姜明玉，曹文瑞，薩仁高娃，常鳳鳴

1. 中國科學(xué)院海洋研究所海洋地質(zhì)與環(huán)境重點實驗室，青島 266071

2. 中國科學(xué)院海洋大科學(xué)研究中心，青島 266071

3. 嶗山實驗室海洋地質(zhì)過程與環(huán)境功能實驗室，青島 266237

稀土元素對新型電子設(shè)備和新能源技術(shù)的發(fā)展至關(guān)重要，也是很多國家改造傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)，發(fā)展高新技術(shù)和國防尖端技術(shù)不可或缺的戰(zhàn)略資源。我國是稀土原材料的主要加工地（約85%），同時也是世界最大的稀土氧化物消費國[1]。當(dāng)前，受全球綠色能源轉(zhuǎn)型的推動，未來清潔能源技術(shù)相關(guān)的需求可能會進(jìn)一步增長。由于這樣巨大的需求前景和潛在的供應(yīng)鏈風(fēng)險，近年來很多國家開始尋求新的稀土礦產(chǎn)資源[2]。日本學(xué)者Kato 等在2011 年報道了在南太平洋東部和北太平洋中部廣泛分布著具有高稀土含量的深海沉積物，其中深海泥中總稀土含量可高達(dá)1 000～2 230 μg/g，其稀土含量與我國華南離子吸附型礦床相當(dāng)或更高[3]，這一報道引發(fā)了國內(nèi)外學(xué)者對深海富稀土沉積物研究的熱情。

在自然界，稀土礦物被發(fā)現(xiàn)存在于內(nèi)生和表生或次生礦床中。內(nèi)生礦床指在地殼中通過巖漿-熱液過程形成的礦床[4]，而表生或次生礦床則通過風(fēng)化和沉積過程在地表形成[5]；前者主要包括碳酸巖、堿性巖和熱液型礦床，后者主要為離子吸附型、砂礦和海底沉積型礦床[6-7]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，我國華南離子吸附型稀土礦床中稀土元素的富集主要受鐵氧化物-黏土礦物復(fù)合體的共同約束[8]。而對于海底沉積物型的稀土礦物的形成過程，近些年的研究也取得了一些進(jìn)展[9-11]。印度洋海盆的沉積物中有非常高的稀土含量, 稀土元素的組成和太平洋接近，其來源主要受到陸源物質(zhì)和火山物質(zhì)影響，推測稀土元素可能是吸附在其他物質(zhì)沉積后再向磷灰石富集[12-13]。東太平洋CC 區(qū)多個富稀土站位沉積物均以沸石黏土為主，西太平洋深海底泥中稀土元素的主要賦存礦物為磷酸鹽礦物，包括磷灰石、獨居石和磷釔礦等[14-15]。然而隨著研究的深入，研究者發(fā)現(xiàn)在各種礦物的形成過程中也包含了微生物驅(qū)動的生物礦化的過程，礦物-微生物相互作用在環(huán)境變化、元素生物地球化學(xué)循環(huán)和礦床形成中起著重要作用[16]。微生物廣泛分布于各種海洋地質(zhì)環(huán)境中，它們參與了從地球表面到地下深部巖石圈中很多的地質(zhì)地球化學(xué)過程[17]。研究發(fā)現(xiàn)海洋微生物是海底沉積作用和成礦作用的主要參與者和作用者，微生物不僅能催化成礦元素富集、沉淀直接成礦，而且還可以改變介質(zhì)的酸堿條件促使成礦元素沉淀聚集而間接成礦[18-20]。深海礦物的形成也包含了微生物（生物礦化）驅(qū)動的生物過程。例如在富稀土的大洋多金屬結(jié)核中發(fā)現(xiàn)的顆石藻化石以及生物膜的印記[21]，還有研究發(fā)現(xiàn)海洋細(xì)菌在產(chǎn)生氧化表面的沉積物中起關(guān)鍵作用[22]。

