楊 洋，農(nóng) 源，陳 林，孫彤彤，黃遠(yuǎn)城，李恭賀，2，3，4，鄭喜邦，2，3，4，吳文德，2，3，4*

（ 1. 廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530004 ； 2. 廣西壯族自治區(qū)獸用生物制品工程研究中心，廣西 南寧 530004 ； 3. 廣西畜禽繁育與疾病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530004 ； 4. 廣西高校動物疫病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530004 ）

羅非魚（Oreochromis niloticus）具有耐受性強(qiáng)、飼料轉(zhuǎn)化率高等優(yōu)點(diǎn)，具有極高的市場需求[1]。無乳鏈球菌可引起羅非魚大量死亡，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2-3]。因此，有必要制定適用于羅非魚養(yǎng)殖的預(yù)防或疾病治療措施。目前控制羅非魚鏈球菌病的主要方法是使用抗生素，但易產(chǎn)生耐藥菌株及藥物殘留，不符合綠色防控的原則[4-7]。免疫接種從提高魚體免疫力出發(fā)，因其高效特異、環(huán)境友好被認(rèn)為是水產(chǎn)病害防控最具有潛力的手段之一。細(xì)菌表面蛋白完全暴露于宿主免疫系統(tǒng)，并能夠誘導(dǎo)高水平的免疫反應(yīng)。gap基因的產(chǎn)物三磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）廣泛存在于生物界，通常位于細(xì)菌細(xì)胞表面，可在感染過程中與宿主基質(zhì)蛋白結(jié)合。有報(bào)道在感染小鼠的無乳鏈球菌中檢出GAPDH，并認(rèn)為其是一種毒力相關(guān)的免疫調(diào)節(jié)蛋白[8]。GAPDH已被確定為許多病原體的候選疫苗，有研究發(fā)現(xiàn)[9]，母體免疫rGAPDH 可保護(hù)新生小鼠免于無乳鏈球菌感染引起的死亡，表明無乳鏈球菌GAPDH 可作為一種合適的靶抗原制備抗無乳鏈球菌感染的有效疫苗。也有研究表明，來自格氏乳球菌的GAPDH 蛋白對羅非魚乳球菌病具有有效的保護(hù)作用[10]。本研究對羅非魚無乳鏈球菌gap基因進(jìn)行擴(kuò)增，通過原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)并純化重組蛋白，動物試驗(yàn)分析其免疫原性和保護(hù)效果，為進(jìn)一步利用該蛋白防控羅非魚無乳鏈球菌病奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動物

試驗(yàn)羅非魚200 尾購自廣西某水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司，體重為（50±2） g，體長（13.0±0.5） cm。試驗(yàn)前暫養(yǎng)10 d，水溫（30.0±0.5） ℃，氣泵24 h 供氧，飼料每日投喂體質(zhì)量的2%。本試驗(yàn)于廣西大學(xué)水產(chǎn)基地進(jìn)行。

1.1.2 試劑與儀器

Premix Taq?、pMD?18-T 載體克隆試劑盒、限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ/Sal Ⅰ、T4 DNA Ligase 購自Takara 公司；DH5α和BL21感受態(tài)細(xì)胞、抗His標(biāo)簽鼠單克隆抗體、HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG（H+L）抗體購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；IPTG 粉末、透析袋、弗氏完全佐劑和不完全佐劑購自Sigma 公司；pET-28a-SUMO 表達(dá)載體、HRP 標(biāo)記的抗羅非魚IgM單克隆抗體、無乳鏈球菌HN016株由廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院獸醫(yī)臨床實(shí)驗(yàn)室保存。

PCR 儀、水平電泳儀（賽默飛公司）；細(xì)胞超聲波破碎儀（南京先歐儀器制造有限公司）；垂直電泳儀（北京六一生物科技有限公司）；凝膠分析系統(tǒng)（上海天能生命科學(xué)有限公司）；低溫高速離心機(jī)（Sigma 公司）；化學(xué)發(fā)光成像儀（Cytiva公司）；酶標(biāo)儀（Bio-Rad公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 重組載體pET-28a-gap的構(gòu)建

無乳鏈球菌提取全基因組DNA，根據(jù)GenBank登錄號WP_006738473.1 設(shè)計(jì)引物：gap_F：5'-GGATCCatggtagttaaagttggt-3'，gap_R：5'-cGTCGACttattttgcaatttttgc-3'。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：上下游引物各10 nmol/L、DNA模板50 ng、Premix Taq 25 μL，加ddH2O 至50 μL。反應(yīng)程序：95 ℃變性30 s，48 ℃退火50 s，72 ℃延伸2 min，共30 個(gè)循環(huán)。對PCR 產(chǎn)物進(jìn)行電泳并回收。gap 片段與表達(dá)載體pET-28a-Sumo 進(jìn)行BamH Ⅰ、Sal Ⅰ分別雙酶切并用T4 連接酶連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5α 克隆菌株，提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切和測序鑒定，測序正確的質(zhì)粒命名pET-28a-gap。

