李博文, 韓元圣, 黃高俊, 鄭 磊

(湖北省當(dāng)陽市人民醫(yī)院普外科, 湖北 當(dāng)陽 444100)

結(jié)腸癌是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一,具有較高發(fā)病率和死亡率。研究顯示,60%的結(jié)腸癌會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)移,最常轉(zhuǎn)移的器官有肝臟(40%)、肺(15%)或兩者皆有(10%)[1]?；熀褪中g(shù)切除是臨床治結(jié)腸癌的主要方式,但半數(shù)患者易出現(xiàn)局部或遠(yuǎn)處復(fù)發(fā)。因此,早期識(shí)別結(jié)腸癌至關(guān)重要。篩選新的分子生物標(biāo)志物有助于開發(fā)有效、敏感和可靠的臨床檢測結(jié)腸癌方法,方便早期診斷和設(shè)計(jì)精準(zhǔn)有效的治療策略,改善預(yù)后情況。微小RNA(microRNA,miRNA)是一種短單鏈蛋白編碼RNA分子,在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá),抑制翻譯和/或促進(jìn)mRNA降解[2]。miR-29b-3p是miR-29家族成員之一,已經(jīng)表明是多種人類惡性腫瘤的預(yù)后因子[3]。叉頭框O(forkhead box O,FOXO)家族是一種廣泛表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子,已被證明在許多組織中調(diào)控發(fā)育過程和能量代謝以及腫瘤發(fā)生[4]。叉頭蛋白O3A(forkhead box O3A,FOXO3A)位于人類6q21染色體上,是FOXO亞家族成員,通過靶向效應(yīng)基因的表達(dá)和活性,在調(diào)控多種細(xì)胞過程中發(fā)揮著重要作用,在人類結(jié)腸癌組織中FOXO3轉(zhuǎn)錄活性的喪失與腫瘤的生長有關(guān)[5]。miR-29b-3p和FOXO3A可能作為多種腫瘤的標(biāo)志物,但兩者是否可共同參與結(jié)腸癌發(fā)展需要進(jìn)一步明確。本研究通過檢測結(jié)腸癌組織中miR-29b-3p和FOXO3A的表達(dá)水平,旨在探討兩者表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系及在結(jié)腸癌患者預(yù)后中的作用,為探索結(jié)腸癌的診斷生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1一般資料:選取本院2015年1月至2017年1月期間收治的結(jié)腸癌患者82例作為研究對(duì)象,所有患者臨床資料完整且接受手術(shù)治療,術(shù)中收集患者結(jié)腸癌組織及距離腫瘤邊緣≥5cm的癌旁正常組織,保存于-80℃?zhèn)溆谩?2例患者中包括48例男性,34例女性;年齡42～75歲,平均(53.24±11.06)歲;TNM分期:Ⅰ～Ⅱ期45例,Ⅲ期37例;組織分化程度:高、中分化54例,低分化28例;腫瘤直徑:≥5cm 42例,<5cm 40例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移:有43例,無39例;腫瘤侵犯深度:黏膜35例,漿膜47例。所有患者經(jīng)病理診斷證實(shí)為結(jié)腸癌,術(shù)前未接受其他任何治療,排除炎癥性腸病、其他惡性腫瘤及含自身免疫疾病者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)同意,所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2方 法

1.2.1實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative PCR,qRT-PCR):各組稱取50mg組織樣品,根據(jù)Trizol試劑盒(貨號(hào):CD-13433-ML,武漢純度生物科技有限公司提供)的說明書,使用Trizol法從各組樣品中提取總RNA。使用NanoDrop ND-12000分光光度計(jì)(美國Thermo公司提供)評(píng)估總RNA濃度和純度。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)使用Prime ScriptTM RT Master Mix(貨號(hào):RRO47AA,日本Takara公司提供)進(jìn)行。使用SYBR Green Master Mix試劑盒(貨號(hào):Code NO.RR420L,日本Takara公司提供)在ABI7500檢測系統(tǒng)(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司提供)進(jìn)行qRT-PCR。qRT-PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參考SYBR Green Master Mix試劑盒說明書。miR-29b-3p和FOXO3A mRNA引物,及U6和β肌動(dòng)蛋白(β-actin)內(nèi)參引物由生工生物工程(上海)股份有限公司提供,引物序列見表1。使用2-ΔΔCt方法量化相對(duì)表達(dá),每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,重復(fù)3次。

