

100 只SPF 級雄性C57BL/6 小鼠隨機(jī)分組，每組10只。分別為對照組、BLM 組（35 IU/g）、低劑量Rk1（60 mg/kg）+BLM 組、高劑量Rk1（120 mg/kg）+BLM 組、低劑量Rk3（60 mg/kg）+BLM 組、高劑量Rk3（120 mg/kg）+BLM 組、低劑量Rh4（60 mg/kg）+BLM 組、高劑量Rh4（120 mg/kg）+BLM 組、低劑量Rg5（60 mg/kg）+BLM 組、高劑量Rg5（120 mg/kg）+BLM 組。除對照組外其余小鼠均腹腔注射BLM（35 IU/g）28 d 以構(gòu)建IPF 模型[21]。對照組采用同等劑量生理鹽水腹腔注射。造模開始第2 天治療組通過灌胃的方式給予稀有人參皂苷，對照組和模型組分別灌胃生理鹽水。連續(xù)灌胃給藥28 d 后處死小鼠，取小鼠肺臟組織，經(jīng)液氮快速冷凍后移至-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 小鼠肺組織病理學(xué)檢查

將動物實驗小鼠的肺臟組織解剖后放入多聚甲醛中進(jìn)行固定，48 h 后使用不同濃度的乙醇處理，去除肺臟中的水分。將組織中的水分去除干凈后，利用二甲苯溶液處理組織，使其浸透過夜。將已經(jīng)泡到透明的組織浸于提前預(yù)熱融化的石蠟中，進(jìn)行浸蠟處理，隨后放入包埋石蠟中，進(jìn)行包埋處理，包埋完成后即進(jìn)行切片。

對切片組織使用二甲苯溶液進(jìn)行脫蠟處理，脫蠟結(jié)束后用清水沖洗，隨后利用蘇木精染色試劑進(jìn)行染色處理，染色時長為10 min。結(jié)束染色后，再次利用清水進(jìn)行沖洗，沖洗后進(jìn)行脫水處理。脫水處理后，使用伊紅染色液對切片進(jìn)行染色，染色時長為5 min。再次脫水，透明，封片。放入通風(fēng)櫥進(jìn)行風(fēng)干，待風(fēng)干完全后即可于光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察。

2.5 HYP含量測定

對于動物組織樣本，稱取樣本0.2 g 于玻璃管，將組織盡量剪碎以便消化，加入提取液2 mL；對于細(xì)胞樣本，計數(shù)后收集細(xì)胞5 × 106個，加入提取液1 mL。隨后將其放入沸水中，消化至沒有可見大的團(tuán)塊，冷卻后用NaOH（10 mol/L）調(diào)節(jié)pH 至6 ～ 8，使用蒸餾水定容至4 mL。最后放入離心機(jī)（4 ℃、12 000 r/min），離心20 min，取上清液待測。依照說明書分別稀釋標(biāo)準(zhǔn)品與樣品，利用酶標(biāo)儀測量490 nm下的吸收度。

2.6 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）

對于細(xì)胞樣本，向處理后的MRC-5 細(xì)胞每孔加入Trizol 溶液1 mL，在冰上裂解5 ～ 10 min，隨后轉(zhuǎn)移至無酶EP 管；對于組織樣本，取小鼠肺部組織50 mg 于研磨管中，加入研磨珠3 ～ 5 顆，向管中加入Trizol 溶液1 mL 放入研磨機(jī)中。隨后放入25 ℃水浴鍋中進(jìn)行水浴5 ～ 10 min，向管中加入氯仿200 μL，混勻后再次25 ℃水浴10 min，水浴后放入離心機(jī)（4 ℃、12 000 r/min）離心15 min，收集上層液相350 μL 至新的EP 管中，加入異丙醇500 μL，混勻后25 ℃水浴10 min，隨后放入離心機(jī)（4 ℃、12 000 r/min）離心15 min，棄去上清液，加入提前用無菌無酶水配置的75%乙醇，混勻后25 ℃水浴5 min，放入離心機(jī)（4 ℃、7 000 r/min）離心5 min，棄去上清液，風(fēng)干后加無菌無酶水溶解。隨后使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將提出來的RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用cDNA 進(jìn)行RT-qPCR 實驗，所得到的Cq 用2-ΔΔCT法計算，選用GAPDH 作為內(nèi)參，目標(biāo)基因引物和內(nèi)參基因引物序列如表1所述。

