黃昌興

摘 要：建立了高效液相色譜-熒光法測(cè)定水產(chǎn)品中孔雀石綠和隱色孔雀石綠的方法。樣品經(jīng)乙腈超聲提取、硼氫化鉀還原、離心、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)及中性氧化鋁柱凈化后，經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾，濾液經(jīng)液相色譜柱分離，熒光檢測(cè)器檢測(cè)，外標(biāo)法定量。結(jié)果表明，孔雀石綠和隱色孔雀石綠在1.0～20.0 μg·mL-1均具有很好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)≥0.999 8，檢出限為0.5 μg·kg-1，定量限為1.5 μg·kg-1，加標(biāo)回收率為88.1%～96.6%，RSD為0.9%～3.8%。

關(guān)鍵詞：孔雀石綠；水產(chǎn)品；液相色譜；熒光法

Determination of Malachite Green and Its Metabolites in Aquatic Products by High Performance Liquid Chromatography

HUANG Changxing

（Shantou Inspection and Testing Center， Shantou 515041， China）

Abstract： A method for the determination of malachite green and leucomalachite green in aquatic products by high performance liquid chromatography with fluorescence detection was established. After ultrasonic extraction with acetonitrile， reduction with potassium borohydride， centrifugation， rotary evaporation， purification with neutral aluminum oxide column， the sample is filtered by microporous membrane， and the filtrate is separated by liquid chromatography column， detected by fluorescence detector， and quantified by external standard method. The results showed that malachite green and leucomalachite green showed good linearity in the range of 1.0～20.0 μg·mL-1 with the correlation coefficients ≥0.999 8， the limits of detection of 0.5 μg·kg-1 and the limits of quantification of

1.5 μg·kg-1， and the recoveries of spiked standards ranged from 88.1% to 96.6% with the RSD of 0.9%～3.8%.

Keywords： malachite green; aquatic products; liquid chromatography; fluorimetry

孔雀石綠（Malachite Green，MG），別名孔雀綠、孔雀綠草酸鹽、堿性綠、草酸孔雀石綠等，是人工合成的一種三苯甲烷類(lèi)化學(xué)物，可殺真菌、細(xì)菌、寄生蟲(chóng)，因其對(duì)養(yǎng)殖水域中的水霉病、鰓霉病、小瓜蟲(chóng)病和寄生蟲(chóng)病等具有良好的療效，被作為殺菌劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)廣泛使用[1-2]?？兹甘G在魚(yú)體內(nèi)代謝為隱色孔雀石綠（Leucomalachite Green，LMG），其毒性強(qiáng)于母體孔雀石綠，有強(qiáng)烈的致畸胎、致突變、致癌作用。2002年原農(nóng)業(yè)部頒布的《食品動(dòng)物禁用的獸藥及其化合物清單》已明文規(guī)定孔雀石綠禁止用于所有食品動(dòng)物。

水產(chǎn)品是汕頭當(dāng)?shù)鼐用窠?jīng)常食用的食品，水產(chǎn)品養(yǎng)殖更是當(dāng)?shù)氐膫鹘y(tǒng)海洋產(chǎn)業(yè)之一。因此強(qiáng)化水產(chǎn)品質(zhì)量安全對(duì)于保障消費(fèi)者生命健康、促進(jìn)水產(chǎn)品養(yǎng)殖業(yè)繁榮發(fā)展均具有重要意義。目前，MG及其代謝物L(fēng)MG的檢測(cè)方法主要包括分光光度法、酶聯(lián)免疫法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）、高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）、液質(zhì)聯(lián)用法（Liquid Chromatography-Mass Spectrometer，LC-MS）等[3-5]，其中HPLC因檢測(cè)成本低、儀器普及率高而被基層檢測(cè)機(jī)構(gòu)廣泛采用。本文建立了高效液相色譜-熒光法檢測(cè)水產(chǎn)品中MG及其代謝物L(fēng)MG的方法，以期簡(jiǎn)化樣品前處理過(guò)程，提高基層檢測(cè)機(jī)構(gòu)的檢測(cè)效率和準(zhǔn)確度。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

