林曉駿，孫 瑜，謝社風(fēng)，劉遠(yuǎn)斌，陳冰彤，黃宇健，康 愷，吳 江

（ 廣東海洋大學(xué)濱海農(nóng)業(yè)學(xué)院，廣東 湛江 524088 ）

可變剪接是指?jìng)€(gè)體發(fā)育或細(xì)胞分化時(shí)有選擇地越過某些外顯子或某個(gè)剪接點(diǎn)進(jìn)行變位剪接，進(jìn)而形成不同mRNA 異構(gòu)體的過程。生物體通過可變剪接可以由單個(gè)基因產(chǎn)生多個(gè)不同的蛋白質(zhì)異構(gòu)體，從而導(dǎo)致大量蛋白質(zhì)變異[1]。因此，可變剪接在動(dòng)物生長發(fā)育和生理代謝等過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用?？勺兗艚邮钦{(diào)節(jié)基因表達(dá)和產(chǎn)生蛋白質(zhì)組多樣性的重要機(jī)制，是導(dǎo)致真核生物基因和蛋白質(zhì)數(shù)量較大差異的重要原因[2]?？勺兗艚优c牛、羊等動(dòng)物的重要經(jīng)濟(jì)形狀的表達(dá)相關(guān)[3]，但其在生物體內(nèi)的作用機(jī)制和在生物進(jìn)化中發(fā)揮的作用還有待進(jìn)一步探究。

Sirtuins基因家族因其與細(xì)胞命運(yùn)密切相關(guān)受到廣泛關(guān)注[4-6]，但目前相關(guān)研究在畜牧獸醫(yī)方面較少?，F(xiàn)有研究表明，Sirt1基因的不同剪接體對(duì)細(xì)胞衰老具有一定影響[7]。有研究結(jié)果顯示，Sirt1-FL 抑制H2O2誘導(dǎo)的氧化損傷，而Sirt1-ΔExon8 則可促進(jìn)氧化應(yīng)激損傷。Sirtuins基因家族對(duì)骨骼肌方面的研究主要集中于其在Sirt1/PGC-1α 和AMPK/SIRT/PGC1α 相關(guān)能量代謝通路中[8-9]及其在氧化應(yīng)激中發(fā)揮的作用[10]。以往對(duì)骨骼肌的相關(guān)研究顯示，Sirt1 和Sirt2 分別起到誘導(dǎo)對(duì)氧化應(yīng)激的抵抗和動(dòng)員脂質(zhì)儲(chǔ)存的作用[11-12]；Sirt5 能夠有效去除賴氨酸羧基修飾，包括丙二酰賴氨酸、琥珀酰賴氨酸和戊二酰賴氨酸，從而對(duì)骨骼肌細(xì)胞代謝產(chǎn)生影響[13]；Sirt6蛋白水平會(huì)因其他系統(tǒng)的氧化應(yīng)激而升高，促進(jìn)DNA 雙鏈斷裂修復(fù)以減輕骨骼肌中由于ROS患病率增加而導(dǎo)致的基因組損傷[14-15]；Sirt7是一種組蛋白脫琥珀酸酶，在功能上與染色質(zhì)致密化和基因組穩(wěn)定性相關(guān)[16]。

本研究通過半定量反轉(zhuǎn)錄、PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳方法檢測(cè)Sirtuins基因家族候選剪接體在不同周齡小鼠骨骼肌中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Sirtuins基因家族候選剪接體的表達(dá)與所處周齡、所在部位具有密切的關(guān)系，研究結(jié)果為深入探究Sirtuins蛋白家族在哺乳動(dòng)物體內(nèi)的作用機(jī)制和Sirtuins基因家族候選剪接體在不同周齡小鼠骨骼肌中的表達(dá)機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

昆白小鼠由廣東海洋大學(xué)濱海農(nóng)業(yè)學(xué)院動(dòng)物遺傳育種與繁殖實(shí)驗(yàn)室提供，飼養(yǎng)于廣東海洋大學(xué)濱海農(nóng)業(yè)學(xué)院清潔級(jí)動(dòng)物房，自主飲食和飲水，溫度（22±4） ℃，濕度55%±5%，室內(nèi)光照明暗周期12 h/12 h。所有試驗(yàn)操作嚴(yán)格遵守動(dòng)物倫理和動(dòng)物福利的要求，按照廣東海洋大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)的相關(guān)規(guī)定進(jìn)行試驗(yàn)，倫理委員會(huì)審批號(hào)：SYXK-2018-0147。選取2、4、6、8 周齡體重均勻健康的小鼠10只，公母各半，共40只小鼠進(jìn)行試驗(yàn)。小鼠實(shí)施安死術(shù)后，分離大腿部骨骼肌，放入液氮凍存。