Table 1 RT-qPCR primer sequences

2.7 統(tǒng)計學(xué)分析

使用GraphPad Prism 9.0 和IBM SPSS Statistics 21.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。所有實驗獨立重復(fù)3 次，實驗結(jié)果以±s的形式表示。P＜ 0.05 即認(rèn)為結(jié)果具有顯著性，有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果與分析

3.1 稀有人參皂苷細(xì)胞模型濃度篩選

通過二苯基四氮唑溴鹽比色法分析4 種稀有人參皂苷對MRC-5的細(xì)胞毒性，結(jié)果見圖1。由圖1可知，當(dāng)人參皂苷Rk1、Rk3、Rh4和Rg5濃度小于0.5 μmol/L 時，MRC-5 細(xì)胞的活力大于90%，因此后續(xù)細(xì)胞實驗人參皂苷使用濃度為0.5 μmol/L。

Figure 1 Effects of concentrations of rare ginsenosides (Rk1, Rk3,Rh4, Rg5) on the viability of MRC-5 cells (±s, n = 3)

3.2 對BLM 誘導(dǎo)的IPF 小鼠肺組織病理變化的影響

小鼠肺組織切片染色結(jié)果如圖2所示，對照組小鼠的肺臟組織支氣管結(jié)構(gòu)無明顯異常，肺泡壁由單層上皮細(xì)胞組成，結(jié)構(gòu)清晰，肺泡壁沒有出現(xiàn)增厚，肺泡腔內(nèi)無明顯滲出物，也沒有明顯的炎癥細(xì)胞浸潤；肺間質(zhì)包括肺內(nèi)結(jié)締組織及血管等均無明顯異常；與對照組相比，BLM 組小鼠肺間質(zhì)較多結(jié)締組織增生，肺泡壁出現(xiàn)明顯增厚現(xiàn)象，肺泡結(jié)構(gòu)不清，伴有粒細(xì)胞浸潤；可見血管周圍淋巴細(xì)胞灶性浸潤；支氣管上皮細(xì)胞變性。通過灌胃給予稀有人參皂苷后，可以發(fā)現(xiàn)IPF 小鼠的肺泡壁破壞有所改善，淋巴細(xì)胞浸潤減少，巨噬細(xì)胞與粒細(xì)胞數(shù)量顯著減少。其中Rh4的效果最為顯著。

Figure 2 Lung sections of mice at day 28 after bleomycin (BLM) induction (HE staining)

3.3 對肺纖維化模型中HYP含量的影響

小鼠肺組織HYP 含量結(jié)果如圖3 所示，BLM組與對照組相比，BLM 誘導(dǎo)的小鼠肺組織中的HYP 含量顯著提高，給予人參皂苷后，HYP 含量顯著降低。其中，Rh4 降低IPF 模型中的HYP 含量的效果最明顯。

Figure 3 Effects of different concentrations of rare ginsenosides(Rk1, Rk3, Rh4, Rg5) on HYP content in lung tissue of IPF mice after BLM modeling (±s, n = 3)

3.4 對IPF纖維化相關(guān)基因表達(dá)的影響

使用TGF-β1 誘導(dǎo)MRC-5 構(gòu)建細(xì)胞IPF 模型。MRC-5 細(xì)胞中IPF 相關(guān)基因表達(dá)量如圖4。由圖4可知，TGF-β1 組與對照組相比，TGF-β1 誘導(dǎo)的MRC-5細(xì)胞中COL1A1、纖維連接蛋白與α-SMA 的mRNA 表達(dá)量明顯增加；Rk1, Rk3, Rh4, Rg5 組與TGF-β1 組相比，4 種人參皂苷均可以降低MRC-5細(xì)胞中COL1A1、纖維連接蛋白與α-SMA 的mRNA表達(dá)量；其中Rh4組的效果最為顯著。

