唐林峰，聊曉玉，常昊，趙夢(mèng)蝶，王丹丹，劉竹青，韓嵐*（.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，現(xiàn)代中藥安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 23002；2.安徽省中藥復(fù)方重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 23002）

原發(fā)性痛經(jīng)（primary dysmenorrhea，PD）是指患者在月經(jīng)期間出現(xiàn)下腹部劇烈疼痛，伴有出汗、頭痛、惡心等癥狀，無(wú)器質(zhì)性病變，無(wú)其他婦科疾病發(fā)生，嚴(yán)重者發(fā)生休克、昏厥，嚴(yán)重影響患者的生活、工作和學(xué)習(xí)質(zhì)量[1]。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果表明，原發(fā)性痛經(jīng)具有覆蓋面廣、發(fā)病率高等特點(diǎn)[2-7]。因此，針對(duì)性治療PD已成為臨床研究熱點(diǎn)之一。PD的發(fā)病機(jī)制與下丘腦-垂體-卵巢軸（hypothalamic-pituitary-ovarian axis，HPOA）的功能紊亂密切相關(guān)[8]。PD發(fā)生時(shí)可促進(jìn)下丘腦分泌促性腺激素釋放激素（gonadotropin-releasing hormone，GnRH）[9]，GnRH與促性腺激素釋放激素受體（gonadotropin-releasing hormone-report，GnRH-R）結(jié)合后，刺激垂體黃體生成素（luteinizing hormone，LH）和促卵泡素（follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）大量分泌，從而促進(jìn)雌二醇（estradiol，E2）產(chǎn)生[10]，抑制孕酮（progesterone，P）分泌，導(dǎo)致細(xì)胞膜磷脂中花生四烯酸的大量釋放，引發(fā)子宮內(nèi)前列腺素（prostaglandins，PG）等一系列致痛物質(zhì)的產(chǎn)生[11-13]。

另一方面，PD引起的E2和P的分泌紊亂，可導(dǎo)致下丘腦GnRH脈沖分泌過(guò)多，形成惡性循環(huán)。β-內(nèi)啡肽（β-endorphin，β-EP）可參與下丘腦-垂體功能調(diào)控，當(dāng)β-EP水平降低時(shí)可誘發(fā)子宮收縮，引起痛經(jīng)癥狀[14]。已有大量研究表明，藥物可通過(guò)改善HPOA功能恢復(fù)起到治療PD的作用[15-16]。

《素問(wèn)·舉痛論》曾記載“不通則痛”為PD的主要病機(jī)，“瘀血”為其主要病理改變，以“通”瘀血為主要治法，故活血化瘀為PD的重要治則[17]。桃紅四物湯（Taohong Siwu decoction，THSWD）是出自《醫(yī)宗金鑒》里的一味經(jīng)典祛瘀生新方劑，全方由經(jīng)典四物湯（熟地黃、川芎、當(dāng)歸、白芍）配伍紅花、桃仁共奏養(yǎng)血補(bǔ)血、活血化瘀之功效[18]，是治療婦科瘀血癥的常用方劑。在臨床實(shí)踐中，桃紅四物湯對(duì)痛經(jīng)有較好的治療效果，其中桃紅四物湯的總有效率為91.05%，在治療痛經(jīng)方面有較高的應(yīng)用率，且無(wú)明顯不良反應(yīng)[19-21]。課題組前期研究表明，桃紅四物湯對(duì)產(chǎn)后血瘀大鼠有明顯的治療作用，能明顯減輕子宮的炎癥反應(yīng)，抑制全血黏度和血漿黏度[22]，抑制血清溶血磷脂酸的含量[23]，并通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號(hào)通路促進(jìn)一氧化氮（NO）和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的產(chǎn)生，起到“祛瘀生新”的作用，促進(jìn)子宮修復(fù)[24-25]。與痛經(jīng)相關(guān)的研究中發(fā)現(xiàn)桃紅四物湯有明顯的鎮(zhèn)痛作用，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)性激素水平有關(guān)[26]；同時(shí)，桃紅四物湯通過(guò)調(diào)節(jié)血瘀綜合征大鼠的雌激素及其受體水平來(lái)調(diào)節(jié)花生四烯酸的代謝[27-28]。與傳統(tǒng)煎藥相比，顆粒劑具有攜帶方便、便于保存和運(yùn)輸?shù)膬?yōu)點(diǎn)。課題組前期對(duì)桃紅四物顆粒劑制備工藝進(jìn)行了探索和優(yōu)化[29-30]，在增加桃紅四物顆粒的穩(wěn)定性基礎(chǔ)上，更加便于其臨床應(yīng)用。但桃紅四物顆粒能否通過(guò)調(diào)控PD模型大鼠HPOA功能起到緩解痛經(jīng)的治療作用是值得深究的。本文通過(guò)建立PD模型大鼠，探討了桃紅四物顆粒對(duì)PD模型大鼠HPOA功能的影響，為其新藥研發(fā)和現(xiàn)代臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料

