范 楷，蔡亞玲，胡 政，劉 星，張志岐，聶冬霞，韓 錚

上海市農業(yè)科學院農產品質量標準與檢測技術研究所，上海 201403

稻曲病是由稻綠核菌（Ustilaginoidea virens(Cke.) Takahashi）侵染水稻穗部引起的一種世界性真菌病害[1]。近年來，隨著水稻品種的更替、施肥水平的提高以及氣候的變化，稻曲病日趨嚴重，已成為我國水稻生產過程中的主要病害[2]。稻曲病不僅會引起水稻減產，品質降低，更嚴重的是，其病原菌產生的有毒次級代謝產物——稻曲菌素可以在稻米中聚集，進而通過食物鏈威脅人畜健康。

稻曲菌素屬于環(huán)肽類真菌毒素，具有很強的細胞毒性，能夠干擾真核生物微管蛋白的組裝與細胞骨架形成，抑制細胞有絲分裂，引發(fā)動物器官病變、生長異常、代謝紊亂甚至死亡[3-4]。目前，已發(fā)現(xiàn)的稻曲菌素共有6 種（稻曲菌素A、B、C、D、F 和G）。其中稻曲菌素A 和B 最為常見，占稻曲菌素總含量的90%左右[5]，毒性也最大[6-8]；稻曲菌素G 是近年來新分離得到的一種稻曲菌素，被證實具有和稻曲菌素A 類似的細胞毒性[9]。因此，對稻米中的稻曲菌素進行監(jiān)測對于保障食品安全和大眾健康具有十分重要的意義。

目前，稻米中稻曲菌素的分析方法可分為免疫法和色譜法兩類。免疫方法中，酶聯(lián)免疫吸附測定法和側流免疫測定法等，往往只適用于一種或兩種稻曲菌素的定性或定量分析，且結果可能存在假陽性，不能滿足實際檢測、監(jiān)管的需要[10-12]。相比較而言，色譜法具有更高的靈敏度和更好的選擇性，被廣泛應用于農產品的各類真菌毒素的篩查中[13-14]。在稻曲菌素方面，雖然也有液相色譜和液相串聯(lián)質譜等分析方法的報道[15-17]，但這些方法主要聚焦于稻曲菌素A 和B 的測定，未見稻曲菌素G 的精準檢測技術，很少應用于稻米的大樣本篩查，不能全面反映我國稻米中稻曲菌素的實際污染情況。

本研究基于固相萃取凈化方法，建立了大米中稻曲菌素A，B 和G 的超高效液相色譜-串聯(lián)質譜（Ultra -performance liquid chromatography -tandem masss pectrometry，UPLC-MS/MS）檢測方法，并運用此方法對我國部分水稻產區(qū)（安徽、廣東、黑龍江、湖北、湖南、江蘇、江西、上海、四川和浙江）2021 年產大米中稻曲菌素的污染狀況進行測定和分析，為稻曲菌素的風險評估、安全預警及監(jiān)管防控提供基礎數(shù)據(jù)，為保障食品安全和大眾身體健康以及相關標準、政策等的制（修）訂提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器：UPLC XEVO TQ-S 超高效液相色譜-串聯(lián)質譜聯(lián)用儀（美國Waters 公司）；5804R 離心機（德國Eppendorf 公司）；HSC-24B 氮吹儀（上海楚定分析儀器有限公司）；Millipore-Elix-QE-QG 超純水儀（Millipore 公司）；AL104 分析天平（美國梅特勒-托利多儀器有限公司）；SK8210LHC 超聲波清洗機（上海超聲儀器有限公司）；BJ-800A 食品粉碎機（杭州德清拜杰電器有限公司）。

試劑：甲醇、乙腈、甲酸、醋酸銨（色譜純，德國Merck 公司）；HLB 固相萃取柱（200 mg，60 μm；蘇州納譜分析技術有限公司）；稻曲菌素A、B 和G 標準品（純度>90%）由稻曲球中分離制備所得[9,18]。

1.2 試驗材料

2021 年10—11 月在我國部分大米產區(qū)（安徽、廣東、黑龍江、湖北、湖南、江蘇、江西、上海、四川和浙江）采集大米樣品318 份。為保證采集樣品的代表性，分別從每個省（市）選擇3～5 個分采樣點，每個分采樣點所轄水稻種植區(qū)的稻田多點采集成熟稻穗約1 kg，晾干后礱谷機脫殼、精米機加工，所得大米用塑料自封袋裝存、標記后，運輸至上海市農業(yè)科學院農產品質量標準與檢測技術研究所進行分析。實驗室接收后，將大米樣品充分混合、粉碎后過20目篩，按四分法分成4 份，隨機抽取一份制備，其余作為留樣，于-20 ℃保存。