海洋沉積物中微生物多樣性的分析提示了微生物參與了海洋地質(zhì)環(huán)境的形成過程[23-26]。海洋微生物在稀土礦產(chǎn)資源形成過程中發(fā)揮的作用以及稀土元素的海洋微生物成礦過程尚不明確。為了探討這些問題，我們選取了從深海沉積物中成功分離培養(yǎng)的幾種細(xì)菌，開展了海洋細(xì)菌對稀土元素富集和礦化過程的研究，期待能為大洋中稀土礦產(chǎn)資源的生物成因過程提供一些理論依據(jù)，具有十分重要的學(xué)術(shù)意義和實際意義。

1 材料與方法

通過收集整理前期已經(jīng)成功從沉積物樣品（東海大陸架CW126/沖繩海槽CW27）中分離純化的200 余株單克隆菌落，通過比較微生物的分布規(guī)律、數(shù)量及種類，初步篩選出3 種海洋細(xì)菌進(jìn)行實驗室稀土元素鈰（Ce）的吸附富集模擬實驗。沉積物樣品的采樣站位圖如圖1 所示。從沖繩海槽表層沉積物（表層4 cm, 水深1 193 m）中分離培養(yǎng)出Paenisporosarcinasp. CW27-A08（芽孢八疊球菌），從東海大陸架表層沉積物（表層1 cm, 水深81.13 m）中分離培養(yǎng)出Jeotgalibacillussp. CW126-A03（咸海鮮芽孢桿菌）和Sulfitobactersp. CW126-B11（亞硫酸桿菌）。菌株CW27-A08 為革蘭氏陽性菌, 呈橢圓或桿狀, 大小約1.0～2.0 μm, 菌株16s RNA 基因序列為GenBank No.KP307800。菌株CW126-A03 為革蘭氏陽性菌，呈橢圓或桿狀，大小約1.5～2.0 μm，菌株16s RNA 基因序列為GenBank No.MT845653。菌株CW126-B11 為革蘭氏陰性菌，呈桿狀，大小約0.5～1.5 μm，菌株16s RNA 基因序列為GenBank No.KP307833。將凍存于-80 ℃冰箱中的菌種活化后接種到2216E 液體培養(yǎng)基中, 在25 ℃搖床120 r/min 下培養(yǎng)1 天后備用。2216E 培養(yǎng)基組成為：過濾后的天然海水，5 g/L 蛋白胨，1 g/L 酵母提取物，混合后pH 調(diào)節(jié)至7.25。

圖1 沉積物樣品采樣站位圖Fig.1 Map of sediment sampling stations

實驗室模擬不同海洋細(xì)菌對稀土元素Ce 的吸附富集實驗，實驗中設(shè)置不同濃度Ce 的反應(yīng)體系，反應(yīng)溫度為4 ℃，反應(yīng)時間0～2 個月。反應(yīng)過程中在不同的時間點間隔取樣, 測定反應(yīng)體系中稀土Ce 離子濃度的變化和pH 值的變化，并通過掃描電鏡（SEM-scanning electron microscope）和透射電鏡（TEM-transmission electron microscope）及能譜儀（EDS-energy dispersive spectrometer）觀察不同反應(yīng)時間細(xì)菌表面稀土元素Ce 形態(tài)的變化情況。反應(yīng)體系采用人工海水（24.32 g/L NaCl, 10.98 g/L MgCl2·6H2O, 4.06 g/L Na2SO4, 0.20 g/L NaHCO3, 0.027 g/L H3BO3, 0.10 g/L KBr, 0.69 g/L KCl, 1.14 g/L CaCl2）,pH 為7.8。實驗實施過程中測定反應(yīng)體系中細(xì)菌密度的方法為：將已知體積的菌液離心后（6 000 rpm），去掉上清液，放入冰箱冷凍后進(jìn)行低壓冷凍干燥，稱量菌體的干重。反應(yīng)中所用的溶液和實驗器材都經(jīng)過滅菌處理，實驗在無菌操作臺中進(jìn)行。

