張 崢，邵鳳俠，金曉玲，周宏香，張 哲，李衛(wèi)東

（1.中南林業(yè)科技大學(xué) 風(fēng)景園林學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410004；2.湖南省園藝研究所 園林花卉種質(zhì)創(chuàng)新與綜合利用湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410125）

花型花色單一、花期短、花葉均賞品種稀缺是木蘭科Magnoliaceae 植物雜交育種的主要問題[1]。目前有關(guān)含笑屬M(fèi)ichelia雜交親和性的研究較少，而了解物種間親和性關(guān)系是培育新品種的關(guān)鍵。有研究認(rèn)為：在含笑屬遠(yuǎn)緣雜交過程中存在不親和現(xiàn)象[2-3]。王亞玲等[4]則發(fā)現(xiàn)含笑屬內(nèi)種間雜交大多表現(xiàn)親和，而紫花含笑M.crassipes×金葉含笑M.foveolata則不親和，但未對(duì)不親和原因進(jìn)行探究。金葉含笑隸屬木蘭科含笑屬，其花淡黃白色，花被片內(nèi)扣形成獨(dú)特花型，葉背密被紅褐色柔毛，是木蘭科中珍稀的花葉共賞樹種，也是木蘭科優(yōu)良的雜交親本材料。紫花含笑是含笑屬珍稀的紫色花色植物，含笑M.figo的花被片邊緣有紫色條紋。本研究通過金葉含笑與紫花含笑和含笑的雜交育種研究，以期將三者的優(yōu)良性狀相結(jié)合，培育出花葉共賞新品種，提高金葉含笑利用價(jià)值，豐富含笑屬種質(zhì)資源，并探究不親和的原因，以期提高含笑屬雜交成功率，為含笑屬遠(yuǎn)緣雜交育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

金葉含笑和紫花含笑來自湖南省長(zhǎng)沙市湖南省科技示范園，含笑來自中南林業(yè)科技大學(xué)校園。

1.2 雜交授粉試驗(yàn)

于2021 年和2022 年4—5 月，收集金葉含笑、含笑、紫花含笑的花粉，置于-20 ℃的冰箱保存。在授粉前進(jìn)行花粉活力測(cè)定，確保各親本的花粉活力在60%以上。培養(yǎng)基配方參考柴弋霞等[5]并改良，采用固體培養(yǎng)基。紫花含笑花粉活力測(cè)定所用培養(yǎng)基的配制方法：150 g·L-1蔗糖 + 300 mg·L-1硼酸 + 300 mg·L-1氯化鈣+ 8 g·L-1瓊脂；含笑花粉活力測(cè)定所用培養(yǎng)基的配制方法：100 g·L-1蔗糖 + 200 mg·L-1硼酸 + 300 mg·L-1氯化鈣 + 8 g·L-1瓊脂；作者通過預(yù)實(shí)驗(yàn)已篩選出金葉含笑花粉活力測(cè)定的最適培養(yǎng)基為50 g·L-1蔗糖 +200 mg·L-1硼酸 + 300 mg·L-1氯化鈣 + 8 g·L-1瓊脂。雜交組合 (♀×♂） ：含笑×金葉含笑、紫花含笑×金葉含笑、金葉含笑×含笑、金葉含笑×紫花含笑。每個(gè)組合授粉30～34 朵花。

1.3 結(jié)實(shí)情況統(tǒng)計(jì)

授粉后，在當(dāng)年9—12 月，采集各雜交組合的果實(shí)，統(tǒng)計(jì)坐果率、結(jié)籽率、單個(gè)果序上的蓇葖膨大率、種子數(shù)、單個(gè)蓇葖內(nèi)含種子數(shù)、形態(tài)異常種子占比和千粒重。

1.4 播種與萌發(fā)率統(tǒng)計(jì)