1.2.2 重組載體誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化

構(gòu)建成功的質(zhì)粒pET-28a-gap 轉(zhuǎn)化E.coliBL21（DE3）表達(dá)菌株，挑取單克隆到含Kan 抗性的TB 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD600nm值為0.6～0.8時(shí)，加入終濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.8、1.2、2.0、3.0 mmol/L 的IPTG，在16、23、30、37 ℃的不同溫度下，220 r/min誘導(dǎo)4、8、12、16 h后，同時(shí)設(shè)立轉(zhuǎn)化pET-28a-SUMO空質(zhì)粒的BL21（DE3）菌株和未加誘導(dǎo)劑的pET-28a-gap 重組質(zhì)粒的BL21（DE3）菌株分別作為空白和陰性對照。離心收集菌體并通過聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）檢測目的蛋白的表達(dá)情況，確立最優(yōu)表達(dá)條件。取適量最優(yōu)表達(dá)條件下的菌體，超聲破碎后分離上清與沉淀，SDS-PAGE分析重組蛋白表達(dá)形式。

1.2.3 重組蛋白的Western blot鑒定

設(shè)立空質(zhì)粒pET-28a-SUMO 作為空白對照，與誘導(dǎo)表達(dá)的菌液變性并經(jīng)SDS-PAGE電泳后，通過濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至PVDF膜后用5%脫脂奶粉封閉，以抗His標(biāo)簽鼠單克隆抗體為一抗，HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（H+L）抗體為二抗，按照抗體說明書稀釋后進(jìn)行孵育，孵育結(jié)束后清洗PVDF膜，采用ECL化學(xué)發(fā)光法顯影并采集圖像。

1.2.4 重組蛋白的純化

按照1.2.2構(gòu)建的條件大量培養(yǎng)重組載體轉(zhuǎn)化菌，收集菌體沉淀并清洗后，冰上超聲波破碎菌液，低溫離心收集上清，0.45 μm濾器過濾，Ni瓊脂糖凝膠柱進(jìn)行親和層析純化。對收集的洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE分析，純化后的蛋白用7000D透析袋除去雜鹽和濃縮，并檢測其蛋白濃度。

1.2.5 重組蛋白疫苗的制備及免疫原性檢測

健康羅非魚隨機(jī)分為攻毒組、免疫組、空白組，每組50 尾。用無菌PBS 對純化的gap 蛋白進(jìn)行稀釋并與弗氏佐劑進(jìn)行1∶1 混合乳化，按照2 μg 蛋白/1 g 魚體重的劑量對免疫組進(jìn)行腹腔注射，攻毒組和空白組注射同體積的PBS 與佐劑混合物。試驗(yàn)魚共接受3 次免疫，兩次注射間隔8 d，首免使用弗氏完全佐劑，后續(xù)兩次加強(qiáng)免使用弗氏不完全佐劑。3 次免疫前和攻毒前后每組隨機(jī)抽取10 尾魚尾靜脈采血0.5 mL，血樣4 ℃過夜后分離血清，采用間接ELISA方法測定血清免疫球蛋白M（IgM）抗體水平。

1.2.6 重組蛋白疫苗的免疫保護(hù)作用

免疫結(jié)束后用無乳鏈球菌對羅非魚進(jìn)行攻毒試驗(yàn)。菌體濃度1×108CFU/mL。攻毒組和免疫組每尾魚腹腔注射0.1 mL 無乳鏈球菌，空白組注射同體積的生理鹽水，按照公式計(jì)算各組相對免疫保護(hù)率（RPS）。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用IBM SPSS Statistics 25.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，GraphPad Prism 9.0軟件制圖。P＜0.05表示差異顯著，P＞0.05表示差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 載體pET-28a-gap的構(gòu)建及鑒定（見圖1）

圖1 載體pET-28a-gap的構(gòu)建及鑒定Fig.1 Construction and identification of carrier pET-28a-gap

由圖1（a）可知，PCR結(jié)果為單一且清晰的1 011 bp的片段，與預(yù)期結(jié)果一致，表明成功擴(kuò)增gap基因。

由圖1（b）可知，構(gòu)建的載體經(jīng)雙酶切鑒定，獲得5 614和1 011 bp 的兩個(gè)片段，質(zhì)粒DNA 測序與預(yù)期序列相同，表明重組載體pET-28a-gap成功構(gòu)建。

