李 爽，劉小芳，李福后，王偉霞，冷凱良，李雅婷，郭向融

（1.江蘇海洋大學(xué)海洋食品與生物工程學(xué)院，江蘇連云港 222005；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部極地漁業(yè)可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266071；3.嶗山實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266200）

南極磷蝦（Euphausia superba）是南大洋生態(tài)系統(tǒng)中的關(guān)鍵物種，生物量約達(dá)6.5～10 億噸，是全球現(xiàn)存的資源極其豐富而開發(fā)利用程度很低的單種可捕生物資源，加快對其的開發(fā)利用具有重要意義[1-2]。我國南極磷蝦漁業(yè)經(jīng)過十余年發(fā)展已取得長足進(jìn)步，但目前針對南極磷蝦的高值化利用仍集中于南極磷蝦油等脂質(zhì)類產(chǎn)品的開發(fā)，對蛋白資源的利用明顯不足[3-4]。明確南極磷蝦蛋白的生物活性，拓展其在健康食品及生物醫(yī)藥制品領(lǐng)域的應(yīng)用，對于提高南極磷蝦資源利用率和推動南極磷蝦產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。

高血壓是影響我國居民健康的常見慢性疾病之一，其以動脈血壓持續(xù)升高為主要臨床特征，是導(dǎo)致腦卒中、冠心病、心力衰竭等心腦血管疾病的重要危險(xiǎn)因素[5-6]。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（Angiotensin-I converting enzyme，ACE）在調(diào)節(jié)血壓平衡中發(fā)揮重要作用[7]，其通過將血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化為血管緊張素Ⅱ（血管收縮劑），使具有舒張血管作用的緩激肽失活，促進(jìn)醛固酮分泌而引起血壓升高[6-8]。通過抑制ACE 活性可以達(dá)到治療高血壓的效果，但由于長期服用卡托普利、依那普利等化學(xué)合成ACE 抑制劑易引發(fā)腎臟損害、血管水腫、高血鉀癥、味覺障礙等問題[9-11]，尋找天然來源且安全可靠的ACE 抑制劑顯得尤為迫切。

食源性多肽類ACE 抑制劑具有安全性高、易吸收、副作用小等優(yōu)勢[7,10,12]，為預(yù)防和治療高血壓提供了新的途徑。近年來，從馬面魚皮[7]、大黃魚[9]、牡蠣[13]、大西洋鮭魚皮[14]、比目魚[15]等海洋食品原料蛋白質(zhì)中制備的多肽陸續(xù)被證明具有良好的ACE抑制活性，南極磷蝦蛋白源ACE 抑制肽的開發(fā)也因此得到關(guān)注。Zhao 等[16]從脫脂南極磷蝦粉酶解液中分離得到八個具有ACE 抑制活性的多肽，證明了南極磷蝦蛋白酶解產(chǎn)物在開發(fā)ACE 抑制劑方面的潛力，但目前關(guān)于南極磷蝦ACE 抑制肽的制備工藝及其穩(wěn)定性尚缺乏較為全面的研究。綜上，本研究以酶解產(chǎn)物的ACE 抑制率為評價(jià)指標(biāo)，篩選出酶解脫脂南極磷蝦粉制備ACE 抑制肽的最適蛋白酶，通過單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)對工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，并系統(tǒng)考察溫度、酸堿度、模擬胃腸道消化等條件對南極磷蝦ACE 抑制肽穩(wěn)定性的影響，以期為南極磷蝦蛋白資源的精準(zhǔn)利用和高值產(chǎn)品開發(fā)提供科學(xué)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