1.2 試劑與儀器

RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeSeriptTM feagent Kit with gDNA Eraser-PergectReal Time）購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；TRIzol 試劑購自天根生化科技（北京）有限公司；100～2 000 bp DNA Marker購自生工生物工程（上海）股份有限公司；2×Easy Taq PCR Super Mix（+dye）購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；瓊脂糖購自BIOWEST公司；核酸染色劑GoldViewTM Nuclic Acid Stain 購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.3 樣品采集

使用頸椎脫臼法處死雌雄小鼠共40只，快速識(shí)別并獲取黃豆大小雌雄鼠腿肌各12份，其中用于不同周齡剪接體驗(yàn)證的各3份。分別放入加有200 μL Trizol液的EP管中，-80 ℃保存。運(yùn)用Trizol法提取小鼠RNA。

1.4 引物設(shè)計(jì)（見表1、圖1）

圖1 引物設(shè)計(jì)模式Fig.1 Schematic diagram of primer

表1 qRT-PCR引物信息Tab.1 qRT-PCR primer information

參考NCBI的GeneBank數(shù)據(jù)庫中小鼠的Sirt1～Sirt7基因序列，可知Sirt1基因有2個(gè)已證實(shí)的剪接體，Sirt2有3個(gè)已證實(shí)的剪接體和3個(gè)預(yù)測(cè)變體，分別針對(duì)不同基因利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物。使用基因所對(duì)應(yīng)引物的名稱代替對(duì)應(yīng)Sirt2候選剪接體進(jìn)行敘述，將NM_019812、NM_001159589 分別用Sirt1.1、Sirt1.2 指代。Sirt5 基因具有6種候選剪接體，Sirt5基因及其候選剪接體序列高度相似。其中候選剪接體1、2、3、4、5 等5 個(gè)序列相似度最高，在進(jìn)行引物設(shè)計(jì)時(shí)，將候選剪接體1、2、3、4、5合并為一個(gè)序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，在堿基序列一致的片段進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。Sirt6 基因有2 個(gè)已證實(shí)的剪接體和1 個(gè)預(yù)測(cè)變體，Sirt7 有2 個(gè)已證實(shí)的剪接體，分別針對(duì)不同基因利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物。使用基因所對(duì)應(yīng)引物的名稱代替對(duì)應(yīng)Sirt6、Sirt7候選剪接體進(jìn)行敘述。

1.5 目的基因擴(kuò)增及表達(dá)量鑒定

Trizol 法提取RNA，RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，PCR 擴(kuò)增目的條帶。PCR 體系：PCR Mix 10 μL、ddH2O 8.2 μL、反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物小鼠cDNA 1 μL、內(nèi)參0.8 μL。Sirt1 及其候選剪接體在94 ℃、3 min 36 s 條件下預(yù)變性；94 ℃變性30 s，56.6 ℃退火，72 ℃延伸1 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸9 min。Sirt2 及其候選剪接體在95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，51 ℃退火30 s，72℃延伸1 min，28個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。Sirt5及其候選剪接體在95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃條件下變性30 s，Sirt5.1、Sirt5-1.1、Sirt5-1.2 分別在51、60、52 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，34次循環(huán)；72 ℃延伸5 min。Sirt6及其候選剪接體在95 ℃條件下預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，34 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。Sirt7 及其候選剪接體在95 ℃條件下預(yù)變性5min；95 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，34 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。β-actin 在95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，34個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

以不同周齡的小鼠樣品與內(nèi)參基因作對(duì)比，每個(gè)樣品重復(fù)3 次。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后采用ImageJ 軟件進(jìn)行條帶分析，記錄IntDen值。利用Excel軟件計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量，SPSS 17.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析。結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 Sirtuins基因家族候選剪接體在雌性小鼠骨骼肌中的表達(dá)

2.1.1Sirt1 候選剪接體在雌性小鼠骨骼肌中的表達(dá)（見圖2）

圖2 Sirt1候選剪接體在雌性小鼠骨骼肌中的表達(dá)Fig.2 Expression of Sirt1 candidate spliceosome in skeletal muscle of female mice

由圖2 可知，2 周齡雌鼠骨骼肌中Sirt1.2 表達(dá)量顯著高于4、6、8周齡（P＜0.05）。

2.1.2Sirt2 候選剪接體在雌性小鼠骨骼肌中的表達(dá)（見圖3）

圖3 Sirt2候選剪接體在雌性小鼠骨骼肌中的表達(dá)Fig.3 Expression of Sirt2 candidate spliceosome in skeletal muscle of female mice