1.1 動(dòng)物

健康的雌性Sprague-Dawley大鼠，體重200～240 g [安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，倫理委員會(huì)批準(zhǔn)文件號(hào)為No.AHUCM-2017001]。所有的大鼠都被安置在聚丙烯籠子里[溫度（25±5）℃，相對(duì)濕度50%～60%]，允許自由獲取食物和水。

1.2 試藥

采用課題組前期優(yōu)化后的制備工藝制備桃紅四物顆粒劑[30]，并交由合肥華方醫(yī)藥公司進(jìn)行批量生產(chǎn)（批號(hào)：190805）。戊酸雌二醇片（拜耳醫(yī)藥保健有限公司，批號(hào)：J20171038）；婦科千金片（株洲千金藥業(yè)有限公司，批號(hào)：Z43020027）；催產(chǎn)素注射液（上海和豐藥業(yè)，批號(hào)：J20171038）；蘇木精、伊紅（珠海貝索生物技術(shù)有限公司）；FSH、LH、E2、P、β-EP ELISA試劑盒（武漢基因美技術(shù)有限公司）；β-actin抗體（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：19C10509）；雌激素受體（estrogen receptor，ER）抗體（批號(hào)：0E00185623）、孕激素受體（progestogen receptor，PR）抗體（批號(hào)：AI12197160）；縮宮素受體（oxytocin receptor，OTR）抗體（批號(hào)：AI08281924）、GnRHR抗體（批號(hào)：AF08042244）（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；GnRH抗體（Santa Cruz，批號(hào)：K2403）。Novostart SYBR qPCR SuperMix Plus（北京安諾論生物科技有限公司，批號(hào)：0516511）；PrimeScript抗體RT試劑盒與gDNAEraser（日本TaKaRa公司，批號(hào)：AJ51485A）。

1.3 儀器

EPS300型電泳儀、VE-186型轉(zhuǎn)膜儀、PIKOREAL96型熒光定量PCR儀（上海天能科技有限公司）；JS-1070P型自動(dòng)曝光儀（上海培清科技有限公司）；GT9612型基因擴(kuò)增儀（杭州百恒科技有限公司）；AF-10型自動(dòng)制冰機(jī)（美國(guó)Scottsmann公司）；HistoCore Arcadia型自動(dòng)包埋機(jī)、CM1860型病理切片機(jī)（德國(guó)Leica公司）；CX43型顯微鏡（深圳OLYMPUS公司）；Bioprep-24型生物樣品勻漿器（杭州澳盛儀器有限公司）；Multiskan Spectrum型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Fisher公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 大鼠PD模型的建立[31]

通過(guò)陰道涂片法選擇成熟雌性SD大鼠。除空白對(duì)照組外，連續(xù)灌胃戊酸雌二醇片10 d，1次·d-1（第1日與第10日給藥0.2 mg，第2～9日給藥0.1 mg），末次給藥1 h后，除對(duì)照組大鼠外均腹腔注射催產(chǎn)素（2 U/只），觀察各組大鼠在20 min內(nèi)的扭體反應(yīng)，記錄大鼠首次發(fā)生扭體反應(yīng)的潛伏期與扭體次數(shù)，并計(jì)算扭體次數(shù)抑制率，扭體次數(shù)抑制率（%）＝（模型組扭體次數(shù)-給藥組扭體次數(shù)）/模型組扭體次數(shù)×100%。其中發(fā)生扭體反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)為：腹部?jī)?nèi)凹，后肢與軀干伸展，臀部抬高，并伴有一側(cè)肢體內(nèi)旋。

2.2 分組與給藥

將大鼠隨機(jī)分為正常組（Normal），模型組（Model），桃紅四物顆粒高、中、低劑量組（18、9、4.5 g·kg-1），陽(yáng)性藥組[婦科千金片（FKQJ，0.08 g·kg-1）][32]，每組10只。從造模的第5日起，按照10 mL·kg-1的體積灌胃給藥，1次·d-1。正常組與模型組大鼠灌胃等量生理鹽水。