用洗滌劑將雜交種子富含油脂的外種皮搓洗掉，經(jīng)質(zhì)量濃度為0.3%的高錳酸鉀溶液消毒30 min，再用雙蒸水(ddH2O）反復(fù)清洗，隨后播種，統(tǒng)計(jì)各雜交組合種子的出苗率。

1.5 熒光顯微鏡觀察花粉管生長(zhǎng)情況

參考柴弋霞等[5]的方法并改良，在母本花蕾期去除花被片及雄蕊，授予父本花粉并套袋，在授粉后2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、1 d、2 d、4 d、6 d、8 d 取下雌蕊放入FAA 固定液中，待固定48 h 以上后，用解剖針將雌蕊從雌蕊群柄上取下，進(jìn)行體積分?jǐn)?shù)為50%、30%、10%乙醇和蒸餾水逐級(jí)復(fù)水，每級(jí)復(fù)水15 min。復(fù)水后將雌蕊置于1 mol·L-1氫氧化鈉溶液中，60 ℃水浴軟化3 h，隨后用蒸餾水重復(fù)清洗3 次，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%苯胺藍(lán)避光染色12 h。由于金葉含笑花柱從中部至子房基部均密被銀灰色短絨毛，采用常規(guī)壓片時(shí)花粉管會(huì)被絨毛所覆蓋，很難觀察到花粉管的生長(zhǎng)情況，因此在本研究中，將授粉12 h 前的花柱切下，再將授粉12 h 后各時(shí)間點(diǎn)的子房壁沿心皮背縫線和腹縫線方向削去直至漏出胚珠，軟化后使截面呈透明。將上述處理后的材料常規(guī)壓片后置于萊卡(Leica）熒光倒置顯微鏡下觀察花粉管的生長(zhǎng)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光顯微鏡觀察花粉管生長(zhǎng)情況

2.1.1 含笑×金葉含笑花粉管的生長(zhǎng)情況 如圖1 所示：授粉2 h 時(shí)，僅有極少量的花粉附著在含笑柱頭表面且花粉未萌發(fā)(圖1A）；4、6 h 時(shí)，附著在含笑柱頭表面的花粉數(shù)量逐漸增多，但同樣未萌發(fā)(圖1B和C）；8 h 時(shí)，有少量花粉開始萌發(fā)，花粉管長(zhǎng)度為花粉粒直徑的1.5～2.0 倍(圖1D）；10 h 時(shí)，萌發(fā)的花粉數(shù)量增加，花粉管長(zhǎng)度為花粉粒直徑的2.0～3.0 倍，此時(shí)花粉管無匯聚現(xiàn)象(圖1E）；1 d 時(shí)，花粉大量萌發(fā)，花粉管長(zhǎng)度生長(zhǎng)至花粉粒直徑的3.0 倍以上，花粉管出現(xiàn)了明顯的匯聚現(xiàn)象(圖1F）；2 d時(shí)，花粉管生長(zhǎng)至近花柱底部，即將進(jìn)入子房(圖1G）；4 d 時(shí)，花粉管進(jìn)入子房，生長(zhǎng)至子房1/3～1/2 處(圖1H）；6 d 時(shí)，有少數(shù)生長(zhǎng)較快的花粉管進(jìn)入胚珠(圖1I）；8 d 時(shí)，大多數(shù)花粉管在此時(shí)已進(jìn)入胚珠(圖1J）。但同時(shí)也出現(xiàn)了花粉管生長(zhǎng)異常的現(xiàn)象：授粉4 d 時(shí)，發(fā)現(xiàn)花柱道細(xì)胞和間隙間堆積了大量胼胝質(zhì)(圖1K和L），阻礙了花粉管生長(zhǎng)，這一現(xiàn)象也在4、8 d 時(shí)出現(xiàn)；2 d 時(shí)，花粉管應(yīng)匯聚成束進(jìn)入花柱，但有些花粉管在柱頭表面生長(zhǎng)雜亂無章(圖1M）。在8 d 時(shí)發(fā)現(xiàn)，花粉管在柱頭表面萌發(fā)，但因花粉管內(nèi)部堆積胼胝質(zhì)而停止生長(zhǎng)(圖1N）。

