宋蘇堤，魏 芳，李帥兵，符 璐，盧建雄，張國華

（ 西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730124 ）

轉(zhuǎn)錄因子過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）對細(xì)胞分化和脂質(zhì)代謝起到重要調(diào)控作用。與其他核激素受體轉(zhuǎn)錄因子相同，PPARγ具有C-端配體結(jié)合域（LBD），與配體結(jié)合后被激活，結(jié)合到特定的DNA 序列過氧化物酶體增殖物反應(yīng)元件（PPREs）反式激活靶基因轉(zhuǎn)錄。研究表明，PPARγ調(diào)控包括脂肪形成、脂肪儲(chǔ)存、脂肪因子分泌和胰島素敏感性在內(nèi)的多個(gè)生物學(xué)過程，是調(diào)控脂肪細(xì)胞分化的核心調(diào)控因子[1]，具有調(diào)節(jié)脂肪合成、糖脂代謝和細(xì)胞增殖分化等生物學(xué)功能[2]。

選擇性剪接（AS）是真核生物基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的重要機(jī)制，可對基因表達(dá)譜進(jìn)行重新編程，增加轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組的多樣性。研究發(fā)現(xiàn)，PPARγ外顯子5跳躍是一種自然發(fā)生的選擇性剪接事件[3]。PPARγ基因外顯子6含有絲氨酸/精氨酸富集剪接因子1（SRSF1）的結(jié)合位點(diǎn)[4]，SRSF1與PPARγ外顯子6結(jié)合有助于其前體mRNA跳過外顯子5發(fā)生選擇性剪接并產(chǎn)生亞型PPARγΔ5[3]。在人類皮下和內(nèi)臟脂肪組織、脂肪細(xì)胞等均檢出PPARγΔ5表達(dá)，參與脂肪細(xì)胞分化及生脂調(diào)控[5]。豬脂肪組織高水平表達(dá)PPARγ3，是脂肪細(xì)胞分化的主要調(diào)控因子，其編碼基因與人PPARγ 基因均由7 個(gè)外顯子組成，具有很高的同源性。但豬機(jī)體組織是否也存在PPARγ 前體mRNA 外顯子5 跳躍的選擇性剪接及其可能的作用機(jī)制尚不清楚。本研究在檢測分析豬組織器官PPARγΔ5 表達(dá)的基礎(chǔ)上，利用生物信息學(xué)方法比較分析豬PPARγΔ5及PPARγ蛋白生物信息特征，為深入了解豬脂肪形成的調(diào)控機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

選取健康的180 d“杜×大×長”三元雜交豬6頭，體重為（88.71±2.53） kg，由蘭州瑞源農(nóng)業(yè)科技有限公司提供。禁食12 h，屠宰，立即采集心臟、肝臟、皮下脂肪組織和背最長肌，磷酸緩沖液（PBS）沖洗后放入液氮中凍存。

1.2 RNA提取及cDNA合成

TRIzol 法分別提取豬各組織總RNA。以提取的總RNA為模板，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，-20 ℃保存。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

以豬PPARγ mRNA序列（NM_214379.1）為模板，分別在PPARγ 基因外顯子4 和5 的序列內(nèi)設(shè)計(jì)PPARγ PCR 擴(kuò)增引物，在外顯子3 內(nèi)和外顯子4 與6 的連接處序列設(shè)計(jì)PPARγΔ5 引物。PPARγΔ5 實(shí)時(shí)熒光PCR 擴(kuò)增引物序列為F：5'-GG-GATAAAGCCTCGGGGTTC-3'；R：5'-ACAAAGGGCGT-TATGAGACAT-3'；產(chǎn)物長度212 bp。PPARγ 引物為F：5'-TTATTGACCCAGAAAGCG-3'；R：5'-AGGATTTCATACCGCAGG-3'；產(chǎn)物長度88 bp。β-actin（DQ845171.1）為內(nèi)參基因，引物序列為F：5'-AGG-CCAACCGTGAGAAGATG-3'；R：5'-CATGACAATGCCAGTGGTGC-3'；產(chǎn)物長度122 bp。引物由湖南艾科瑞生物工程有限公司合成。