2.2 重組蛋白gap高效表達(dá)體系的建立（見圖2～圖4）

圖2 誘導(dǎo)劑濃度的表達(dá)條件優(yōu)化Fig.2 Optimization of expression conditions of inducer concentration

重組表達(dá)載體目的蛋白的分子量理論值為49.8 ku，轉(zhuǎn)化重組載體pET-28a-gap 的E.coliBL21（DE3）菌株在各條件下均能夠在預(yù)期位置成功表達(dá)重組蛋白。

由圖2 可知，低濃度下蛋白表達(dá)量與誘導(dǎo)劑濃度呈正相關(guān)，但0.4 mmol/L以上時(shí)濃度蛋白含量不再隨著誘導(dǎo)劑濃度的增大而呈明顯變化，選擇IPTG 0.4 mmol/L為gap蛋白的最優(yōu)誘導(dǎo)劑濃度。

由圖3 可知，gap 蛋白的表達(dá)量隨著誘導(dǎo)溫度增高而增加，但誘導(dǎo)溫度超過23 ℃后表達(dá)量不再出現(xiàn)明顯增加，低溫能夠保持蛋白質(zhì)的活性，選擇23 ℃為gap蛋白的最優(yōu)誘導(dǎo)溫度。

由圖4 可知，gap 蛋白的表達(dá)量隨著誘導(dǎo)時(shí)長增加而增加，誘導(dǎo)時(shí)間超過12 h后表達(dá)量下降，選擇12 h為gap蛋白的最優(yōu)誘導(dǎo)時(shí)長。

2.3 重組gap 蛋白的表達(dá)形式分析與Western blot 檢測（見圖5）

圖5 重組gap蛋白的表達(dá)形式分析與Western blot檢測Fig.5 Analysis of expression forms and western blot analysis of recombinant protein gap

由圖5（a）可知，在0.4 mmol/L IPTG、23 ℃條件下誘導(dǎo)12 h，gap蛋白主要以可溶性蛋白的形式表達(dá)在上清中，沉淀中幾乎未見表達(dá)的gap蛋白。由圖5（b）可知，在預(yù)期位置49.8 ku處出現(xiàn)清晰的反應(yīng)條帶，空質(zhì)粒未出現(xiàn)明顯的免疫印跡，表明重組質(zhì)粒pET-28a-gap成功表達(dá)了gap蛋白。

2.4 重組gap蛋白的SDS-PAGE分析（見圖6）

圖6 重組gap蛋白的SDS-PAGE分析Fig.6 SDS-PAGE analysis of purified protein gap

由圖6可知，不同階段的洗脫液通過SDS-PAGE分析進(jìn)行比較，純化后各管洗脫液均出現(xiàn)大小為49.8 ku的高濃度單一條帶，且與純化前的目的條帶位置相同；流穿液的初段含大量雜蛋白條帶與目的條帶，末段不再含有條帶，表明已洗脫充分。經(jīng)檢測蛋白濃度約為2.62 g/L。

2.5 重組蛋白疫苗免疫對羅非魚血清抗體效價(jià)的影響（見圖7）

圖7 重組蛋白疫苗免疫對羅非魚血清抗體效價(jià)的影響Fig.7 Detection of ELISA antibody level of tilapia at different time periods

由圖7 可知，免疫前各組羅非魚血清抗體效價(jià)差異不顯著（P＞0.05）；免疫8 d后，免疫組羅非魚血清抗體效價(jià)顯著高于未免疫組（P＜0.05）；免疫組羅非魚接受一次免疫注射后血清抗體效價(jià)與接受兩次注射差異不顯著（P＞0.05），接受3 次免疫注射后的血清抗體效價(jià)顯著高于前兩次（P＜0.05）；攻毒結(jié)束后，免疫組羅非魚血清抗體效價(jià)顯著高于攻毒組和空白組（P＜0.05），免疫組和攻毒組羅非魚血清抗體效價(jià)均顯著高于空白組（P＜0.05）。

2.6 重組蛋白疫苗免疫對羅非魚的保護(hù)效果（見圖8）

圖8 重組蛋白疫苗免疫對羅非魚的保護(hù)效果Fig.8 Protective effect of recombinant protein vaccine on tilapia