2.1.2 紫花含笑×金葉含笑花粉管的生長(zhǎng)情況 如圖2 所示：授粉2 h 時(shí)，花粉未萌發(fā)(圖2A）；4 h 時(shí)，柱頭表面的花粉數(shù)量增多，有極少數(shù)花粉在此時(shí)開始萌發(fā)(圖2B）；6 h 時(shí)，花粉萌發(fā)數(shù)量逐漸增多(圖2C）；在8 h 時(shí)，大量花粉萌發(fā)，花粉管生長(zhǎng)至花粉粒直徑的3 倍以上，此時(shí)花粉管存在匯聚的趨勢(shì)但還沒有開始匯聚(圖2D）；授粉后1 d，花粉管已匯聚成束，生長(zhǎng)至柱頭中部(圖2E）；2 d 時(shí)，花粉管生長(zhǎng)至花柱底部(圖2F）；4 d 時(shí)，花粉管生長(zhǎng)至子房約1/3 處(圖2G）；6 d 時(shí)，花粉管生長(zhǎng)至子房1/2 處(圖2H）；8 d 時(shí)，大多數(shù)花粉管已進(jìn)入胚珠(圖2I）。該組合出現(xiàn)以下受精前障礙：授粉1 d 時(shí)，出現(xiàn)花粉管生長(zhǎng)雜亂且無匯聚現(xiàn)象。有的花粉萌發(fā)后，花粉管朝反方向生長(zhǎng)(圖2J）；8 d 時(shí)，發(fā)現(xiàn)有的花粉粒仍未萌發(fā)、萌發(fā)的花粉管在柱頭表面彼此間交錯(cuò)纏繞生長(zhǎng)，未進(jìn)入柱頭(圖2K）；花粉管在進(jìn)入胚珠后，花粉管彎曲纏繞成團(tuán)，阻礙受精(圖2L）；4 d 時(shí)，花粉管內(nèi)部和先端有胼胝質(zhì)堆積而使花粉管膨大，阻礙其進(jìn)一步生長(zhǎng)(圖2M）。

圖2 紫花含笑×金葉含笑花粉管生長(zhǎng)情況Figure 2 Pollen tube growth of M.crassipes ×M.foveolata

2.1.3 金葉含笑×含笑花粉管的生長(zhǎng)情況 如圖3 所示：授粉2 h 時(shí)，無花粉黏附在柱頭表面(圖3A）；4 h時(shí)，有少量花粉黏附在柱頭表面，并開始萌發(fā)，花粉管長(zhǎng)度為花粉粒直徑的2～3 倍(圖3B）；6 h 時(shí)，萌發(fā)的花粉數(shù)量增加，花粉管生長(zhǎng)至花粉粒直徑的4 倍以上，生長(zhǎng)較快的花粉管已開始匯聚成束(圖3C）；8 h 時(shí)，萌發(fā)的花粉數(shù)量顯著增加，花粉管有明顯匯聚成束的趨勢(shì)(圖3D）；10 h 時(shí)，花粉管匯聚成束(圖3E）；12 h 時(shí)，匯聚成束的花粉管生長(zhǎng)至近柱頭下部(圖3F）；1 d 時(shí)，成束的花粉管生長(zhǎng)至子房上部1/3 處(圖3G）；2 d 時(shí)，成束的花粉管開始彼此分離，生長(zhǎng)較快者已進(jìn)入胚珠(圖3H）；4 d 時(shí)，多數(shù)花粉管已進(jìn)入胚珠(圖3I）；6 d 時(shí)，花粉管逐漸向下生長(zhǎng)，進(jìn)入底部的胚珠(圖3J）。6 d 時(shí)，極個(gè)別的柱頭表面仍存在大量未萌發(fā)的花粉，少數(shù)已萌發(fā)花粉的花粉管內(nèi)存在胼胝質(zhì)堆積(圖3K）。