采用電感耦合等離子體質(zhì)譜（inductively coupled plasma mass spectrometry, ICP-MS, Thermo Fisher 公司, ICAPQC）測定反應(yīng)體系中的稀土元素Ce 和P 的離子濃度。在不同反應(yīng)時間點取樣，離心后吸取上清液，并用0.22 μm 聚四氟乙烯濾膜過濾后制成測試樣品，測定元素濃度。運用掃描電鏡（SEM,Hitachi, S-4800 型）分析測定模擬實驗中細(xì)菌表面形態(tài)的變化。取反應(yīng)液4 000 r/min 離心10 min 后去除上清液, 用超純水反復(fù)清洗菌液3 遍后, 吸取少量菌液滴到硅片上, 烘干后固定于電鏡樣品臺上，進(jìn)行掃描電鏡觀察, 工作電壓15 kV。采用透射電鏡（TEM,荷蘭飛利浦公司, CM12/STEM）考察相互作用過程中微生物表面形成的礦物形態(tài)。取反應(yīng)液在4 000 r/min離心10 min 后去除上清液, 用超純水反復(fù)清洗菌液3 遍, 重懸后吸取少量菌液滴到銅網(wǎng)上, 待干燥后進(jìn)行觀察。工作電壓為120 kV，點分辨率0.34 nm，配備電子衍射分析系統(tǒng)和能譜分析系統(tǒng)。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同海洋細(xì)菌對稀土元素Ce 的吸附富集過程

已經(jīng)成功分離培養(yǎng)并篩選出的成礦微生物菌株CW126-A03（標(biāo)記為A03）、菌株CW27-A08（標(biāo)記A08）、菌株CW126-B11（標(biāo)記為B11）的SEM 圖展示了3 種海洋細(xì)菌的形貌特征（圖2）。3 種海洋細(xì)菌均呈現(xiàn)橢圓狀或桿狀，大小約0.5～2.0 μm。通過觀察三種細(xì)菌接種后的生長周期，均在12～24 h處于對數(shù)生長期，此時細(xì)胞數(shù)量迅速增長，代謝活動旺盛，適宜進(jìn)行接種實驗。在24 h 后，生長速率逐漸降低，細(xì)菌生長進(jìn)入穩(wěn)定期。

在設(shè)定4℃人工海水的環(huán)境下，分別考察了3 種不同海洋細(xì)菌對Ce 的吸附富集過程。利用ICP-MS 測定不同反應(yīng)時間下（0～2 個月）元素Ce、P 濃度的變化，并檢測反應(yīng)過程中pH 值的變化，分析海洋細(xì)菌吸附稀土元素的化學(xué)動力學(xué)過程。圖3顯示了不同海洋細(xì)菌對稀土元素Ce 吸附的時間曲線，其中Ce 的初始濃度均為1.4 μg/g，反應(yīng)體系中菌株CW126-A03、菌株CW27-A08、菌株CW126-B11的細(xì)菌干密度分別為0.26 、0.12、0.10 g/L。Ce 的吸附率為反應(yīng)溶液中Ce 離子濃度降低值占Ce 初始濃度值的百分比數(shù)。隨著反應(yīng)時間的增長，溶液中Ce 濃度相對于初始Ce 濃度的降低，反映了稀土Ce 被海洋細(xì)菌吸附富集的過程。結(jié)果顯示3 種不同的海洋細(xì)菌對稀土元素都有富集作用，反應(yīng)體系中稀土元素的濃度隨著反應(yīng)時間的增長而逐漸降低，稀土元素Ce 的累計吸附率隨時間增長而逐漸增大。從吸附曲線上可以看出，海洋細(xì)菌對Ce 初期的吸附速率較快，3 種細(xì)菌初始的吸附率均達(dá)到60%以上，并在反應(yīng)2 周后達(dá)到95%以上。菌株CW126-B11 相對于CW126-A03 和CW27-A08 對稀土Ce 有較快的吸附效率。

圖3 不同海洋細(xì)菌對Ce 的時間吸附曲線Fig.3 Curves of time-dependent adsorption of Ce by different marine bacteria