1200型液相色譜-熒光檢測(cè)器：美國(guó)Agilent安捷倫公司；HX-4型均質(zhì)器：山東歐萊博醫(yī)療器械有限公司；TG16G型離心機(jī)：常州市億能實(shí)驗(yàn)儀器廠；VOKTEX型渦旋混勻器：海門(mén)市貝爾儀器制造有限公司；SN-RE-201D型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海尚儀儀器設(shè)備有限公司；固相萃取裝置：德國(guó)CNW公司；PRS固相萃取柱：500 mg/3 mL；中性氧化鋁固相萃取柱：1 g/3 mL。

孔雀石綠和隱色孔雀石綠，純度≥98%，購(gòu)自德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司；甲醇、乙腈：均為色譜純；鹽酸羥胺、乙酸、對(duì)甲苯磺酸、二甘醇和硼氫化鉀，均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱(chēng)取適量的MG或LMG標(biāo)準(zhǔn)品，用適量甲醇溶解并定容，配制成濃度為100 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，4 ℃避光保存。

1.3 樣品前處理

1.3.1 提取

水產(chǎn)品去鱗、去骨、去皮，沿著背脊取可食用部分，粉碎；準(zhǔn)確稱(chēng)取樣品5.0 g（精度0.1 mg）于

50 mL離心管內(nèi)，依次加入0.1 mol·L-1乙酸銨緩沖液

5.0 mL、20%鹽酸羥胺1.5 mL、1.0 mol·L-1對(duì)甲苯磺酸2.5 mL，用勻質(zhì)機(jī)以10 000 r·min-1的速度均質(zhì)30 s，加入10 mL乙腈渦旋振蕩60 s；加入酸性氧化鋁10 g，渦旋振蕩30 s，6 000 r·min-1離心5 min；上清液中加入二甘醇10 mL、乙腈10 mL，渦旋振蕩30 s，6 000 r·min-1離心5 min；上清液加入1 mL硼氫化鉀、15 mL二氯甲烷，渦旋振蕩30 s，6 000 r·min-1離心5 min，收集下層二氯甲烷溶液；殘?jiān)屑尤?0 mL二氯甲烷重復(fù)提取一次，合并二氯甲烷溶液；45 ℃水浴下氮吹濃縮至近干，用5 mL乙腈充分溶解殘?jiān)?，待凈化?/p>

1.3.2 凈化

將中性氧化鋁固相萃取柱與PRS固相萃取柱連接，PRS固相萃取柱安裝在固相萃取裝置上，用

5 mL乙腈活化萃取柱后，將待凈化樣品溶液轉(zhuǎn)移至中性氧化鋁SPE小柱中凈化，棄去流出液；依次加入2 mL初始流動(dòng)相、1 mL鹽酸羥胺甲醇溶液洗脫P(yáng)RS柱，洗脫液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，濾液供HPLC測(cè)定。

1.4 液相色譜條件

色譜柱：Silversil C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-5 mmol·L-1乙酸銨溶液（82∶18）；進(jìn)樣量：10 μL；流速：1.0 mL·min-1；激發(fā)波長(zhǎng)：265 nm；發(fā)射波長(zhǎng)：360 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

2.1.1 提取與凈化

結(jié)合MG和LMG的理化性質(zhì)，比較了乙酸鈉緩沖溶液、乙腈、甲醇、二氯甲烷等有機(jī)溶劑對(duì)水產(chǎn)品中MG和LMG的萃取效率；比較了酸性氧化鋁、中性氧化鋁、堿性氧化鋁對(duì)水產(chǎn)品中MG和LMG的凈化效果。結(jié)果表明，乙腈對(duì)MG和LMG具有良好的萃取效率，加標(biāo)回收率在93.4%～97.8%；堿性和酸性氧化鋁會(huì)吸附目標(biāo)化合物而降低萃取率，而中性氧化鋁固相萃取柱凈化，可有效去除提取液中酸性雜質(zhì)，消除水產(chǎn)品中油脂和基體的干擾，凈化效果好，基質(zhì)干擾小，可有效保護(hù)色譜柱和檢測(cè)器。