2.1.4 金葉含笑×紫花含笑花粉管的生長(zhǎng)情況 如圖4 所示：授粉2 h 后，僅有極少花粉黏附在柱頭表面，無花粉萌發(fā)(圖4A）；4 h 時(shí)，黏附的花粉數(shù)量增加，已有少量花粉萌發(fā)，花粉管生長(zhǎng)至花粉粒直徑的2～3 倍，少數(shù)生長(zhǎng)較快的花粉管生長(zhǎng)至花粉粒直徑的4 倍以上(圖4B）；6 h 時(shí)，黏附及萌發(fā)花粉數(shù)量大幅增加，花粉管生長(zhǎng)至花粉粒直徑的4 倍以上(圖4C）；8 h 時(shí)，花粉管有匯聚成束的趨勢(shì)(圖4D）；10 h時(shí)，呈匯聚趨勢(shì)的花粉管數(shù)量顯著增加，匯聚趨勢(shì)更加明顯(圖4E）；12 h 時(shí)，花粉管匯聚成束(圖4F）；1 d 時(shí)，成束的花粉管生長(zhǎng)至子房1/3～1/2 處且花粉管開始彼此分離(圖4G）；2 d 時(shí)，花粉管繼續(xù)向下延伸(圖4H）；4 d 時(shí)，多數(shù)花粉管已進(jìn)入胚珠(圖4I）。

圖4 金葉含笑×紫花含笑花粉管生長(zhǎng)情況Figure 4 Pollen tube growth of M.foveolata×M.crassipes

2.2 雜交結(jié)實(shí)情況

如表1 和圖5 所示：金葉含笑與含笑正反交的坐果率均較高，分別為75.0%和78.8%。金葉含笑與紫花含笑正反交坐果率相差極大，正交的坐果率很高，達(dá)80.0%，而反交則極低，只有6.7%。金葉含笑×紫花含笑與金葉含笑×含笑的果實(shí)在坐果率、蓇葖膨大率與種子數(shù)上無顯著差異，金葉含笑×含笑的種子較金葉含笑×紫花含笑略大而飽滿。含笑×金葉含笑的坐果率顯著高于紫花含笑×金葉含笑，蓇葖膨大率與種子數(shù)同樣高于紫花含笑×金葉含笑。

表1 金葉含笑在不同雜交組合中的結(jié)實(shí)情況Table 1 Fruit and seed setting status of M.foveolata in different cross combinations

圖5 金葉含笑各雜交組合的結(jié)實(shí)情況Figure 5 Fruit setting of M.foveolata in different cross combinations

2.3 種子萌發(fā)率

于2021 年和2022 年9—12 月采集各雜交組合的種子。含笑×金葉含笑與紫花含笑×金葉含笑的種子經(jīng)低溫沙藏處理后于翌年1 月播種，種子在3 月初至4 月初開始陸續(xù)萌發(fā)。金葉含笑×含笑與金葉含笑×紫花含笑的種子屬于薄皮種子，很容易因失水、氧化而失去活性，因此采用即采即播的方式，種子在翌年2 月中旬陸續(xù)萌發(fā)。由表1 所示：各雜交組合的種子出苗情況良好，萌發(fā)率較高，均在75.0%以上，其中最高的為紫花含笑×金葉含笑雜交組合的種子，萌發(fā)率高達(dá)92.9%。

3 討論

雜交障礙分為受精前障礙與受精后障礙。受精前障礙主要表現(xiàn)為：花粉在柱頭上不能萌發(fā)；即使花粉在柱頭表面萌發(fā)，但花粉管不能伸入柱頭；花粉管可以穿過柱頭在花柱中生長(zhǎng)但生長(zhǎng)受阻，不能進(jìn)入子房到達(dá)胚囊；花粉管雖能達(dá)到胚囊，但不能完成雙受精[6]。受精后障礙主要表現(xiàn)為受精后的合子不分裂或原胚發(fā)育異?；蛟缙诎l(fā)育停止；胚乳發(fā)育異?；蚺呷榕c胚發(fā)育不協(xié)調(diào)，最終導(dǎo)致胚體發(fā)育異常而降解；可獲得種子但種子不能發(fā)芽或發(fā)芽后成株前夭亡或不能正常開花和結(jié)果[7]。