1.4 實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增

使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，操作按生產(chǎn)商使用說明書進(jìn)行。以β-actin為內(nèi)參基因，用2-△△Ct法計(jì)算PPARγ和PPARγΔ5相對表達(dá)量。

1.5 生物信息學(xué)分析

利用NCBI 的BLAST 功能，比對豬PPARγ3 mRNA（NM_214379.1）和PPARγ 基因序列，獲得外顯子5跳躍的PPARγΔ5 mRNA序列，在線程序分析PPARγ蛋白序列。

使用在線預(yù)測軟件ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）分析PPARγ 和PPARγΔ5 蛋白理化性質(zhì)；使用ProtScale（https: //web.expasy.org/protscale/）分析蛋白親疏水性；使用SOPMA（https: //npsa-prabi.ibcp.fr/）進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測；使用SWISS-MODEL（https: //swissmodel.expasy.org/）進(jìn)行三級結(jié)構(gòu)預(yù)測；使用TMHMM（http: //www.cbs.dtu.dk/services/ TMHMM/）分析跨膜結(jié)構(gòu)域；使用SignalP-5.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預(yù)測信號肽；使用PSORT Ⅱ Prediction （https: // psort.hgc.jp/form2.html）分析亞細(xì)胞定位；使用NetPhos（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）分析磷酸化位點(diǎn)。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析，Duncan's 法進(jìn)行多重比較。結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 PPARγ 和PPARγΔ5在豬不同組織中的表達(dá)、相關(guān)性分析（見圖1、圖2）

圖1 PPARγ和PPARγΔ5在豬不同組織中的表達(dá)Fig.1 Expression of PPARγ and PPARγΔ5 in different tissues of pigs

圖2 PPARγ和PPARγΔ5在豬不同組織中表達(dá)的相關(guān)性分析Fig.2 Correlation analysis of PPARγ and PPARγΔ5 expression in different tissues of pigs

由圖1、圖2可知，在豬心臟、肝臟、皮下脂肪組織和背最長肌中均檢測到PPARγΔ5 和PPARγmRNA 表達(dá)，表達(dá)水平依次為皮下脂肪組織、背最長肌、肝臟和心臟，PPARγΔ5 和PPARγmRNA 表達(dá)水平差異極顯著（P＜0.01）。各組織PPARγΔ5mRNA 表達(dá)均極顯著低于PPARγ（P＜0.01），且二者顯著正相關(guān)（P＜0.05）。

2.2 PPARγ 和PPARγΔ5蛋白理化性質(zhì)及氨基酸組成（見圖3、表1）

表1 PPARγ和PPARγΔ5蛋白的氨基酸組成Tab.1 Amino acid composition of PPARγ and PPARγΔ5 proteins

圖3 PPARγ和PPARγΔ5蛋白親疏水性分析Fig.3 Hydrophilic analysis of PPARγ and PPARγΔ5 proteins

采用ProtParam 在線軟件預(yù)測表明，PPARγ 和PPARγΔ5 蛋白分子量分別為57 512.10、23 929.09 u，分子式分別為C2575H4046N670O766S27、C1054H1610N282O322S17，脂肪族氨基酸指數(shù)分別為88.04、66.38，理論等電點(diǎn)（PI）分別為5.60、5.68，均屬酸性蛋白；不穩(wěn)定系數(shù)分別為49.18、54.26，表明理化性質(zhì)均不穩(wěn)定，理論半衰期均為30 h。PPARγ帶負(fù)電荷與正電荷氨基酸殘基（Asp與Arg）總數(shù)分別為71和58，PPARγΔ5 帶負(fù)電荷與正電荷氨基酸殘基（Glu 與Lys）總數(shù)分別為29和22。

由圖3 可知，PPARγ 蛋白的肽鏈大部分位于親水區(qū)域，為親水蛋白。其中，第416位異亮氨酸殘基的疏水性最強(qiáng)，分值為3.65；第128 位谷氨酸殘基親水性最強(qiáng)，分值為-2.76。PPARγΔ5 蛋白的肽鏈大部分位于親水區(qū)域，為親水蛋白。其中，第137位谷氨酸殘基的疏水性最強(qiáng)，分值為1.47；第127位谷氨酸殘基的親水性最強(qiáng)，分值為-2.72。