Figure 4 Effect of rare ginsenosides (Rk1, Rk3, Rh4, Rg5) on the expression level of fibrosis-related genes in IPF of MRC-5 after TGF-β 1 modeling (±s, n = 3)

使用腹腔注射BLM 構(gòu)建小鼠IPF 模型,小鼠肺組織中IPF 相關(guān)基因表達(dá)量如圖5。由圖5 可知，BLM組與對照組相比，BLM誘導(dǎo)的IPF小鼠肺部組織中COL1A1、纖維連接蛋白與α-SMA 的mRNA 表達(dá)量增加；Rk1, Rk3, Rh4, Rg5 組與BLM 組相比，加入人參皂苷后顯著降低了COL1A1、纖維連接蛋白與α-SMA 的mRNA 表達(dá)量。其中Rh4 組的效果最為顯著。

Figure 5 Effect of rare ginsenosides (Rk1, Rk3, Rh4, Rg5) on IPFrelated mRNA expression in lung tissue of mice after BLM modeling(±s, n = 3)

3.5 對IPF炎癥相關(guān)基因表達(dá)的影響

使用TGF-β1 誘導(dǎo)MRC-5 構(gòu)建細(xì)胞IPF 模型。MRC-5 細(xì)胞中IPF 的炎癥相關(guān)基因表達(dá)量如圖6。由圖6可知，TGF-β1組與對照組相比，TGF-β1誘導(dǎo)的MRC-5 細(xì)胞中IL-6 和TNF-α 的mRNA 表達(dá)量明顯增加；Rk1, Rk3, Rh4, Rg5 組與TGF-β1 組相比，4 種人參皂苷均可以降低MRC-5 細(xì)胞中IL-6 和TNF-α 的mRNA 表達(dá)量；其中Rh4 組的效果最為顯著。

Figure 6 Effect of rare ginsenosides (Rk1, Rk3, Rh4, Rg5) on expression levels of inflammatory genes in IPF in MRC-5 modeled by TGF-β1（±s, n = 3)

使用腹腔注射BLM 構(gòu)建小鼠IPF 模型,小鼠肺組織中IPF 的炎癥相關(guān)基因表達(dá)量如圖7。由圖7可知，BLM 組與對照組相比，BLM 誘導(dǎo)的IPF 小鼠肺部組織中IL-6 和TNF-α 的mRNA 表達(dá)量增加；Rk1, Rk3, Rh4, Rg5 組與BLM 組相比，加入人參皂苷后顯著降低了IL-6和TNF-α的mRNA表達(dá)量。

Figure 7 Effect of rare ginsenosides (Rk1, Rk3, Rh4, Rg5) on expression levels of inflammatory genes in IPF in MRC-5 modeled by BLM(±s, n = 3)

3.6 對IPF凝血級聯(lián)相關(guān)基因表達(dá)的影響

使用TGF-β1 誘導(dǎo)MRC-5 構(gòu)建細(xì)胞IPF 模型。MRC-5 細(xì)胞中IPF 的凝血級聯(lián)相關(guān)基因表達(dá)量如圖8。由圖8 可知，TGF-β1 組與對照組相比，TGFβ1 誘導(dǎo)的MRC-5 細(xì)胞中Factor X 和plasminogen 的mRNA 表達(dá)量明顯增加；Rk1, Rk3, Rh4, Rg5 組與TGF-β1 組相比，4 種人參皂苷均可以降低MRC-5細(xì)胞中Factor X 和plasminogen的mRNA表達(dá)量；其中Rh4組的效果最為顯著。

Figure 8 Effect of rare ginsenosides (Rk1, Rk3, Rh4, Rg5) on coagulation cascade mRNA expression in lung tissue of mice after TGF-β1 modeling (±s, n = 3)