表1 引物序列

1.2.2免疫印跡試驗(yàn)(Western blot):稱取100mg各組組織,用裂解液裂解從組織中提取的蛋白質(zhì),使用BCA蛋白濃度測定試劑盒(貨號(hào):P0009,碧云天生物技術(shù)提供)測定每個(gè)蛋白樣品的蛋白濃度進(jìn)行定量;在10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰(polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)凝膠上分離每組樣品等量的蛋白質(zhì)(40μg),將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏(二)氟乙烯(Polyvinylidene difluoride,PVDF)膜上,脫脂牛奶室溫封閉60min;一抗使用FOXO3A小鼠單抗體、β-actin小鼠單抗體(貨號(hào):AF609,貨號(hào):AF5001,碧云天生物技術(shù)提供),按照適當(dāng)比例用Western一抗稀釋液稀釋抗體,參照說明書的步驟進(jìn)行孵育;二抗選擇辣根過氧化物山羊抗小鼠IgG(H+L)(貨號(hào):A0216,碧云天生物技術(shù)提供),參考二抗的說明書進(jìn)行孵育;使用BeyoECL Plus試劑(貨號(hào):P0018S,碧云天生物技術(shù)提供)檢測蛋白質(zhì)條帶,檢測方法參考試劑盒說明書。

1.2.3隨訪:對(duì)結(jié)腸癌患者進(jìn)行術(shù)后定期檢查隨訪,隨訪時(shí)間60個(gè)月(截止至2022年1月),每5個(gè)月統(tǒng)計(jì)一次,隨訪方式為門診復(fù)查、電話或短信,隨訪結(jié)束后統(tǒng)計(jì)總生存率。

2 結(jié) 果

2.1各組織中miR-29b-3p、FOXO3A mRNA及蛋白表達(dá)水平的比較:結(jié)腸癌組織中miR-29b-3p表達(dá)水平明顯高于癌旁正常組織(P<0.05),FOXO3A mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯低于癌旁正常組織(P<0.05),見表2、圖1。

圖1 各組織中FOXO3A蛋白表達(dá)水平比較

表2 各組織中miR-29b-3p FOXO3A mRNA及蛋白表達(dá)水平的比較

2.2結(jié)腸癌組織中miR-29b-3p、FOXO3A mRNA表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系:根據(jù)結(jié)腸癌組織中miR-29b-3p、FOXO3A mRNA表達(dá)水平的平均值(1.55、0.48)分別將患者分為miR-29b-3p高表達(dá)組(n=40)和低表達(dá)組(n=42),FOXO3A mRNA高表達(dá)組(n=44)和低表達(dá)組(n=38)。結(jié)腸癌組織中miR-29b-3p和FOXO3A mRNA的表達(dá)均與患者的TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05),而與性別、年齡、組織分化程度、腫瘤直徑大小和腫瘤侵犯深度無關(guān)(P>0.05),見表3。

表3 結(jié)腸癌組織中miR-29b-3p FOXO3A mRNA表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系n(%)

2.3結(jié)腸癌組織中miR-29b-3p與FOXO3A mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性分析:結(jié)腸癌組織中miR-29b-3p與FOXO3A mRNA的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.479,P<0.05),見圖2。

圖2 miR-29b-3p與FOXO3A mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性分析

2.4結(jié)腸癌組織中miR-29b-3p、FOXO3A mRNA表達(dá)與患者生存率的關(guān)系:本研究隨訪結(jié)果顯示,82例結(jié)腸癌患者中生存57例(總生存率為69.51%),死亡25例。Kaplan-Meier生存曲線顯示,miR-29b-3p低表達(dá)組患者5年總生存率為83.33%(35/42),明顯高于高表達(dá)組患者的5年總生存率55.00%(22/40)(χ2=6.820,P=0.009);FOXO3A mRNA高表達(dá)組患者的5年總生存率為88.64%(39/44),明顯高于低表達(dá)組患者的5年總生存率47.37%(18/38)(χ2=16.005,P<0.05)。見圖3。

圖3 生存曲線分析

2.5影響結(jié)腸癌患者5年死亡的因素分析:TNM Ⅲ期、miR-29b-3p高表達(dá)及FOXO3A mRNA低表達(dá)是影響結(jié)腸癌患者5年死亡的危險(xiǎn)因素(P<0.05),見表4。