2.3 樣品采集

麻醉后迅速采集腹主動(dòng)脈血液，放置20 min，以3000 r·min-1離心15 min，然后保留上清液置于-80℃保存。在冰浴環(huán)境下迅速分離大鼠子宮、下丘腦和卵巢組織，在-80℃冰箱中保存。同時(shí)將部分新鮮子宮組織保存在4%多聚甲醛溶液中，用于制作病理切片。

2.4 大鼠血清FSH、LH、E2、P和β-EP含量檢測(cè)

按照“2.3”項(xiàng)下血清樣本處理步驟，使用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)大鼠血清中FSH、LH、E2、P和β-EP的含量，操作步驟參考說(shuō)明書(shū)。

2.5 Western blot法檢測(cè)子宮中ER、PR、OTR及下丘腦與卵巢中GnRH、GnRHR蛋白表達(dá)水平

精密稱(chēng)取子宮、下丘腦和卵巢組織各80 mg，加入720 mL預(yù)冷的RIPA裂解液和PMSF混合物（RIPA∶PMSF＝100∶1）。冰上裂解30 min后，低溫離心（12 000 r·min-1，4℃）15 min，取20 mL上清液，使用BCA法測(cè)定蛋白濃度；剩余上清液加入5×上樣緩沖液中，100℃煮沸10 min。樣品變性后，使用不同濃度的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離等量的蛋白緩沖液，隨后在低溫下將蛋白轉(zhuǎn)移到0.22 mm的NC膜上。用5%脫脂奶粉在室溫下封閉2 h后，將膜與抗ER（1∶1000）、PR（1∶1000）、OTR（1∶1000）、GnRH（1∶2000）、GnRH-R（1∶1000）抗體在4℃下孵育過(guò)夜。將NC膜與HRP標(biāo)記的山羊抗兔（1∶10 000）與山羊抗鼠（1∶10 000）抗體在室溫下孵育2 h，TBST清洗結(jié)束后，使用超敏化學(xué)發(fā)光試劑顯色，并使用Image J軟件進(jìn)行半定量分析。

2.6 免疫組化法檢測(cè)子宮中ER、PR、OTR蛋白表達(dá)水平

采用石蠟包埋法制備子宮組織的病理切片。切片經(jīng)程序脫水后加入0.1% Triton X-100進(jìn)行破膜處理，滴加適量?jī)?nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷劑室溫孵育10 min，隨即加入山羊血清室溫封閉15 min，滴加抗ER（1∶200）、PR（1∶200）、OTR（1∶200）抗體濕盒4℃過(guò)夜。經(jīng)PBS清洗后加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG，37℃孵育10 min后，用PBS液清洗，加入DAB顯色劑，在顯微鏡下觀察，終止顯色后用蒸餾水沖洗。隨后采用蘇木精染色1 min，清洗；1%鹽酸酒精分化數(shù)秒，清洗；碳酸鋰藍(lán)1 min，清洗。最終脫水至透明，封片處理。使用CX43顯微鏡采集照片，并使用Image J軟件進(jìn)行分析。

2.7 熒光定量PCR檢測(cè)下丘腦與卵巢中GnRH、GnRH-R mRNA表達(dá)水平

準(zhǔn)確稱(chēng)取下丘腦和卵巢組織各80 mg，分別加入1 mL Trizol進(jìn)行裂解勻漿處理。低溫離心（12 000 r·min-1，4℃）10 min后，取上清液與0.2 mL氯仿混勻，冰上放置5 min。再次低溫離心（12 000 r·min-1，4℃）10 min取上清液，加入相同體積的異丙醇，混合均勻，冰上孵育30 min。低溫離心（12 000 r·min-1，4℃）15 min后，留取沉淀加入75%乙醇離心（12 000 r·min-1，4℃）5 min。冰上干燥RNA沉淀，加入50 μL DEPC水促溶，同時(shí)使用 Nanodrop2000 測(cè)定RNA濃度與純度（A260nm/A280nm＝1.8～2.0）。參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄 cDNA 合成與熒光定量 PCR 反應(yīng)。其中引物序列信息詳見(jiàn)表1。

表1 引物序列信息Tab 1 Primer sequence information

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法和處理

采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，連續(xù)變量用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)描述。兩組數(shù)據(jù)的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組平均值的比較采用單因素方差分析（P＜0.05）。