脫脂南極磷蝦粉 青島南極維康生物科技有限公司；堿性蛋白酶（Alcalase 2.4 L 250000 U/mL） 丹麥諾維信生物技術(shù)有限公司；胰蛋白酶（250000 U/g）、胃蛋白酶（10000 U/g）、中性蛋白酶（50000 U/g）、風(fēng)味蛋白酶（30000 U/g）、木瓜蛋白酶（800000 U/g）、Lowry 法蛋白濃度測定試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE，25 U/g） 上海鼓臣生物技術(shù)有限公司；N-[3-（2-呋喃基）丙烯?；鵠-L-苯丙酰胺-甘氨酸-甘氨酸{N-[3-（2-Furyl）acryloyl]-Phe-Gly-Gly，F(xiàn)APGG} Sigma-Aldrich 公司；硼酸、四硼酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氫氧化鈉、甲醛等試劑 分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

SHA-B 型恒溫振蕩器、HH-4 型數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州智博瑞儀器制造有限公司；ST3100 型pH計(jì) 奧豪斯儀器（常州）有限公司；Neofuge 15R 型高速冷凍離心機(jī) 上海力申科學(xué)儀器有限公司；UV1-102II 型紫外/可見分光光度計(jì) 上海天美科學(xué)儀器有限公司；ZD-2 型自動電位滴定儀 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；CTFD-10P 型真空冷凍干燥機(jī)青島永合創(chuàng)信電子科技有限公司；ES502S 型電子天平 天津市德安特傳感技術(shù)有限公司；BSA224S-CW型電子分析天平 賽多利斯科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蛋白酶的篩選 以脫脂南極磷蝦粉為底物，分別在6 種蛋白酶的最適pH 和溫度條件下（堿性蛋白酶55 ℃，pH7.5；胰蛋白酶37 ℃，pH8.0；胃蛋白酶40 ℃，pH2.5；中性蛋白酶45 ℃，pH7.0；風(fēng)味蛋白酶50 ℃，pH7.0；木瓜蛋白酶55 ℃，pH6.5）進(jìn)行酶解反應(yīng)，根據(jù)底物質(zhì)量加入2.0%（v/m 或m/m）的蛋白酶、按照料液比1:6（g/mL）加入磷酸鹽緩沖液，混勻后酶解3 h，反應(yīng)結(jié)束后于沸水浴加熱20 min，冷卻至室溫，7500 r/min 離心20 min，收集上清液，測定ACE 抑制率。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn) 篩選出的最佳蛋白酶在上述pH 和溫度條件下，以酶解產(chǎn)物的ACE 抑制率和水解度為評價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行酶解時(shí)間、料液比、加酶量的單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。料液比1:6（g/mL）、加酶量2.0%（v/m），酶解時(shí)間分別為1、2、3、4、5 h，進(jìn)行酶解反應(yīng)；酶解時(shí)間3 h、加酶量2.0%（v/m），料液比分別為1:4、1:5、1:6、1:7、1:8（g/mL），進(jìn)行酶解反應(yīng)；酶解時(shí)間3 h、料液比1:6（g/mL），加酶量分別為1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%（v/m），進(jìn)行酶解反應(yīng)；酶解結(jié)束后于沸水浴加熱20 min，冷卻至室溫，7500 r/min 離心20 min，收集上清液，測定ACE抑制率和水解度。

1.2.3 響應(yīng)面試驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法對酶解時(shí)間（h）、料液比（g/mL）、加酶量（%）進(jìn)行三因素三水平設(shè)計(jì)，見表1。以ACE 抑制率為響應(yīng)值，對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，確定最佳酶解工藝條件。

1.2.4 南極磷蝦ACE 抑制肽的穩(wěn)定性 采用優(yōu)化確定的最佳工藝條件制備脫脂南極磷蝦粉酶解液，經(jīng)真空冷凍干燥即得南極磷蝦ACE 抑制肽樣品，考察溫度、pH 以及體外模擬胃腸道消化對其穩(wěn)定性的影響。

1.2.4.1 溫度對南極磷蝦ACE 抑制肽穩(wěn)定性的影響參照文獻(xiàn)[7,17]方法進(jìn)行測定：取適量樣品用去離子水配制成0.5 mg/mL 的溶液，分別置于25、37、60、80、100 ℃水浴中保溫1 h，保溫結(jié)束后冷卻至室溫，測定ACE 抑制率。