本研究中含笑×金葉含笑雜交的坐果率較高，達(dá)78.8%。平均每個(gè)果序上有49.4%的蓇葖膨大，當(dāng)果序上有極少數(shù)蓇葖膨大時(shí)依然可以實(shí)現(xiàn)坐果。然而結(jié)籽率卻較低，僅為27.3%，平均單個(gè)蓇葖內(nèi)含種子數(shù)為1.1 個(gè)，含笑的每心皮內(nèi)含2 枚胚珠，有近一半的胚珠沒有成功受精或受精后胚發(fā)育異常。綜合分析，在熒光顯微觀察中發(fā)現(xiàn)的花柱道細(xì)胞和間隙間堆積了大量胼胝質(zhì)，阻礙了花粉管的生長(zhǎng)；花粉管在柱頭表面雜亂生長(zhǎng)，導(dǎo)致花粉管無法匯聚成束進(jìn)入花柱道，最終停止生長(zhǎng)；花粉管內(nèi)部和先端有胼胝質(zhì)堆積，形成胼胝質(zhì)塞，使花粉管生長(zhǎng)受阻等障礙與結(jié)實(shí)情況，認(rèn)為上述雜交障礙并不影響坐果，而是影響結(jié)籽。王亞玲[8]發(fā)現(xiàn)花粉管兩型性在木蘭科植物中廣泛存在，絕大多數(shù)花粉是短花粉管型，極少數(shù)是長(zhǎng)花粉管型，而只有長(zhǎng)花粉管能完成受精。香港木蘭M.championii的花粉大量萌發(fā)，在花柱道匯聚成束后，隨著花粉管生長(zhǎng)，越靠近胚珠的花粉管neng 數(shù)量越少，僅有少數(shù)花粉管能到達(dá)胚珠。這種現(xiàn)象與本研究中含笑和紫花含笑的胚珠附近未見明顯的花粉管分離現(xiàn)象相似。因此推測(cè)：可能是由于花粉的生理特性加上胼胝質(zhì)阻礙花粉管進(jìn)入胚珠完成受精，進(jìn)而影響結(jié)籽率。也有研究發(fā)現(xiàn)木蘭科植物存在大孢子發(fā)生和雌配子體發(fā)育異常的現(xiàn)象[9-11]，這會(huì)對(duì)木蘭科植物結(jié)實(shí)產(chǎn)生影響。