羅非魚攻毒后1 d 免疫組和攻毒組均開始出現(xiàn)死亡，攻毒后4 d 達(dá)到死亡高峰，7 d 后不再發(fā)生死亡。攻毒后，病魚體色發(fā)黑，停止進(jìn)食，魚體失衡，在水面轉(zhuǎn)圈，最后沉底死亡，為典型無乳鏈球菌感染癥狀；剖檢腹腔有腹水，臟器組織分離并劃線血平板均可見無乳鏈球菌生長。由圖8可知，無乳鏈球菌腹腔注射羅非魚后，免疫組、攻毒組、空白組的死亡率分別為28%、78%、0，相對保護(hù)率為64.1%。

3 討論

無乳鏈球菌是引起羅非魚鏈球菌病的主要病原體[11]，能否有效控制該病已成為水產(chǎn)養(yǎng)殖研究的重點(diǎn)。為符合食品安全和糧食安全政策，抗生素等逐漸被禁用，因此通過疫苗接種激活魚類的自我免疫力是控制鏈球菌病最實(shí)用、最可靠的方法。目前，魚用無乳鏈球菌疫苗趨于多元化發(fā)展，包括滅活疫苗、減毒疫苗、DNA疫苗、亞單位疫苗等。然而，滅活疫苗的功效性和減毒活苗的安全性有待考證[12]。近年來，重組蛋白疫苗研究領(lǐng)域受到了越來越多的關(guān)注，有以下3方面原因：首先，滅活疫苗等可能出現(xiàn)“毒力返祖”現(xiàn)象，造成抗原損害，重組蛋白疫苗很少出現(xiàn)安全性問題；其次，重組蛋白疫苗選擇高度保守區(qū)域進(jìn)行表達(dá)，可用作對抗多種血清型病原體的通用疫苗；最后，該疫苗可以區(qū)分動物是否被接種，可作為標(biāo)記疫苗。膜蛋白最先被宿主的免疫系統(tǒng)識別，激發(fā)宿主機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的免疫機(jī)制。近年來，相關(guān)免疫蛋白的報(bào)道屢見不鮮，大多均可列為亞單位疫苗的候選蛋白[13-14]。gap基因的產(chǎn)物蛋白是糖酵解途徑中的一種關(guān)鍵代謝酶，具有多種生物學(xué)活性，同樣能夠幫助病原菌對宿主的黏附和侵染[15]，其生物學(xué)功能在魚類病原體如氣單胞菌、弧菌、愛德華氏菌、海豚鏈球菌以及副乳鏈球菌和停乳鏈球菌中均有報(bào)道，但關(guān)于對魚源無乳鏈球菌gap蛋白的分析尚未見報(bào)道。

本研究擴(kuò)增出gap基因的序列經(jīng)過Blast 比對與野毒株重合度100%，高度保守，表明選擇此膜基因作為蛋白疫苗，預(yù)期免疫效果相對穩(wěn)定。包涵體形式表達(dá)的蛋白，需要專用溶解液將蛋白先變性再復(fù)性[16]，過程中存在大量損耗；該蛋白主要以可溶性形式表達(dá)，純化簡便，產(chǎn)量高。蛋白足量表達(dá)純化后制成重組蛋白疫苗免疫羅非魚，并對其免疫保護(hù)作用進(jìn)行評估。古麗米熱·對山巴依等[17]用馬腺疫鏈球菌GAPDH 蛋白免疫小鼠，結(jié)果也在小鼠血清中檢測到較高水平的特異性抗體IgG。本研究數(shù)據(jù)分析顯示，間接ELISA可檢測到相應(yīng)的抗體，且隨著免疫接種次數(shù)和劑量的增加，血清抗體水平呈現(xiàn)上升趨勢，與曾祖聰?shù)萚18]得出的結(jié)論一致。對于無乳鏈球菌感染后存活的羅非魚，攻毒組血清中抗體水平顯著升高，免疫組前后無顯著變化，猜測血清抗體水平不能代表羅非魚對無乳鏈球菌抗感染的能力。攻毒羅非魚觀察試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，發(fā)病初期，免疫組和攻毒組死亡情況相當(dāng)，4 d后攻毒組持續(xù)死亡，免疫組死亡情況趨于平緩，直至不再死亡，表明對于外來致病菌的攻擊需要一定的時(shí)間啟動體液免疫[19]。

4 結(jié)論

本研究利用PCR 對羅非魚無乳鏈球菌gap基因進(jìn)行擴(kuò)增，構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-28a-gap，優(yōu)化表達(dá)條件，獲得高純度重組gap 蛋白，通過腹腔注射羅非魚驗(yàn)證其免疫原性。結(jié)果顯示，gap基因表達(dá)的重組蛋白能夠顯著誘導(dǎo)羅非魚體內(nèi)的免疫應(yīng)答，可作為防控羅非魚無乳鏈球菌感染的候選亞單位疫苗。