1.2.4.2 pH 對南極磷蝦ACE 抑制肽穩(wěn)定性的影響參照文獻(xiàn)[7,17]方法進(jìn)行測定：取適量樣品分別用pH2.0、4.0、6.0、7.0、8.0、10.0 的磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L）配制成0.5 mg/mL 的溶液，置于37 ℃水浴中保溫1 h，結(jié)束后調(diào)節(jié)溶液pH 至7.0，測定ACE抑制率。

1.2.4.3 體外模擬胃腸道消化對南極磷蝦ACE 抑制肽穩(wěn)定性的影響 參照文獻(xiàn)[7,17]方法進(jìn)行測定：取適量樣品用pH2.0 的磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L）配制成0.5 mg/mL 的溶液，加入底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)4.0%（m/m）的胃蛋白酶，置于37 ℃水浴振蕩消化反應(yīng)1.5 h，消化完成后分成兩部分，一部分沸水浴加熱10 min 終止反應(yīng)，為胃消化樣品；剩余部分繼續(xù)反應(yīng)，用1 mol/L 氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 至7.5，加入底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)4.0%（m/m）的胰蛋白酶，置于37 ℃水浴振蕩消化反應(yīng)2 h，反應(yīng)完成后沸水浴加熱10 min終止反應(yīng)，為胃腸消化樣品；分別測定消化前、胃消化、胃腸消化樣品的ACE 抑制率。

1.2.5 ACE 抑制率的測定 參考文獻(xiàn)[17]方法進(jìn)行測定：移取550 μL 樣品溶液，加入275 μL FAPGG溶液（0.25 mmol/L，使用0.1 mol/L 硼酸鹽緩沖液配制），混勻，然后加入275 μL ACE 酶液（0.125 U/mL），混勻后立即測定340 nm 下吸光值，然后于37 ℃孵育30 min，反應(yīng)結(jié)束后再次測定340 nm 處吸光值，以蒸餾水代替樣品溶液做對照，計(jì)算ACE 抑制率，公式如下：

ACE 抑制率（%）=（對照組吸光值差值-樣品組吸光值差值）/對照組吸光值差值×100

1.2.6 水解度的測定 水解度為酶解液中氨基酸態(tài)氮含量與總氮含量的比值[4,7]，公式如下：

水解度（%）=氨基酸態(tài)氮含量/總氮含量×100

氨基酸態(tài)氮含量的測定參照GB 5009.235-2016 中酸度計(jì)法的規(guī)定執(zhí)行：移取5 mL 酶解液于100 mL 容量瓶中，定容混勻后吸取20 mL 于250 mL錐形瓶中，加蒸餾水60 mL，用0.05 mol/L 氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至pH 為8.2。加入10 mL 甲醛溶液，混勻1 min，再用0.05 mol/L 氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液繼續(xù)滴定至pH 為9.2，記錄加入甲醛溶液后消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積為V1。另取80 mL 蒸餾水于250 mL 錐形瓶中，重復(fù)上述操作做空白組，記錄加入甲醛溶液后消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積為V2。計(jì)算氨基酸態(tài)氮含量，公式如下：

氨基酸態(tài)氮含量（g/100 mL）=（V1-V2）×0.05×0.014×100

總氮含量的測定參照GB 5009.5-2016 中凱氏定氮法的規(guī)定執(zhí)行：移取適量酶解液（記錄體積V）至消化管中，再加入0.4 g 硫酸銅、6 g 硫酸鉀及20 mL硫酸于消化爐消化，至消化液呈綠色透明狀，取出冷卻后定容至50 mL，用0.05 mol/L 鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于自動凱氏定氮儀上實(shí)現(xiàn)自動加液、蒸餾和滴定過程，記錄吸取消化液的體積為Vc，記錄消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積為Va。以蒸餾水代替樣品溶液做空白組，記錄消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積為Vb。計(jì)算總氮含量，公式如下：