由圖3 可知，2 周齡雄鼠骨骼肌Sirt2.1 基因表達(dá)量極顯著高于4周齡（P＜0.01），6和8周齡雄鼠骨骼肌Sirt2.1基因表達(dá)量顯著高于4 周齡（P＜0.05）。4、6 和8 周齡雄鼠骨骼肌Sirt2.2 基因表達(dá)量均顯著高于2 周齡雄鼠（P＜0.05）。2 周齡雄鼠骨骼肌Sirt2.3 基因表達(dá)量極顯著高于4、6 和8 周齡（P＜0.01）。2 周齡雄鼠骨骼肌Sirt2.4 基因表達(dá)量極顯著高于8周齡（P＜0.01）。

不同樣品Sirt2.5 和Sirt2.6 基因進(jìn)行相關(guān)電泳結(jié)果顯示，Sirt2.5 基因PCR 產(chǎn)物長度在250～500 bp，與預(yù)期產(chǎn)物大小135 bp 不相符；Sirt2.6 基因PCR 產(chǎn)物長度在500～750 bp，與預(yù)期產(chǎn)物大小393 bp不相符，因此可判斷預(yù)測(cè)變體Sirt2.5和Sirt2.6未檢出，后文不予討論。

2.1.3Sirt5 和Sirt7 候選剪接體在雌性小鼠骨骼肌中的表達(dá)（見圖4）

圖4 Sirt5和Sirt7候選剪接體在雌性小鼠骨骼肌中的表達(dá)Fig.4 Expression of Sirt5 and Sirt7 candidate spliceosomes in skeletal muscle of female mice

由圖4 可知，4 周齡雌性小鼠骨骼肌中Sirt5 表達(dá)量顯著高于6 周齡（P＜0.05）；6、8 周齡雌性小鼠骨骼肌中Sirt7的表達(dá)量顯著低于2、4周齡（P＜0.05）。Sirt5的候選剪接體XM_006516951.1、XM_006516952.3、XM_006516953.1、XM_011244413.2、XM_011244412.1、XM_006516954.1 以及Sirt7 的候選剪接體NM_001363439.1 均不表達(dá)，后文不再展開討論。

2.1.4Sirt6 候選剪接體在雌性小鼠骨骼肌中的表達(dá)（見圖5）

圖5 Sirt6候選剪接體在雌性小鼠骨骼肌中的表達(dá)Fig.5 Expression of Sirt6 candidate spliceosome in skeletal muscle of female mice

由圖5 可知，2 周齡雄性小鼠骨骼肌中Sirt6.1 的表達(dá)量顯著高于其他周齡（P＜0.05）。4周齡雌性小鼠骨骼肌中Sirt6.2的表達(dá)量顯著低于2、8周齡（P＜0.05），6周齡的表達(dá)量極顯著低于2、8周齡（P＜0.01）。

2.2 Sirtuins基因家族候選剪接體在雄性小鼠骨骼肌中的表達(dá)

2.2.1 Sirt1 候選剪接體在雄性小鼠骨骼肌中的表達(dá)（見圖6）

圖6 Sirt1候選剪接體在雄性小鼠骨骼肌中的表達(dá)Fig.6 Expression of Sirt1 candidate spliceosome in skeletal muscle of male mice

由圖6可知，各周齡雄鼠骨骼肌中Sirt1.1、Sirt1.2表達(dá)量差異均不顯著（P＞0.05）。

2.2.2 Sirt2 候選剪接體在雄性小鼠骨骼肌中的表達(dá)（見圖7）

圖7 Sirt2候選剪接體在雄性小鼠骨骼肌中的表達(dá)Fig.7 Expression of Sirt2 candidate spliceosome in skeletal muscle of male mice

由圖7 可知，6 周齡雄鼠骨骼肌Sirt2.1 基因表達(dá)量極顯著高于4 周齡（P＜0.01），顯著高于2、8 周齡（P＜0.05）；2 和8 周齡雄鼠骨骼肌Sirt2.1 基因表達(dá)量顯著高于4 周齡（P＜0.05）。6 和8 周齡雄鼠骨骼肌Sirt2.2 基因表達(dá)量極顯著高于2 周齡雄鼠（P＜0.01），顯著高于4 周齡（P＜0.05）；4周齡雄鼠骨骼肌Sirt2.2基因表達(dá)量顯著高于2周齡雄鼠（P＜0.05）。6周齡雄鼠骨骼肌Sirt2.3基因表達(dá)量極顯著高于4和8周齡雄鼠（P＜0.01）；2周齡雄鼠骨骼肌Sirt2.3基因表達(dá)量顯著高于4 和8 周齡雄鼠（P＜0.05）。6 周齡雄鼠骨骼肌Sirt2.4基因表達(dá)量極顯著高于2 和8 周齡（P＜0.01），顯著高于4周齡（P＜0.05）；4周齡雄鼠骨骼肌Sirt2.4基因表達(dá)量顯著高于2和8周齡雄鼠（P＜0.05）。