使用腹腔注射BLM 構(gòu)建小鼠IPF 模型,小鼠肺組織中IPF的凝血級聯(lián)相關(guān)基因表達(dá)量如圖9。由圖9 可知，BLM 組與對照組相比，BLM 誘導(dǎo)的IPF小鼠肺部組織中Factor X 和plasminogen 的mRNA表達(dá)量增加；Rk1, Rk3, Rh4, Rg5 組與BLM 組相比，加入人參皂苷后顯著降低了Factor X 和plasminogen的mRNA表達(dá)量。

Figure 9 Effect of rare ginsenosides (Rk1, Rk3, Rh4, Rg5) on coagulation cascade mRNA expression in lung tissue of mice after BLM modeling (±s, n = 3)

4 討論與結(jié)論

本研究的IPF 模型采用腹腔注射BLM（35 IU/g）28 d[21]，建模完成后，通過HE 染色可知，BLM 誘導(dǎo)的IPF 小鼠肺部組織的肺泡壁增厚，伴有粒細(xì)胞浸潤，以及淋巴細(xì)胞灶性浸潤等，這與IPF 的病理進(jìn)程基本一致，表明IPF 模型建立成功，然而加入稀有人參皂苷后，IPF 引起的肺泡結(jié)構(gòu)破壞等病理進(jìn)程得到了緩解。

HYP 作為膠原纖維的標(biāo)志性水解產(chǎn)物，HYP的含量可以直接反應(yīng)膠原的沉積情況，膠原蛋白的過度沉積是纖維化疾病的主要特征。因為HYP是膠原所特有的氨基酸，約占膠原氨基酸總量的13%，利用生物化學(xué)法（如比色法和高效液相色譜法）測定組織中HYP 的總含量已經(jīng)成為纖維化嚴(yán)重程度評價最常用的方法，該方法在2017 年被美國胸科協(xié)會確立為肺纖維化臨床前評價的重要標(biāo)準(zhǔn)[22]。本研究通過測定發(fā)現(xiàn)，TGF-β1 組的MRC-5細(xì)胞與BLM組的小鼠肺部組織中HYP含量顯著增加，加入稀有人參皂苷后，HYP含量顯著降低。

研究發(fā)現(xiàn)，凝血級聯(lián)（coagulation cascade）指的是在受損的血管處產(chǎn)生纖維蛋白進(jìn)而防止失血過度[23]。在傷口愈合的初期，內(nèi)皮與上皮損傷均可以激活凝血級聯(lián)反應(yīng)，從而產(chǎn)生凝血酶，緊接著凝血酶使血清中的纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白[24]。研究證明，凝血級聯(lián)與IPF 患者肺部組織中的纖維蛋白沉積關(guān)系密切，在IPF 患者肺部組織中發(fā)現(xiàn)外源性凝血級聯(lián)和纖溶酶的幾種酶原（Factor X、plasminogen）被激活[25]。研究表明，IPF 患者的肺泡灌洗液中促凝血因子增加，導(dǎo)致ECM 沉降減少[26]；同時蛋白酶激活受體誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞分化為肌成纖維細(xì)胞，從而加劇了IPF。本研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1 誘導(dǎo)的MRC-5細(xì)胞與BLM 誘導(dǎo)的小鼠肺部組織中纖維化相關(guān)蛋白基因（如：COL1A1、α-SMA 和纖維連接蛋白）、炎癥相關(guān)基因（如：IL-6和TNF-α）和凝血級聯(lián)相關(guān)基因（如：Factor X 和plasminogen）的表達(dá)量均有明顯增加，加入稀有人參皂苷后，纖維連接蛋白、COL1A1、α-SMA、IL-6、TNF-α、Factor X 和plasminogen的基因表達(dá)量均有明顯下降。

綜上所述，稀有人參皂苷（Rk1、Rk3、Rh4、Rg5）均可以通過降低HYP 含量，下調(diào)纖維連接蛋白、COL1A1、α-SMA、IL-6、TNF-α、Factor X 和plasminogen 的基因表達(dá)緩解IPF。其中，稀有人參皂苷Rh4 的效果最為顯著。本研究為稀有人參皂苷緩解IPF 進(jìn)程提供了理論依據(jù)，并為今后的臨床應(yīng)用提供了需要改進(jìn)的方向和數(shù)據(jù)支持。