總氮含量（g/100 mL）=（Va-Vb）×0.05×0.014×100/（V×Vc/100）

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”的形式表示，采用IBM SPSS 27.0、Excel 2007、Origin 2018、Design Expert 8.0.6 等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和圖表繪制。采用單因素方差分析進(jìn)行組間多重比較，以P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶的篩選

不同蛋白酶對酶解產(chǎn)物ACE 抑制活性的影響見圖1。相較于其他4 種蛋白酶，堿性蛋白酶與中性蛋白酶酶解產(chǎn)物具有更好的ACE 抑制活性（P<0.05），其中，堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物的ACE 抑制率最高，達(dá)到62.50%±0.52%。不同蛋白酶酶解脫脂南極磷蝦粉獲得的產(chǎn)物活性存在差異，這與蛋白酶的底物特異性有關(guān)[13]。堿性蛋白酶主要作用于含疏水性羧基的肽鍵，可水解產(chǎn)生較多的末端帶有疏水性氨基酸的多肽[13]。Kohmura 等[18]的研究指出，與末端為親水性氨基酸的多肽相比，末端為疏水性氨基酸的多肽更易與ACE 活性中心部位結(jié)合，達(dá)到更好的抑制ACE 活性的作用效果。綜合考慮蛋白酶的使用成本及酶解產(chǎn)物的ACE 抑制活性，本研究確定采用堿性蛋白酶進(jìn)行南極磷蝦ACE 抑制肽的制備。

圖1 不同蛋白酶對酶解產(chǎn)物ACE 抑制活性的影響Fig.1 Effect of different proteases on ACE inhibitory activity of enzymatic hydrolysates

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 酶解時(shí)間對酶解產(chǎn)物ACE 抑制活性和水解度的影響 酶解時(shí)間對酶解產(chǎn)物ACE 抑制活性和水解度的影響見圖2。酶解時(shí)間在1～4 h 范圍時(shí)，酶解產(chǎn)物的ACE 抑制活性隨著酶解時(shí)間的延長而逐漸提高；當(dāng)酶解時(shí)間為4 h 時(shí)，酶解產(chǎn)物的ACE 抑制活性最強(qiáng)（P<0.05），ACE 抑制率為70.50%±2.00%；而后隨著酶解時(shí)間的延長，酶解產(chǎn)物的ACE 抑制活性無顯著性變化（P>0.05）。酶解時(shí)間在1～3 h 范圍時(shí)，酶解產(chǎn)物的水解度顯著升高（P<0.05），而后隨著酶解時(shí)間延長，酶解產(chǎn)物的水解度無顯著性變化（P>0.05）。隨著酶解時(shí)間的增加，酶解反應(yīng)充分進(jìn)行，具有ACE 抑制活性的多肽逐漸增加，ACE 抑制率不斷升高；但當(dāng)酶解時(shí)間繼續(xù)延長，具有ACE 抑制活性的多肽增加的同時(shí)，也易因發(fā)生過度水解而遭到破壞[17,19-20]，酶解產(chǎn)物的ACE 活性相對穩(wěn)定。酶解時(shí)間在4 h 時(shí)，酶解產(chǎn)物的ACE 抑制率最高，且此時(shí)酶解產(chǎn)物水解度處于較高水平。綜上，選擇酶解時(shí)間3～5 h 進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化。

圖2 酶解時(shí)間對酶解產(chǎn)物ACE 抑制活性和水解度的影響Fig.2 Effect of enzymatic hydrolysis time on ACE inhibitory activity and hydrolysis degree of enzymatic hydrolysates