由表1 可知，PPARγ 和PPARγΔ5 蛋白均含20 種氨基酸。PPARγ 由504 個(gè)氨基酸組成，其中亮氨酸占比為10.5%；賴氨酸占比為7.7%；組氨酸、半胱氨酸及色氨酸占比分別為2.8%、2.0%和0.2%。PPARγΔ5由210個(gè)氨基酸組成，其中絲氨酸占比為9.5%；天冬氨酸占比為8.6%；谷氨酰胺和色氨酸占比分別為2.9%和0.5%。

2.3 PPARγ 和PPARγΔ5蛋白的二級和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測（見表2、圖4、圖5）

表2 PPARγ和PPARγΔ5蛋白的二級結(jié)構(gòu)占比Tab.2 Secondary structure proportion of PPARγ and PPARγδ5 proteins 單位：%

圖4 PPARγ和PPARγΔ5蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.4 Secondary structure prediction of PPARγ and PPARγΔ5 proteins

圖5 PPARγ和PPARγΔ5蛋白三級結(jié)構(gòu)建模Fig.5 Tertiary structure modeling of PPARγ and PPARγΔ5 proteins

由表2可知，PPARγ、PPARγΔ5蛋白二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋、無規(guī)則卷曲、β-轉(zhuǎn)角和延伸鏈分別占50.00%、31.75%、6.35%、11.90%和21.43%、49.05%、7.62%、21.90%。

由圖5可知，PPARγ蛋白三級結(jié)構(gòu)以α-螺旋和無規(guī)則卷曲為主，PPARγΔ5 蛋白三級結(jié)構(gòu)以無規(guī)則卷曲和延伸鏈為主，與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果相符。

2.4 PPARγ 和PPARγΔ5 蛋白跨膜螺旋結(jié)構(gòu)和信號肽預(yù)測（見圖6、圖7）

圖6 PPARγ和PPARγΔ5蛋白跨膜螺旋結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.6 Prediction of transmembrane helical structure of PPARγ and PPARγΔ5 proteins

圖7 PPARγ和PPARγΔ5蛋白信號肽預(yù)測Fig.7 PPARγ and PPARγΔ5 protein signal peptide prediction

由圖6、圖7 可知，豬PPARγ 和PPARγΔ5 兩種蛋白均無跨膜螺旋結(jié)構(gòu)、無信號肽，屬于非分泌蛋白。

2.5 PPARγ 和PPARγΔ5 蛋白亞細(xì)胞定位和磷酸化位點(diǎn)（見圖8、圖9）

圖8 PPARγ和PPARγΔ5蛋白亞細(xì)胞定位Fig.8 Subcellular localization of PPARγ and PPARγΔ5 proteins

圖9 PPARγ和PPARγΔ5蛋白磷酸化位點(diǎn)Fig.9 Phosphorylation sites of PPARγ and PPARγΔ5 proteins

由圖8可知，PPARγ蛋白約56.6%定位于細(xì)胞質(zhì)；細(xì)胞核約占21.8%；過氧化物酶體約占8.7%；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、質(zhì)膜和線粒體均約占4.3%。PPARγΔ5 約82.7%定位于細(xì)胞核；細(xì)胞質(zhì)約占8.7%；線粒體和過氧化物酶體均約占4.3%。

由圖9可知，PPARγ蛋白氨基酸序列中共有48個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)，其中包括27個(gè)Ser磷酸化位點(diǎn)、13個(gè)Thr磷酸化位點(diǎn)、8 個(gè)Tyr 磷酸化位點(diǎn)。PPARγΔ5 蛋白氨基酸序列中共有25個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)，其中包括13個(gè)Ser磷酸化位點(diǎn)、8個(gè)Thr磷酸化位點(diǎn)、4個(gè)Tyr磷酸化位點(diǎn)。

2.6 PPARγ和PPARγΔ5結(jié)構(gòu)域預(yù)測（見圖10～圖13）

圖10 PPARγ蛋白結(jié)構(gòu)域Fig.10 PPARγ protein domain

PPARγ 具有由鋅指結(jié)構(gòu)（ZnF-C4）構(gòu)成的DNA 結(jié)合域（DBD）、可變的N 端調(diào)控域、柔性鉸鏈和C 端配體結(jié)合域（LBD）。