3 結(jié)果

3.1 對(duì)PD模型大鼠扭體反應(yīng)的影響

子宮強(qiáng)烈收縮引發(fā)的扭體反應(yīng)是評(píng)判PD模型大鼠造模成功的經(jīng)典指標(biāo)[31]。如圖1所示，與正常組相比，模型組大鼠扭體次數(shù)明顯增加，扭體潛伏時(shí)間也明顯縮短，提示造模成功。與模型組相比，桃紅四物顆粒各劑量組可明顯降低扭體次數(shù)，提高扭體次數(shù)抑制率，同時(shí)延長(zhǎng)扭體潛伏時(shí)間。陽(yáng)性藥組同樣可顯著改善PD模型大鼠扭體反應(yīng)。這提示桃紅四物顆粒對(duì)PD模型大鼠具有良好的鎮(zhèn)痛作用，且具備一定的劑量依賴(lài)性。

圖1 桃紅四物顆粒對(duì)PD模型大鼠扭體反應(yīng)的影響（n＝6）Fig 1 Effect of Taohong Siwu granules on the torsional responses in PD model rats（n＝6）

3.2 對(duì)PD模型大鼠血清中FSH、LH、E2、P和β-EP含量的影響

如圖2所示，與正常組相比，模型組血清中的FSH、LH與E2含量增加，相反，P和β-EP的含量則下調(diào)。與模型組相比，桃紅四物顆粒高、中劑量組及陽(yáng)性藥組均可顯著降低痛經(jīng)大鼠血清中FSH、LH、E2水平，同時(shí)提高P及β-EP的表達(dá)水平。

圖2 大鼠血清中FSH（A）、LH（B）、E2（C）、P（D）及β-EP（E）的含量（n＝6）Fig 2 Serum levels of FSH（A），LH（B），E2（C），P（D），and β-EP（E）in the rats（n＝6）

3.3 對(duì)PD模型大鼠ER、PR、OTR、GnRH、GnRH-R蛋白表達(dá)量的影響

PR、OTR、ER分別能夠識(shí)別和結(jié)合孕激素、縮宮素、雌激素及其類(lèi)似物，從而發(fā)揮相應(yīng)的生理效應(yīng)。同時(shí)，激素水平的高低可直接或間接的調(diào)控激素受體水平[33]。為進(jìn)一步闡釋上述性激素與激素受體之間關(guān)系，我們檢測(cè)了子宮組織中PR、OTR、ER蛋白表達(dá)水平。如圖3所示，與正常組相比，模型組PR表達(dá)量下降，OTR和ER蛋白的表達(dá)量增加。與模型組相比，桃紅四物顆粒高劑量組與陽(yáng)性藥組可有效提高PR表達(dá)量，同時(shí)降低痛經(jīng)大鼠子宮組織中OTR和ER蛋白的表達(dá)。

圖3 子宮中PR（A）、OTR（B）及ER（C）蛋白的表達(dá)（n＝3）Fig 3 Expression of PR（A），OTR（B），and ER（C）proteins in the uterus（n＝3）

作為HPOA軸的上游，在PD模型中下丘腦與卵巢中的GnRH 2與GnRH-R結(jié)合，可進(jìn)一步促進(jìn)上述性腺激素的釋放[34]。如圖4所示，與正常組相比，模型組下丘腦和卵巢中GnRH 2及其受體GnRH-R的蛋白表達(dá)顯著增加。與模型組相比，桃紅四物顆粒高劑量組可有效降低痛經(jīng)大鼠下丘腦和卵巢中GnRH和GnRH-R的蛋白表達(dá)。桃紅四物顆粒高劑量組的效果與陽(yáng)性對(duì)照藥物的效果相似。

圖4 下丘腦（A、B）與卵巢（C、D）中GnRH 2、GnRH-R蛋白的表達(dá)（n＝3）Fig 4 Expression of GnRH 2 and GnRHR proteins in the hypothalamus（A and B）and ovary（C and D）（n＝3）

3.4 免疫組化結(jié)果

為進(jìn)一步觀察子宮組織中ER、OTR、PR蛋白表達(dá)水平，本研究采用免疫組化評(píng)價(jià)上述指標(biāo)。如圖5與6所示，與正常組相比，模型組子宮組織中ER和OTR的陽(yáng)性信號(hào)表達(dá)增加（P＜0.01，P＜0.05），PR表達(dá)下降（P＜0.01）。與模型組相比，桃紅四物顆粒高劑量組對(duì)痛經(jīng)大鼠子宮組織中ER和OTR的陽(yáng)性信號(hào)表達(dá)有顯著抑制作用（P＜0.05），可顯著升高PR表達(dá)（P＜0.05），且高劑量組桃紅四物顆粒的效果與陽(yáng)性對(duì)照組相似。

圖5 免疫組化法測(cè)定各組子宮組織中ER、OTR及PR蛋白的表達(dá)（×400）Fig 5 Expression of ER，OTR，and PR proteins in the uterine tissues of each group by immunohistochemistry（×400）