2.2.2 料液比對酶解產(chǎn)物ACE 抑制活性和水解度的影響 料液比對酶解產(chǎn)物ACE 抑制活性和水解度的影響見圖3。料液比在1:4～1:8（g/mL）范圍時(shí)，酶解產(chǎn)物的ACE 抑制活性隨著料液比的增加先升高后下降；當(dāng)料液比為1:7（g/mL）時(shí)，酶解產(chǎn)物的ACE抑制活性顯著最強(qiáng)（P<0.05），ACE 抑制率為69.67%±0.63%。料液比1:4～1:8（g/mL）范圍時(shí)，酶解產(chǎn)物的水解度先升高后下降，變化顯著（P<0.05）。料液比偏低時(shí)，反應(yīng)體系過于黏稠，蛋白酶無法與底物充分結(jié)合，酶解生成的具有ACE 抑制活性的多肽較少；隨著料液比的增加，酶與底物有效接觸，酶解反應(yīng)充分進(jìn)行，具有ACE 抑制活性的多肽逐漸增多，酶解產(chǎn)物ACE 抑制率升高；當(dāng)料液比繼續(xù)增加時(shí)，底物與蛋白酶的有效碰撞結(jié)合有所降低，具有ACE 抑制活性的多肽生成減少，酶解產(chǎn)物ACE 抑制率出現(xiàn)下降[7,17,20]。料液比在1:7（g/mL）時(shí)，酶解產(chǎn)物的ACE抑制率與水解度均處于最優(yōu)水平。綜上，選擇料液比1:6～1:8（g/mL）進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化。

圖3 料液比對酶解產(chǎn)物ACE 抑制活性和水解度的影響Fig.3 Effect of material liquid ratio on ACE inhibitory activity and hydrolysis degree of enzymatic hydrolysates

2.2.3 加酶量對酶解產(chǎn)物ACE 抑制活性和水解度的影響 加酶量對酶解產(chǎn)物ACE 抑制活性和水解度的影響見圖4。加酶量在1.0%～1.5%范圍時(shí)，酶解產(chǎn)物的ACE 抑制活性隨著加酶量的增加而升高；當(dāng)加酶量為1.5%時(shí)，酶解產(chǎn)物的ACE 抑制活性顯著最強(qiáng)（P<0.05），ACE 抑制率為68.49%±0.76%；而后隨著加酶量的增加，酶解產(chǎn)物的ACE 抑制活性顯著降低（P<0.05）。加酶量在1.0%～3.0%范圍時(shí)，酶解產(chǎn)物的水解度先上升后下降，變化顯著（P<0.05）。隨著加酶量的增加，底物逐漸被水解，具有ACE 抑制活性的多肽釋放增加，ACE 抑制率不斷升高；但當(dāng)加酶量繼續(xù)增加，蛋白酶與底物結(jié)合達(dá)到過飽和狀態(tài)而易導(dǎo)致底物過度水解，具有ACE 抑制活性的多肽遭到破壞，酶解產(chǎn)物活性降低[5,17,19]。加酶量在1.5%時(shí)，酶解產(chǎn)物的ACE 抑制率與水解度均處于最優(yōu)水平。綜上，選擇料加酶量1.0%～2.0%%進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化。

圖4 加酶量對酶解產(chǎn)物ACE 抑制活性和水解度的影響Fig.4 Effect of enzyme dosage on ACE inhibitory activity and hydrolysis degree of enzymatic hydrolysates

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，依據(jù)Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，對酶解時(shí)間（A）、料液比（B）與加酶量（C）進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。對響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到酶解產(chǎn)物ACE 抑制率（Y）與自變量A、B、C 的回歸方程為：Y=74.41-2.82A-0.95B+2.03C-1.68AB-1.52AC-4.05BC-2.53A2-5.97B2-6.11C2對實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ图盎貧w方程進(jìn)行顯著性分析，結(jié)果見表3。該回歸模型的F值為18.88、P=0.0004<0.01，表明建立的模型極顯著；失擬項(xiàng)F值為0.58、P=0.6582>0.05，表明失擬項(xiàng)不顯著；說明實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的隨機(jī)誤差對實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響較小，模型與數(shù)據(jù)的擬合程度較高。該回歸模型的R2=0.9604，調(diào)整系數(shù)R2adj=0.9096，信噪比Adeq Precision=12.391>4，表明該回歸方程的可信度較高[21]。變異系數(shù)CV 值為2.68%，表明該實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性好，模型可靠性較高[22]。此外，在本實(shí)驗(yàn)中，A、BC、B2、C2對酶解產(chǎn)物ACE 抑制率影響極顯著（P<0.01），C 對酶解產(chǎn)物ACE 抑制率影響顯著（P<0.05），B、AB、AC 對酶解產(chǎn)物ACE 抑制率影響不顯著（P>0.05）。由F值可知，各因素對酶解產(chǎn)物ACE 抑制活性的影響程度為：A>C>B，即酶解時(shí)間>加酶量>料液比。以上分析表明，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠性高，建立的模型可用于酶解脫脂南極磷蝦粉制備ACE 抑制肽工藝條件的分析和預(yù)測。