由圖10、圖11 可知，豬PPARγ 外顯子5 由200 個(gè)核苷酸組成，編碼PPARγ 蛋白質(zhì)第206～272 位氨基酸，第236～503位氨基酸構(gòu)成其LBD。

由圖12、圖13 可知，PPARγ 外顯子5 跳躍產(chǎn)生的PPARγΔ5由于編碼框移位，終止密碼子提前，雖然具有完整的N端調(diào)控域和DBD結(jié)構(gòu)域，但缺失了LBD結(jié)構(gòu)。

圖12 PPARγΔ5蛋白缺失LBD氨基酸序列Fig.12 PPARγΔ5 protein lacks the LBD amino acid sequence

圖13 PPARγΔ5蛋白結(jié)構(gòu)域Fig.13 PPARyΔ5 protein domain

3 討論

PPARγ是配體激活的核激素受體轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞分化、脂肪生成和胰島素敏感性等多個(gè)生物學(xué)過程。PPARγ 是脂肪細(xì)胞分化的主要調(diào)控子，尚無在PPARγ 缺失時(shí)其他因子可促進(jìn)該細(xì)胞進(jìn)程的相關(guān)研究[6]。SRSF1與PPARγ外顯子6結(jié)合有助于其前體mRNA跳過外顯子5發(fā)生選擇性剪接，是因?yàn)镻PARγ外顯子6中有SRSF1的結(jié)合位點(diǎn)[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，人類脂肪組織及脂肪細(xì)胞均表達(dá)PPARγ Δ 5，并在脂肪形成的調(diào)控中起到重要作用[4]。PPARγ3 是豬脂肪細(xì)胞分化的主要調(diào)控因子，其mRNA 與人PPARγ序列均由7個(gè)外顯子序列組成，同源性較高。然而，豬PPARγ 前體mRNA 是否也通過選擇性剪接產(chǎn)生PPARγΔ5 的研究尚未見報(bào)道。本試驗(yàn)對豬4 個(gè)組織器官進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，豬心臟、肝臟、皮下脂肪組織和背最長肌均表達(dá)PPARγΔ5，其組織表達(dá)變化與PPARγ一致，即在皮下脂肪組織表達(dá)水平最高，其次為背最長肌和肝臟，心臟表達(dá)水平最低，且表達(dá)水平在同一組織都顯著低于PPARγ。此外，PPARγΔ5 和PPARγ 的表達(dá)顯著正相關(guān)。上述結(jié)果均提示PPARγΔ5可能在豬脂肪細(xì)胞分化及脂肪形成中起到重要作用。

對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的分析表明，與PPARγ 相同，PPARγΔ5 蛋白也具有DBD 結(jié)構(gòu)域和N 端調(diào)控域，可與啟動(dòng)子上的PPREs 序列結(jié)合調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄[7]。研究表明，經(jīng)天然配體脂肪酸衍生物或合成配體如羅格列酮激活后，PPARγ與其分子伴侶維甲酸X受體α（RXRα）形成異二聚體，通過激活靶基因表達(dá)[8]，調(diào)控各種細(xì)胞過程，包括細(xì)胞成脂分化[9]。盡管PPARγΔ5 由于選擇性剪接產(chǎn)生的外顯子5 跳躍致使蛋白質(zhì)編碼框移位，終止密碼子提前，導(dǎo)致PPARγΔ5 缺失LBD 結(jié)構(gòu)，喪失了配體結(jié)合功能[3]，但可通過競爭RXRα對野生型PPARγ活性產(chǎn)生顯性負(fù)性作用，從而調(diào)控脂肪細(xì)胞的分化[5]。因此，PPARγΔ5可能在豬脂肪細(xì)胞分化調(diào)控及其他生物學(xué)過程中發(fā)揮作用。