圖4 顯示了3 種不同海洋細(xì)菌吸附富集稀土Ce 的過程中反應(yīng)體系中P 元素濃度的變化趨勢大概相似。隨著反應(yīng)時間的增長體系中P 的濃度都呈現(xiàn)先快速降低，隨后保持低濃度一段時間，然后再升高的一個過程。說明海洋細(xì)菌在吸附富集稀土Ce 的過程中，大致可以分為3 個階段。在起初的24 h 內(nèi)，帶正電荷Ce3+被快速地吸附在細(xì)胞表面，與細(xì)胞表面帶負(fù)電荷的官能團(tuán)（尤其以磷酸鹽官能團(tuán)為主）形成絡(luò)合物，從而消耗了初始溶液中細(xì)菌代謝產(chǎn)生的P[27]。隨著稀土Ce 被細(xì)菌富集完成，溶液中的P 濃度被消耗從而保持在低濃度狀態(tài)。然而隨著反應(yīng)時間的增長，溶液中細(xì)菌的活性減弱，細(xì)胞壁可能會破裂，從而導(dǎo)致P 從細(xì)胞中逐漸被釋放出來，因而反應(yīng)體系中的P 濃度又會增高。反應(yīng)初期溶液中P 濃度的降低和Ce 的迅速被吸附相對應(yīng)，表明海洋細(xì)菌對稀土Ce 有一個快速細(xì)胞表面吸附的過程。這個現(xiàn)象與之前發(fā)現(xiàn)的真菌和細(xì)菌對稀土的吸附過程相似[28]。研究發(fā)現(xiàn)不同海洋細(xì)菌的反應(yīng)體系中，反應(yīng)過程中pH 的變化范圍相似（在7.3～7.8 之間）（圖5），反應(yīng)初期稍有波動，后期相對較穩(wěn)定。

圖4 反應(yīng)過程中P 濃度隨時間的變化規(guī)律Fig.4 Variation of P concentration with time during the reaction

圖5 反應(yīng)過程中pH 的變化Fig.5 The change of pH during the reaction

2.2 海洋細(xì)菌對稀土元素Ce 吸附富集的影響因素

圖3 展示了不同的海洋細(xì)菌對稀土元素的吸附速率也有所不同，在相同Ce 初始濃度的反應(yīng)體系中，菌密度較低的革蘭氏陰性菌CW126-B11 依然比菌密度高的革蘭氏陽性菌CW126-A03 和CW27-A08 吸附富集稀土Ce 的效率稍高，初步推斷這與微生物自身的組成結(jié)構(gòu)及細(xì)胞表面的結(jié)構(gòu)特征有關(guān)[29]。此外，通過研究同種海洋細(xì)菌CW126-A03 對稀土元素Ce 在不同初始濃度條件下的吸附過程，來進(jìn)一步考察海洋細(xì)菌吸附富集Ce 的影響因素。實驗中設(shè)置了3 個反應(yīng)體系，分別為Ce 初始濃度為0.14 ug/g 時CW126-A03 菌干密度為0.36 g/L；Ce 初始濃度為1.4 μg/g 時細(xì)菌干密度為0.26 g/L；Ce 初始濃度為14 μg/g 時細(xì)菌干密度為0.36 g/L。圖6 顯示了CW126-A03 對Ce 在7 天內(nèi)的短期吸附過程，細(xì)菌密度較大反應(yīng)體系中（0.14 μg/g 和14 μg/g）對稀土Ce 的吸附速率較快。在相同菌密度條件下，稀土Ce 初始濃度較低的體系（0.14 μg/g）中細(xì)菌的吸附速率在前4 天相對稍快一些。

圖6 Jeotgalibacillus sp. CW126-A03 對Ce 的短期吸附過程Fig.6 Process of short-term adsorption of Ce by Jeotgalibacillus sp. CW126-A03