表2 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Box-Behnken experimental design and results

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

酶解時(shí)間、料液比、加酶量之間交互作用對酶解產(chǎn)物ACE 抑制率的影響見圖5～圖7。響應(yīng)面中曲面越陡，說明兩因素之間的交互作用對酶解產(chǎn)物ACE 抑制率的影響越顯著；軸向等高線密度與交互作用影響強(qiáng)度成正比[23]。通過對比圖5～圖7，交互作用BC 的響應(yīng)面曲線有顯著陡坡，軸向等高線密度小，說明酶解時(shí)間一定時(shí)，料液比與加酶量的交互作用對酶解產(chǎn)物ACE 抑制率的影響顯著；而交互作用AB、AC 的響應(yīng)面曲線坡度較小且相對平滑，軸向等高線密度大，說明酶解時(shí)間與料液比的交互作用、酶解時(shí)間與加酶量的交互作用對酶解產(chǎn)物ACE 抑制率的影響不顯著；各因素兩兩交互作用分析結(jié)果與方差分析中顯著性結(jié)果一致。

圖5 酶解時(shí)間與料液比交互作用對ACE 抑制率的影響Fig.5 Interaction effect of enzymatic hydrolysis time and material liquid ratio on ACE inhibition rate of enzymatic hydrolysates

圖6 酶解時(shí)間與加酶量交互作用對ACE 抑制率的影響Fig.6 Interaction effect of enzymatic hydrolysis time and enzyme dosage on ACE inhibition rate of enzymatic hydrolysates

圖7 料液比與加酶量交互作用對ACE 抑制率的影響Fig.7 Interaction effect of material liquid ratio and enzyme dosage on ACE inhibition rate of enzymatic hydrolysates

通過Design Expert 8.0.6 軟件分析得到采用堿性蛋白酶酶解脫脂南極磷蝦粉制備ACE 抑制肽的最優(yōu)工藝條件為：酶解時(shí)間3.39 h、料液比1:6.92（g/mL）、加酶量1.63%；在此條件下，酶解產(chǎn)物ACE 抑制率預(yù)測為75.58%。為便于實(shí)際應(yīng)用，將最佳酶解工藝條件調(diào)整為：酶解時(shí)間3.4 h、料液比1:7（g/mL）、加酶量1.6%。在此條件下進(jìn)行六次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，獲得的酶解產(chǎn)物ACE 抑制率為74.37%±0.87%，與理論值基本一致，證明該模型可靠、工藝整體可行。

2.4 南極磷蝦ACE 抑制肽的穩(wěn)定性

2.4.1 溫度對南極磷蝦ACE 抑制肽穩(wěn)定性的影響南極磷蝦ACE 抑制肽在25～60 ℃范圍時(shí)活性相對穩(wěn)定，ACE 抑制率在72.42%±0.68%以上（圖8）；當(dāng)溫度繼續(xù)升高，ACE 抑制率出現(xiàn)顯著先下降而后升高現(xiàn)象（P<0.05）。高溫條件易導(dǎo)致多肽變性聚集，引起活性下降[24-25]；而暴露于更高溫度環(huán)境中原有多肽鏈會分解生成新的小肽，產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，從而提高原有活性[26-28]；南極磷蝦ACE 抑制肽在不同高溫條件下活性出現(xiàn)差異性變化，推測與以上原因有關(guān)。綜上，南極磷蝦ACE 抑制肽具有良好的熱穩(wěn)定性，能夠在熱處理加工過程中保持較高的活性。