轉(zhuǎn)錄因子的反式激活活性調(diào)控包括蛋白質(zhì)表達(dá)水平、配體結(jié)合及轉(zhuǎn)錄輔因子互作等多種方式。蛋白質(zhì)翻譯后修飾可改變蛋白質(zhì)構(gòu)象、蛋白質(zhì)互作及受體和配體間的親和力，從而調(diào)節(jié)下游基因的轉(zhuǎn)錄[10]。對磷酸化位點(diǎn)的信息分析表明，PPARγ 和PPARγΔ5 具有豐富的磷酸化位點(diǎn)。蛋白質(zhì)磷酸化是調(diào)節(jié)PPARγ 活性的主要途徑之一[11]。在不同的刺激下，PPARγ 可以在不同的位點(diǎn)磷酸化，從而產(chǎn)生多樣的生物學(xué)效應(yīng)[12]。細(xì)胞周期素依賴性蛋白激酶（CDK）和絲裂原激活蛋白激酶（MAPK）主要在Ser273[12-13]和Ser112 位點(diǎn)[14-15]磷酸化PPARγ。CDK5 介導(dǎo)的Ser273磷酸化降低PPARγ轉(zhuǎn)錄活性及脂肪形成，而CDK9/CDK7介導(dǎo)的Ser112 磷酸化可增強(qiáng)PPARγ 活性，促進(jìn)細(xì)胞成脂分化[14-16]。CDK5 對PPARγ 的磷酸化可能有助于其與輔激活子過氧化物酶體增殖物激活受體-γ 輔激活因子1（PGC-1）和轉(zhuǎn)錄中介因子2（TIF2）的解離，促進(jìn)與輔抑制子（SMRT）和核受體輔阻遏子（NCoR）相互作用[13]。NCoR可通過穩(wěn)定CDK5 調(diào)節(jié)Ser273 位點(diǎn)的PPARγ 磷酸化[17]。當(dāng)LBD 沒有與配體結(jié)合時(shí)，PPARγ/RXRα 與一些輔抑制因子如NCoR 結(jié)合；而當(dāng)配體結(jié)合到LBD 時(shí)，PPARγ 構(gòu)象改變，輔抑制因子被一些輔激活因子如cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREBP）、PGC-1 等取代[18]。PPARγ 與配體的結(jié)合及對輔因子的招募改變時(shí)，其反式激活活性和生物學(xué)功能將相應(yīng)改變。PPARγΔ5 與PPARγ 相似，具有多個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)，但由于其缺失LBD 結(jié)構(gòu)域，可能對磷酸化修飾過程產(chǎn)生影響，從而導(dǎo)致生物學(xué)功能的改變。

PPARγΔ5 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)與PPARγ 類似，其肽鏈大部分位于親水區(qū)域，二級結(jié)構(gòu)中主要為α-螺旋和無規(guī)則卷曲，β-轉(zhuǎn)角較少，容易形成球狀蛋白，符合親水性蛋白的特征。無規(guī)則卷曲通常也是蛋白質(zhì)分子行使功能和構(gòu)象變化的重要區(qū)域。對跨膜螺旋結(jié)構(gòu)及亞細(xì)胞定位分析表明，兩種蛋白均無跨膜螺旋結(jié)構(gòu)及信號肽結(jié)構(gòu)，為非分泌蛋白，且主要定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，推測PPARγΔ5可能與PPARγ一樣作為核轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用。此外，蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性在很大程度上取決于分子內(nèi)部的疏水作用，豬PPARγ 和PPARγΔ5 蛋白不穩(wěn)定指數(shù)均大于40，說明兩個(gè)蛋白的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性較差，在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用后可快速降解。

4 結(jié)論

PPARγΔ5 是PPARγ 的選擇性剪接亞型，豬皮下脂肪組織、背最長肌、肝臟和心臟均表達(dá)PPARγΔ5，且表達(dá)水平與PPARγ 正相關(guān)。對PPARγΔ5 和PPARγ 蛋白生物信息比較分析表明，PPARγΔ5為親水性非分泌蛋白，穩(wěn)定性差，含有豐富的磷酸化位點(diǎn)，具有核轉(zhuǎn)錄因子的特征，可能通過競爭性的結(jié)合RXRα 抑制PPARγ 反式激活活性。PPARγΔ5 缺失LBD 結(jié)構(gòu)域，其活性不依賴PPARγ 配體，可能具有與PPARγ不同的生物學(xué)功能，但尚需試驗(yàn)驗(yàn)證。