圖7 顯示了CW126-A03 對Ce 在45 天內(nèi)的相對較長期吸附過程，3 種不同體系中反應(yīng)初期14 天內(nèi)的吸附速率各有不同，隨著反應(yīng)時間增長，14 天后海洋細(xì)菌對稀土Ce 的富集率都達(dá)到98%以上。這些實驗結(jié)果表明海洋細(xì)菌吸附富集稀土元素的效率主要與細(xì)菌密度和稀土元素濃度有關(guān)，在相同的元素濃度條件下，菌密度越高短期的吸附速率越快。而隨著吸附富集時間的增長，細(xì)菌活性降低及代謝產(chǎn)物的增加，可能會誘導(dǎo)稀土元素完成更多的富集和沉淀。綜上所述，細(xì)菌種類以及細(xì)菌密度與被吸附元素濃度的比例關(guān)系，是影響海洋細(xì)菌富集稀土元素的主要影響因素。前期有研究表明，不同微生物細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)特征不同，細(xì)胞表面的吸附位點（官能團(tuán)）數(shù)量也不同，因而對金屬陽離子的吸附能力也有差異[30-32]。

圖7 Jeotgalibacillus sp. CW126-A03 對Ce 的長期吸附過程Fig.7 Process of long-term adsorption of Ce by Jeotgalibacillus sp. CW126-A03

結(jié)果顯示3 種細(xì)菌對Ce 均有吸附富集作用，在幾個不同的反應(yīng)體系中，海洋細(xì)菌對稀土Ce 有一個快速細(xì)胞表面吸附的過程，都表現(xiàn)出在初期10 h 內(nèi)稀土元素的富集速率明顯大于后期階段，能完成90%以上的富集。3 種不同體系中反應(yīng)初期14 天內(nèi)的吸附速率各有不同，隨著反應(yīng)時間增長，14 天后海洋細(xì)菌對稀土Ce 的富集率都達(dá)到98%以上。海洋細(xì)菌吸附富集稀土元素的效率主要與細(xì)菌密度和稀土元素濃度有關(guān)，即主要受金屬/生物量比率的影響[33]。另外不同的海洋細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)不同，對稀土元素的吸附力也有所不同。

2.3 稀土元素Ce 富集成礦過程中細(xì)菌表面的礦物形態(tài)分析

實驗中在不同時間間隔取樣并收集吸附后的微生物樣品，利用SEM 和TEM-EDS 分析手段測定稀土元素Ce 富集成礦過程中Ce 形態(tài)的變化和所生成的稀土礦物的組成，從而進(jìn)一步分析討論海洋細(xì)菌對稀土礦化的過程和作用機(jī)理。圖8 顯示了菌株CW126-A03 富集稀土Ce 七天后的SEM 圖像，反應(yīng)體系中稀土Ce 的初始濃度為1.4 μg/g，細(xì)菌干密度為0.26 g/L。SEM 圖中展示了在細(xì)菌表面及周圍有大量的沉積顆粒物，顆粒物的大小約幾百納米，有的聚集在一起形成較大的顆粒物，暗示菌株CW126-A03 對稀土Ce 有富集成礦的作用。菌株CW126-A03 和CW126-B11 富集稀土Ce 3 天后的TEM 圖像（圖9）更清晰地展示了細(xì)胞表面富集沉積顆粒的形態(tài)，兩種海洋細(xì)菌表面均聚集了大小不同的微小顆粒物，大小約為50～200 nm，這些顆粒物在細(xì)胞表面分布不均勻。有研究報道，不同細(xì)菌細(xì)胞壁表面總官能團(tuán)位點密度不同，因而對金屬陽離子的吸附和絡(luò)合能力也不同[30]，從而導(dǎo)致不同海洋細(xì)菌對稀土元素的吸附富集能力也不同。

圖8 Jeotgalibacillus sp. CW126-A03 富集稀土Ce 的SEM 圖像Fig.8 SEM image of Jeotgalibacillus sp. CW126-A03 enriched in Ce

圖9 Jeotgalibacillus sp. CW126-A03 和Sulfitobacter sp. CW126-B11 富集稀土Ce 的TEM 圖像Fig.9 TEM image of Jeotgalibacillus sp. CW126-A03 and Sulfitobacter sp. CW126-B11 enriched in Ce