圖6 各組大鼠子宮組織中ER、OTR及PR的表達(dá)（n＝3）Fig 6 Expression of ER，OTR，and PR in the uterine tissue of rats in each group（n＝3）

3.5 對(duì)PD模型大鼠下丘腦和卵巢中GnRH、GnRH-R mRNA的影響

下丘腦與卵巢中GnRH與GnRH-R含量檢測(cè)常用GnRHmRNA與GnRH-RmRNA表達(dá)水平來(lái)表示。與正常組相比，模型組下丘腦（見(jiàn)圖7A、7B）和卵巢（見(jiàn)圖7C、7D）中GnRH及其受體GnRH-R的mRNA表達(dá)增加（P＜0.01），與模型組相比，桃紅四物顆粒各劑量組及陽(yáng)性藥組均可顯著降低痛經(jīng)大鼠GnRH和GnRH-R的mRNA表達(dá)。

圖7 下丘腦（A與B）和卵巢組織（C與D）中GnRH、GnRH-R mRNA的表達(dá)（n＝6）Fig 7 Expression of GnRH，GnRH-R mRNA in hypothalamus（A and B）and ovarian tissue（C and D）（n＝6）

4 討論

PD是臨床常見(jiàn)婦科疾病，研究表明其發(fā)病機(jī)制與HPOA功能紊亂密切相關(guān)[8]。下丘腦、垂體、卵巢及其分泌的激素之間的相互作用構(gòu)成了HPOA系統(tǒng)，共同調(diào)節(jié)著身體的生理和病理狀態(tài)[35-37]。下丘腦的神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞分泌GnRH，通過(guò)血液脈沖，輸送到腺體，與GnRH-R結(jié)合，從而刺激垂體分泌FSH和LH，最后靶向卵巢，刺激卵巢分泌P和E2。同時(shí)，P和E2的分泌可以反饋調(diào)節(jié)下丘腦和垂體，實(shí)現(xiàn)整個(gè)系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)平衡，共同調(diào)節(jié)女性身體的健康，形成一個(gè)封閉的循環(huán)[38]。PD發(fā)生時(shí)，HPOA系統(tǒng)功能紊亂，誘發(fā)卵巢中的E2和P分泌紊亂，花生四烯酸經(jīng)環(huán)氧化酶分解，于子宮處釋放大量前列腺素等致痛物質(zhì)，而引起痛經(jīng)癥狀[39]。

本課題組前期研究表明，桃紅四物湯具有良好的治療痛經(jīng)的效果，作用機(jī)制可能與調(diào)控HPOA性腺激素水平有關(guān)。本研究結(jié)果表明，桃紅四物顆?？捎行Ц纳芇D模型大鼠扭體反應(yīng)，有良好鎮(zhèn)痛作用，其鎮(zhèn)痛作用效果可能與降低下丘腦和卵巢GnRH、GnRH-R 蛋白和基因表達(dá)，抑制垂體與卵巢FSH、LH、E2的釋放，升高P、β-EP 含量有關(guān)。其中，E2含量的降低與P含量的增加可以有效緩解子宮痙攣和血管收縮，起到鎮(zhèn)痛效果[40-42]。此外，β-EP可以抑制GnRH脈沖發(fā)生器和LH的釋放[43-45]。因此，下丘腦和卵巢中GnRH和GnRH-R的蛋白和基因表達(dá)的下降，可能與桃紅四物顆粒增加β-EP的分泌有關(guān)。子宮內(nèi)膜中含有豐富的ER、PR、OTR，其含量變化與PG的合成釋放密切相關(guān)，其中ER與OTR含量變化與PG合成釋放成正相關(guān)[33]，而PR含量變化與PG合成釋放成負(fù)相關(guān)[46]。桃紅四物顆?？娠@著降低子宮組織 ER、OTR的蛋白表達(dá)量，升高 PR 蛋白表達(dá)量，可能抑制子宮內(nèi)前列腺素的合成與釋放降低，發(fā)揮緩解PD模型大鼠痛經(jīng)作用。

綜上所述，桃紅四物顆粒對(duì)PD模型大鼠有良好的治療作用，其作用機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)控HPOA系統(tǒng)的激素釋放，間接影響性腺受體的產(chǎn)生，從而緩解痛經(jīng)的癥狀，這為桃紅四物顆粒進(jìn)入治療痛經(jīng)的市場(chǎng)導(dǎo)向奠定了部分實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。然而PD的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，仍需進(jìn)一步深入研究。