2.1.2 流動(dòng)相的選擇

比較了甲醇-乙酸銨溶液、乙腈-乙酸銨溶液、四丁基溴化鈉-乙腈或甲醇等不同流動(dòng)相種類(lèi)或比例對(duì)MG及其代謝物L(fēng)MG的色譜分離效果。結(jié)果顯示，以乙腈-乙酸銨水溶液作為流動(dòng)相時(shí)，MG和LMG可獲得更好的分離效果，且響應(yīng)信號(hào)強(qiáng)，這可能是由于MG及LMG易于在乙腈中溶解，且乙酸銨作為緩沖溶液可提供合適的pH，從而促進(jìn)其生成正離子；當(dāng)乙酸銨濃度為5 mmol·L-1時(shí)，MG及其代謝物L(fēng)MG可有效分離，峰形尖銳且對(duì)稱(chēng)，出峰時(shí)間適中且相對(duì)穩(wěn)定，基線穩(wěn)定且基質(zhì)干擾少，色譜圖見(jiàn)圖1。

2.2 線性關(guān)系及檢出限

配制MG和LMG質(zhì)量濃度為0 μg·mL-1、

1.0 μg·mL-1、2.0 μg·mL-1、5.0 μg·mL-1、10.0 μg·mL-1和20.0 μg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按本文建立的HPLC法進(jìn)行測(cè)定，以MG和LMG響應(yīng)值為縱坐標(biāo)，以MG和LMG質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示，在1.0～20.0 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)，GM的線性關(guān)系方程為y=0.315 7x+0.032 25，相關(guān)系數(shù)r為0.999 8；LGM的線性關(guān)系方程為y=

0.421 3x+0.024 86，相關(guān)系數(shù)r為0.999 9，這表明MG和LMG均具有很好的線性關(guān)系。

在空白水產(chǎn)品樣品中添加濃度為0.1 μg·kg-1、

0.5 μg·kg-1、1.0 μg·kg-1、1.5 μg·kg-1、5.0 μg·kg-1和10.0 μg·kg-1的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，以3倍信噪比（S/N）作為方法檢出限，10倍信噪比為方法定量限。結(jié)果顯示，該方法MG和LMG的檢出限為

0.5 μg·kg-1，定量限為1.5 μg·kg-1。

2.3 方法回收率和精密度

分別對(duì)秋刀魚(yú)、對(duì)蝦和螃蟹空白樣品進(jìn)行MG和LMG低、中、高3個(gè)水平的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，按本文建立的檢測(cè)方法進(jìn)行測(cè)定，回收率和精密度（RSD）見(jiàn)表1。結(jié)果顯示，MG和LMG在3個(gè)加標(biāo)水平下的平均回收率為88.1%～96.6%，RSD為0.9%～3.8%，表明本方法具有較好的準(zhǔn)確度和精密度。

2.4 實(shí)際樣品檢測(cè)

采用本方法對(duì)市售的對(duì)蝦、螃蟹、鯽魚(yú)等10份水產(chǎn)品逐個(gè)進(jìn)行MG和LMG含量檢測(cè)，均未檢出MG和LMG殘留，說(shuō)明所檢10份水產(chǎn)品在養(yǎng)殖過(guò)程中均未使用孔雀石綠藥物。

3 結(jié)論

本文建立了水產(chǎn)品中MG和LMG的高效液相色譜-熒光法測(cè)定方法。水產(chǎn)品經(jīng)乙腈超聲提取及中性氧化鋁柱凈化后，用液相色譜-熒光檢測(cè)器檢測(cè)。結(jié)果表明，MG和LMG在1.0～20.0 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)，均具有很好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)≥0.999 8；檢出限為0.5 μg·kg-1，定量限為1.5 μg·kg-1；加標(biāo)回收率為88.1%～96.6%，RSD為0.9%～3.8%。該方法具有較好的準(zhǔn)確度和精密度，可滿(mǎn)足水產(chǎn)品中MG和LMG含量測(cè)定。

參考文獻(xiàn)

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