2.2.3Sirt5 和Sirt7 候選剪接體在雄性小鼠骨骼肌中的表達(dá)（見圖8）

圖8 Sirt5和Sirt7候選剪接體在雄性小鼠骨骼肌中的表達(dá)Fig.8 Expression of Sirt5 and Sirt7 candidate spliceosomes in skeletal muscle of male mice

由圖8可知，Sirt5在2周齡雄性小鼠骨骼肌內(nèi)不表達(dá)，4 周齡時(shí)表達(dá)量顯著高于6、8 周齡（P＜0.05）；Sirt7 基因在2、4周齡雄性小鼠骨骼肌內(nèi)表達(dá)高于6、8周齡（P＞0.05）。

2.2.4Sirt6 候選剪接體在雄性小鼠骨骼肌中的表達(dá)（見圖9）

圖9 Sirt6候選剪接體在雄性小鼠骨骼肌中的表達(dá)Fig.9 Expression of Sirt6 candidate spliceosome in skeletal muscle of male mice

由圖9 可知，2、4、6 周齡雄性小鼠骨骼肌中Sirt6.1 表達(dá)量差異不顯著（P＞0.05），均極顯著低于8周齡（P＜0.01）；2 周齡雄性小鼠骨骼肌中Sirt6.2 表達(dá)量顯著高于4 周齡（P＜0.05），極顯著高于6、8 周齡（P＜0.01）；4 周齡雄性小鼠骨骼肌中Sirt6.2表達(dá)量顯著高于6、8周齡（P＜0.05）。

3 討論

Sirt1是體內(nèi)重要的能量代謝感受器，可感知機(jī)體的能量代謝狀態(tài)，通過改變下游分子的基因表達(dá)或活性調(diào)節(jié)機(jī)體能量代謝過程[17]。Chriett 等[18]研究表明，Sirt1 在豬骨骼肌中的表達(dá)水平從胚胎階段到出生呈逐漸下降的趨勢(shì)。在本研究中，對(duì)于骨骼肌這種耗能較多的組織，Sirt1 候選剪接體在不同周齡的雌、雄小鼠體內(nèi)均保持較高的表達(dá)量，且Sirt1.2 在幼齡階段表達(dá)相對(duì)較高，但總體呈隨發(fā)育成熟表達(dá)量逐漸下降的趨勢(shì)。目前研究表明，隨著個(gè)體年齡增長的衰老階段，細(xì)胞中NAD 的含量表現(xiàn)出關(guān)聯(lián)下降（可以是由于細(xì)胞中NAMPT 水平下降導(dǎo)致），并可能啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)的補(bǔ)償機(jī)制從而導(dǎo)致Sirt1的表達(dá)量增加[19-20]，因此推測(cè)個(gè)體發(fā)育成熟細(xì)胞內(nèi)NAD水平的增長會(huì)抑制Sirt1相關(guān)剪接體的表達(dá)。

本研究中，Sirt2.1、Sirt2.3、Sirt2.4表達(dá)量出現(xiàn)幼齡階段表達(dá)量較高且總體表達(dá)量具有隨年齡增長降低的趨勢(shì)，Sirt2.2 在幼齡階段表達(dá)較少，4 周齡后表達(dá)量趨于穩(wěn)定。根據(jù)小鼠的生長周期可知，出生至2周齡期間屬于哺乳期，滿2周齡時(shí)開始采食和飲水；出生后4～8周屬于生長期，其中雌性性成熟期為35～50 日齡，雄性為45～60 日齡。已有研究表明，Sirt2 負(fù)調(diào)節(jié)C2C12 骨骼肌細(xì)胞中的胰島素抵抗，且抑制Sirt2 也會(huì)增強(qiáng)細(xì)胞中的葡萄糖攝取[21]，這可能是Sirt2.1、Sirt2.3、Sirt2.4 隨發(fā)育成熟表達(dá)量逐漸下降的原因。本研究中，Sirt2的不同剪接體在骨骼肌組織中呈現(xiàn)不同的表達(dá)規(guī)律，推測(cè)Sirt2不同候選剪接體在骨骼肌發(fā)育過程中可能發(fā)揮著不同的作用，具體原因還有待進(jìn)一步探究。