金葉含笑×紫花含笑坐果率與結(jié)籽率顯著高于紫花含笑×金葉含笑，可見金葉含笑作母本時(shí)表現(xiàn)親和，而作父本時(shí)親和性較差。目前已有許多學(xué)者發(fā)現(xiàn)雜交親和性具有單向性[12-14]。在王亞玲[8]研究中，紫花含笑×金葉含笑的坐果率為0，判定紫花含笑和金葉含笑雜交不親和。本研究證實(shí)該雜交組合坐果率雖然很低，但仍可以結(jié)實(shí)。產(chǎn)生差異的原因可能是由于王亞玲僅對(duì)7 朵花進(jìn)行雜交試驗(yàn)，樣本量過少。雖然在紫花含笑×金葉含笑中出現(xiàn)花粉在柱頭表面未萌發(fā)，花粉管在柱頭表面盤旋生長(zhǎng)，未進(jìn)入柱頭，花粉管內(nèi)部、先端堆積胼胝質(zhì)而變得膨大，生長(zhǎng)受阻，花粉管在胚珠內(nèi)彎曲纏繞成團(tuán)，阻礙受精等不親和現(xiàn)象，但經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)金葉含笑的花粉管已到達(dá)紫花含笑胚珠部位。楊占輝等[15]在鳶尾Irisspp.雜交試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)鳶尾花粉在柱頭表面纏繞扭曲，但對(duì)花粉管伸長(zhǎng)影響不大，最終都可見花粉管進(jìn)入胚珠。何興波等[16]發(fā)現(xiàn)‘風(fēng)味玫瑰’Prunusdomestica×P.armeniaca‘Fengweimeigui’自交的花粉管在胚珠附近時(shí)，花粉管先端出現(xiàn)團(tuán)狀胼胝質(zhì)，阻礙花粉管進(jìn)入胚珠。張賽陽等[17]發(fā)現(xiàn)雜交石竹Dianthus hybridus的花粉管即使可以從珠孔進(jìn)入胚囊，但在珠孔附近卷曲盤繞生長(zhǎng)，并堆積胼胝質(zhì)，阻礙雙受精。在紫花含笑×金葉含笑雜交1 個(gè)月后，紫花含笑的雌蕊群上僅有極少數(shù)雌蕊膨大，但未落果。在2 個(gè)月時(shí)大多數(shù)雌蕊的顏色由綠色轉(zhuǎn)為黃色，隨后脫落。當(dāng)下層雌蕊脫落時(shí)會(huì)連帶上層膨大的雌蕊一起脫落，果實(shí)脫落率高達(dá)93.34%。王亞玲[8]發(fā)現(xiàn)沒有完成雙受精的香港木蘭雌蕊會(huì)在授粉后10 d 左右開始凋落。也有學(xué)者認(rèn)為：在授粉后子房生長(zhǎng)停滯并大量落果，是胚胎發(fā)育不良引起的[18-19]。吳美嬌等[20]發(fā)現(xiàn)百合Liliumspp.花粉管在受精前無明顯障礙，但在受精和胚胎發(fā)育過程中出現(xiàn)不同程度的胚敗育現(xiàn)象。綜合分析，推測(cè)紫花含笑×金葉含笑雜交不親和主要是由受精后障礙引起的，因此，需要對(duì)受精情況和胚胎發(fā)育進(jìn)一步研究。

在金葉含笑×含笑與金葉含笑×紫花含笑中均存在形態(tài)異常的種子，大多數(shù)為空癟的種子。在2 個(gè)組合中形態(tài)異常種子占比分別為9.6%和16.1%，而反交則均為飽滿的種子，王亞玲[8]發(fā)現(xiàn)：在香港木蘭授粉后部分合子出現(xiàn)敗育，如果胚乳核繼續(xù)發(fā)育，最后可以形成無胚種子。同時(shí)也存在受精胚乳核敗育，胚乳沒有形成營養(yǎng)豐富的胚乳核細(xì)胞，而是形成海綿狀物質(zhì)。目前已有許多方法用于克服受精前障礙，如蒙導(dǎo)法、重復(fù)授粉法等。賀丹等[21]研究發(fā)現(xiàn)：延遲授粉法可以減緩甚至克服母本柱頭或花柱對(duì)異源花粉萌發(fā)及花粉管生長(zhǎng)的抑制，克服受精前障礙，提高育種效率。對(duì)于雜交胚早期敗育可采用胚搶救的方法[22-23]。因此，在今后研究中可對(duì)紫花含笑×金葉含笑的雜交胚采取胚搶救的方法克服不親和障礙。

4 結(jié)論

金葉含笑與含笑正反交均親和，金葉含笑花粉管與含笑花柱道內(nèi)的胼胝質(zhì)堆積，但不影響坐果率，只對(duì)結(jié)籽率有一定影響。金葉含笑與紫花含笑表現(xiàn)為單向雜交親和，金葉含笑×紫花含笑親和性較強(qiáng)，紫花含笑×金葉含笑親和性較差是由受精后障礙所引起的。