表4 影響結(jié)腸癌患者5年死亡的因素分析

3 討 論

結(jié)腸癌是世界范圍內(nèi)的死亡率較高的惡性腫瘤,其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,臨床治療困難。近年來,隨著臨床研究的深入發(fā)展,多種基因及其相關(guān)蛋白在惡性腫瘤增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及凋亡中具有關(guān)鍵作用已成為共識(shí)。miR-29b-3p、FOXO3A及其相關(guān)蛋白異常表達(dá)與結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切,研究導(dǎo)致其異常表達(dá)的原因至關(guān)重要。

miRNA不編碼蛋白質(zhì),但在癌癥的發(fā)展和治療中很重要,研究發(fā)現(xiàn)miRNA在結(jié)腸癌中異常表達(dá)[6]。最近的相關(guān)研究報(bào)道m(xù)iR-29b家族在預(yù)防癌癥的發(fā)生和發(fā)展方面發(fā)揮了多種功能,如誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期等[7]。miR-29b-3p作為miR-29家族成員之一,在多種類型癌癥中發(fā)揮調(diào)節(jié)因子的功能,在病理過程中具有重要作用。Li等[8]研究發(fā)現(xiàn),結(jié)腸癌細(xì)胞中miR-29b-3p表達(dá)水平顯著升高,miR-29b-3p在腫瘤增殖、侵襲過程中發(fā)揮一定作用。據(jù)報(bào)道,FOXO家族控制多種細(xì)胞功能,其表達(dá)失調(diào)在代謝紊亂、衰老和腫瘤抑制中發(fā)揮著重要作用。FOXO3A是FOXO家族中最重要的成員,其定位于細(xì)胞核,直接或間接調(diào)控基因表達(dá),其表達(dá)失調(diào)已被證實(shí)與多種類型癌癥的預(yù)后不良和惡性腫瘤嚴(yán)重程度有關(guān)。本研究中qRT-PCR結(jié)果顯示,miR-29b-3p在結(jié)腸癌組織中與癌旁正常組織相比表現(xiàn)為表達(dá)上調(diào),FOXO3A mRNA在結(jié)腸癌組織中與癌旁正常組織相比表現(xiàn)為表達(dá)下調(diào),另外Western blot結(jié)果顯示FOXO3A蛋白也呈現(xiàn)為低表達(dá),與mRNA的表達(dá)趨勢(shì)一致,說明兩者異常表達(dá)可能參與結(jié)腸癌的發(fā)病過程。陳發(fā)帥等[9]研究結(jié)果也表明FOXO3A在胃癌組織中表達(dá)降低,發(fā)揮抑癌作用,并且與腫瘤的分化程度有關(guān),可能發(fā)揮腫瘤抑制因子的功能。此外,有研究表明FOXO3A的低表達(dá)與結(jié)直腸癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[10]。本研究進(jìn)一步分析結(jié)果顯示,miR-29b-3p和FOXO3A mRNA的表達(dá)與結(jié)腸癌TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān),與上述研究結(jié)果相似,該結(jié)果提示miR-29b-3p的高表達(dá)和FOXO3A mRNA的低表達(dá)可能與結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移性存在關(guān)聯(lián)。

FOXO3A mRNA的3'-UTR含有多個(gè)miRNA靶向互補(bǔ)序列,許多miRNA在各種病理?xiàng)l件下可調(diào)節(jié)FOXO3A的表達(dá),本研究初步分析了miR-29b-3p、FOXO3A mRNA表達(dá)在結(jié)腸癌組織中的相關(guān)性,發(fā)現(xiàn)miR-29b-3p與FOXOA3 mRNA的表達(dá)呈負(fù)相關(guān),與該報(bào)道一致。且在最近的一項(xiàng)研究中提到,miRNA與其靶基因可存在相互作用,如FOXO3A可直接誘導(dǎo)miR-29b、miR-338表達(dá),在乳腺癌轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[11]。因此,我們推測FOXO3A可能誘導(dǎo)miR-29b-3p表達(dá)參與結(jié)腸癌的進(jìn)展。此外,為進(jìn)一步明確miR-29b-3p、FOXO3A與結(jié)腸癌患者預(yù)后的關(guān)系,本研究通過對(duì)結(jié)腸癌患者進(jìn)行隨訪統(tǒng)計(jì),采用Kaplan-Meier生存曲線分析,結(jié)果顯示,miR-29b-3p低表達(dá)組患者及FOXO3A mRNA高表達(dá)組患者具有更高的5年總生存率;同時(shí)進(jìn)行了危險(xiǎn)因素分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)TNM Ⅲ期、miR-29b-3p高表達(dá)及FOXO3A mRNA低表達(dá)是影響結(jié)腸癌患者5年死亡的危險(xiǎn)因素。說明miR-29b-3p、FOXO3A可能具有評(píng)估預(yù)后情況標(biāo)志物的潛力。綜上所述,miR-29b-3p在結(jié)腸癌組織中表達(dá)升高,FOXO3A mRNA及蛋白在結(jié)腸癌組織中表達(dá)降低,且miR-29b-3p、FOXO3A mRNA均與腫瘤的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后相關(guān),可以作為結(jié)腸癌患者預(yù)后評(píng)估的生物標(biāo)志物。但miR-29b-3p與FOXO3A具體以哪種形式在結(jié)腸癌中發(fā)揮作用,尚需增加體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行證實(shí)。