Sirt5 與能量代謝密切相關(guān)[22]。本試驗(yàn)中，Sirt5 在4 周齡雄性小鼠骨骼肌中表達(dá)量顯著高于6、8 周齡；在2、4、8周齡及2、6、8周齡組間雌性小鼠骨骼肌中的表達(dá)量差異均不顯著，4 周齡雌性小鼠骨骼肌中的表達(dá)量顯著高于6周齡。王利紅等[23]研究發(fā)現(xiàn)，母豬Sirt5蛋白表達(dá)量總體低于公豬。本試驗(yàn)結(jié)果也呈現(xiàn)雄性表達(dá)量略高于雌性的現(xiàn)象。Ryu等[24]研究表明，Sirt7與乳酸積累、運(yùn)動(dòng)表現(xiàn)密切相關(guān)。Chriett等[18]研究表明，Sirt7在豬骨骼肌中的表達(dá)水平與年齡增長呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系。本試驗(yàn)中，Sirt7在不同性別的小鼠骨骼肌中的表達(dá)均呈現(xiàn)隨年齡增長下降的趨勢(shì)，且在6周齡時(shí)出現(xiàn)明顯下降，總體上表達(dá)量保持穩(wěn)定。

現(xiàn)有研究表明，Sirt6 作為一種賴氨酸-脫乙酰酶和單-ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶，具有多效性作用[25]，但Sirt6 在代謝中的作用存在爭(zhēng)議。如Sirt6 基因敲除小鼠表現(xiàn)出脂肪組織質(zhì)量減少和低血糖[26]。Sirt6 缺乏還導(dǎo)致Sirt6 依賴性轉(zhuǎn)錄沉默減弱，導(dǎo)致參與糖酵解和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的基因表達(dá)增加[27]。此外，Sirt6能夠提高骨骼肌的胰島敏感性從而降低血糖和治療肥胖[28]。

本研究對(duì)雄鼠骨骼肌的檢測(cè)結(jié)果表明，2周齡時(shí)，雄鼠骨骼肌中Sirt6.1表達(dá)量開始下滑，到第6周齡結(jié)束，第8周時(shí)表達(dá)量突然上升達(dá)到最大值；Sirt6.2 的表達(dá)量則是在2周齡時(shí)達(dá)到最大，之后隨著年齡增長而下滑，到8周齡時(shí)出現(xiàn)上升跡象。在對(duì)雌鼠骨骼肌的檢測(cè)表明，各周齡組Sirt6.1的表達(dá)量均保持在較高水平，2周齡時(shí)表達(dá)量最大，隨著年齡增長表達(dá)量稍微下滑，到第8周齡時(shí)有所回升；在雌性骨骼肌中Sirt6.2 表達(dá)量在2 周齡時(shí)最大，隨著年齡增長有大幅度下滑的跡象，但在8 周齡時(shí)有回升，這可能與Sirt6隨著年齡增長所需要能量的高低有關(guān)。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，Sirt1.1 和Sirt1.2 的表達(dá)量隨周齡增長呈下降趨勢(shì)，6周齡時(shí)最低；Sirt2在2～8周齡小鼠骨骼肌中廣泛表達(dá)，其中Sirt2.4在小鼠各組織中PCR產(chǎn)物長度與預(yù)期產(chǎn)物大小相符，有表達(dá)且表達(dá)量較高；4周齡組雌性骨骼肌中Sirt5的表達(dá)量顯著高于6周齡組；Sirt6的兩個(gè)已知變體Sirt6.1、Sirt6.2在小鼠骨骼肌中較高表達(dá)，表達(dá)量隨著周齡增長而波動(dòng)，表達(dá)量在第2周達(dá)到最高，隨年齡增長而下降，到第8周齡時(shí)出現(xiàn)回升的跡象；2、4周齡小鼠的骨骼肌中Sirt7基因表達(dá)量較高，6、8周齡小鼠的骨骼肌中Sirt7基因表達(dá)量較低，提示隨著小鼠年齡增加，Sirt7 基因表達(dá)水平逐漸降低。

本研究成功從雌雄小鼠骨骼肌中克隆得到Sirtuins家族成員的10種剪接體，并結(jié)合時(shí)空表達(dá)譜進(jìn)行分析，為后期研究Sirtuins家族不同剪接體發(fā)揮的作用奠定了基礎(chǔ)。