圖8 溫度對南極磷蝦ACE 抑制肽穩(wěn)定性的影響Fig.8 Effect of temperature on stability of ACE inhibitory peptides from Antarctic krill

2.4.2 pH 對南極磷蝦ACE 抑制肽穩(wěn)定性的影響南極磷蝦ACE 抑制肽在pH2.0～10.0 范圍內(nèi)，隨著pH 的增加，其ACE 抑制活性先升高后下降（圖9）；在pH7.0～8.0 條件下，南極磷蝦ACE 抑制肽的活性最高，酸性或堿性條件對其活性均影響顯著（P<0.05）。在堿性條件下，多肽易發(fā)生外消旋或脫酰胺反應(yīng)，導(dǎo)致活性減弱[29]；而酸性條件會影響多肽的溶解度，導(dǎo)致活性下降[30]。因此，南極磷蝦ACE 抑制肽的加工貯藏過程應(yīng)注意避免強(qiáng)酸、強(qiáng)堿條件的影響。

圖9 pH 對南極磷蝦ACE 抑制肽穩(wěn)定性的影響Fig.9 Effect of pH on stability of ACE inhibitory peptides from Antarctic krill

2.4.3 模擬胃腸道消化對南極磷蝦ACE 抑制肽穩(wěn)定性的影響 南極磷蝦ACE 抑制肽經(jīng)模擬胃液消化處理后，其ACE 抑制率由73.85%±1.39%下降至66.24%±1.00%，再經(jīng)模擬腸液消化處理后，其ACE抑制率下降至64.22%±0.86%（圖10）。多肽的生物活性主要依靠肽鏈中氨基酸分子間的協(xié)同作用，因此，氨基酸與多肽相比活性較弱[7]。南極磷蝦ACE抑制肽在胃腸消化過程中，經(jīng)胃蛋白酶、胰蛋白酶的作用進(jìn)一步水解成分子量更小的短肽及游離氨基酸，部分具有ACE 抑制活性的多肽被破壞，從而導(dǎo)致ACE 抑制活性降低[27]。南極磷蝦ACE 抑制肽經(jīng)胃腸道消化后，其活性仍能保持原有的86.96%，較好的消化穩(wěn)定性有利于其作為功能原料在健康食品中應(yīng)用。

圖10 胃腸道消化環(huán)境對南極磷蝦ACE 抑制肽穩(wěn)定性的影響Fig.10 Effects of gastrointestinal digestive environment on stability of ACE inhibitory peptides from Antarctic krill

3 結(jié)論

本研究優(yōu)化了南極磷蝦ACE 抑制肽的酶解制備工藝，并對其穩(wěn)定性進(jìn)行了評價(jià)。工藝研究結(jié)果表明，堿性蛋白酶是酶解脫脂南極磷蝦粉制備南極磷蝦ACE 抑制肽的最佳酶；經(jīng)單因素實(shí)驗(yàn)與響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化確定的最佳工藝條件為：酶解時(shí)間3.4 h、料液比1:7（g/mL）、加酶量1.6%，在此條件下，酶解產(chǎn)物的ACE 抑制率為74.37%±0.87%。穩(wěn)定性研究結(jié)果表明，采用優(yōu)化工藝制備獲得的南極磷蝦ACE 抑制肽具有良好的熱穩(wěn)定性和體外消化穩(wěn)定性；pH 條件對其穩(wěn)定性具有一定影響，其相關(guān)產(chǎn)品在加工和貯藏過程中應(yīng)避免強(qiáng)酸或強(qiáng)堿條件的影響。研究結(jié)果對于支撐南極磷蝦蛋白資源應(yīng)用于降壓類健康食品和醫(yī)藥制品等的開發(fā)具有積極意義。