圖10 中顯示了菌株CW126-B11 富集稀土Ce的TEM-EDS 圖像，通過EDS 進(jìn)一步解析了細(xì)菌表面生成的沉積物顆粒組成，細(xì)菌吸附反應(yīng)3 天后在細(xì)胞表面形成的顆粒物中含有明顯的Ce、P、Si 以及其他組成細(xì)胞的基本元素成分，并對細(xì)胞表面含Ce 的礦物顆粒（白色圓圈內(nèi)）進(jìn)行了電子衍射光譜的分析，顯示礦物顆粒呈現(xiàn)無定形態(tài)的非晶相結(jié)構(gòu)。這些數(shù)據(jù)顯示在長時間的吸附過程中海洋細(xì)菌表面形成了含稀土元素Ce 的磷酸鹽或硅酸鹽沉淀顆粒，生物吸附導(dǎo)致了稀土元素從反應(yīng)溶液中的提取并礦化，與前面溶液中Ce 濃度變化的數(shù)據(jù)（圖3、7）相吻合。研究結(jié)果表明海洋細(xì)菌在稀土的礦化過程中起著重要作用，稀土元素先快速吸附在細(xì)胞表面，隨著吸附時間增長，被吸附的Ce 逐漸富集生成含稀土的礦物顆粒（直徑50～200 nm）。

圖10 Sulfitobacter sp. CW126-B11 富集稀土Ce 的TEM-EDS 圖像Fig.10 TEM-EDS image of Sulfitobacter sp. CW126-B11 enriched in Ce

研究發(fā)現(xiàn)稀土元素可以在細(xì)胞表面被礦化形成含稀土Ce 的磷酸鹽或硅酸鹽非晶相結(jié)構(gòu)的礦物顆粒。綜合實驗結(jié)果表明稀土元素Ce 首先被吸附在細(xì)胞表面形成成核點，隨后被吸附的稀土離子與細(xì)胞內(nèi)部釋放出來的P 等元素反應(yīng)，在細(xì)菌表面形成含有稀土元素Ce 的礦物顆粒。說明海洋細(xì)菌在稀土的礦化過程中起著重要作用，稀土元素先快速吸附在細(xì)胞表面，隨著吸附時間增長，逐漸被富集生成含稀土的礦物顆粒（直徑50～200 nm），這些礦物顆粒大小可能隨富集時間的增長而增大，甚至從細(xì)胞表面脫落下來，從而進(jìn)一步討論了海洋細(xì)菌對稀土元素富集礦化過程和作用機(jī)理。

3 結(jié)論

（1）三種不同海洋細(xì)菌菌株CW126-A03、菌株CW27-A08、菌株CW126-B11 對稀土Ce 均有吸附富集作用。海洋細(xì)菌吸附富集稀土元素的效率主要與細(xì)菌密度和稀土元素濃度有關(guān)，即主要受金屬元素/生物量比率的影響[33]。另外不同的海洋細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)不同，對稀土元素的吸附力也有所不同。

（2）利用SEM、TEM-EDS 分析測定稀土元素富集成礦過程中稀土元素Ce 形態(tài)的變化和所生成的稀土礦物的結(jié)構(gòu)，研究發(fā)現(xiàn)稀土元素Ce 首先被吸附在細(xì)胞表面形成成核點，隨后被吸附的稀土離子與細(xì)胞內(nèi)部釋放出來的P 等元素反應(yīng)，在細(xì)胞表面被礦化形成含稀土Ce 的磷酸鹽或硅酸鹽非晶相結(jié)構(gòu)的礦物顆粒。

（3）通過初步開展海洋細(xì)菌對稀土元素富集和礦化過程的研究，進(jìn)一步討論了海洋微生物成礦的過程和作用機(jī)理，期待能為大洋中稀土礦產(chǎn)資源的生物成因過程提供一些理論依據(jù)。同時也因?qū)嶒灄l件有限，實驗室不能完全模擬海底環(huán)境，模擬實驗中還存在一些不足之處，期待本研究能為后面的研究提供一些借鑒。