1.3 稻曲菌素的測定

1.3.1 樣品前處理

準確稱取1 g 樣品（準確到0.01 g）于50 mL 離心管中，加入10 mL 水浸泡5 min，渦旋1 min，室溫超聲提取10 min，5 000 r/min 離心5 min。取1 mL上清液，過預先用2 mL 甲醇和2 mL 含0.5%甲酸的5 mmol/L 乙酸銨溶液活化過的HLB 柱，2 mL 含0.5%甲酸的5 mM 乙酸銨溶液淋洗，然后用2 mL 甲醇水（25∶75，V/V）溶液洗脫，收集洗脫液，在45 °C下氮氣吹干。用1 mL 含5%乙腈的5 mmol/L 乙酸銨溶液溶解殘渣，渦旋震蕩30 s，經0.22 μm 濾膜過濾后，借助UPLC-MS/MS 測定。

1.3.2 UPLC-MS/MS 檢測

色譜條件：Waters XBridge BEH C18（100 mm ×3.0 mm，2.5 μm）；流動相：A 相為乙腈溶液，B 相為0.1%甲酸水溶液；梯度洗脫：0～3.75 min，5% A～20%A；3.75～6.5 min，20% A～100% A；6.5～8 min，100%A；8～8.01 min，100% A～5% A；8.01～10 min，5% A；流速為0.4 mL/min；進樣量8 μL；柱溫40 °C。

質譜條件：采用電噴霧電離源（Electron spray ionization，ESI）正離子模式掃描，脫溶劑氣、錐孔氣均為高純氮氣，碰撞氣為高純氬氣，脫溶劑溫度為500 °C，離子源溫度為150 °C，通過多反應監(jiān)測（Multiple reaction monitoring，MRM）模式對目標化合物準確定量。3 種稻曲菌素質譜測定參數(shù)見表1。圖1 是3 種稻曲菌素在標準溶液中的MRM 圖譜。

表1 稻曲菌素A、B 和G 的質譜測定參數(shù)

圖1 標準溶液中3 種稻曲菌素（50 μg/L）的MRM圖譜

1.4 方法學驗證

分別通過考察線性、檢出限（Limit of detection，LOD）和定量限（Limit of quantitation，LOQ）、回收率和精密度來評價所建立的分析方法。分別稱取適量稻曲菌素標準品，用純水配制質量濃度為1 mg/L 的標準工作液。以不含稻曲菌素的大米為空白樣品，通過前處理后得到空白基質溶液，稀釋標準工作液獲得0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20 和50 μg/L 的基質標準溶液，以稻曲菌素溶度為橫坐標、峰面積為縱坐標，建立3 種稻曲菌素的基質匹配標準曲線并用于濃度測定。為評價基質效應，采用基質匹配標準曲線斜率與溶劑標準曲線斜率的比值計算稻曲菌素在大米中的信號增強或抑制程度（Signal suppression/enhancement，SSE）[19]。SSE 值在80%～120%之間表明基質效應影響不大；當其高于120%時，表明基質增強效應；當其低于80%時，表明基質抑制效應。以定性離子通道的3 倍信噪比確定目標毒素的LOD、定量離子通道的10 倍信噪比確定目標毒素的LOQ。采用加標回收試驗法考察回收率。選取空白大米樣品，分別按照添加質量分數(shù)10、20和100 μg/kg 加入適量的稻曲菌素標準工作液，每個濃度選取5 個平行樣。經樣品前處理后，通過UPLC-MS/MS 分析，回收率為測定值和理論值的百分比。日內精密度和日間精密度分別為同1 d 平行測定5 個樣品，以及連續(xù)5 d 測定結果的相對標準偏差（Relative standard deviation，RSD）。

1.5 數(shù)據(jù)處理和分析

采用Excel 和SPSS 22.0 對大米樣品中稻曲菌素的污染水平進行統(tǒng)計分析。計算毒素含量均值和進行統(tǒng)計分析時，僅考慮陽性樣本（稻曲菌素含量高于LOD）。采用卡方檢驗對不同地區(qū)大米中稻曲菌素的檢出率進行比較，采用單因素方差分析對不同地區(qū)大米中稻曲菌素的濃度水平進行比較，采用Spearman 相關對3 種稻曲菌素含量間的相關性進行分析。

2 結果與討論

2.1 稻曲菌素含量測定的方法學驗證

表2 可見，稻曲菌素A 和B 在大米基質中的SSE 分別為47.6%和25.7%，表現(xiàn)出較強的基質效應，僅稻曲菌素G 的基質效應影響不大（85.1%）。因此，為保證稻曲菌素含量測定的準確性，本研究采取基質匹配標準曲線對其進行定量。試驗結果表明，3種稻曲菌素的基質匹配標準曲線在各自濃度范圍內的線性關系良好，決定系數(shù)R2均大于0.990（表2）。稻曲菌素A 的LOD 為0.8 μg/kg，LOQ 為2 μg/kg；稻曲菌素B 和G 的LOD 均為0.5 μg/kg，LOQ 均為1 μg/kg。加標回收試驗結果表明，3 種稻曲菌素的平均回收率范圍為83.4%～105.2%，日內精密度范圍為2.1%～8.2%，日間精密度范圍為1.8%～11.3%（表3）。以上數(shù)據(jù)表明，本研究所建立的分析方法靈敏、準確、可靠，可用于大米中3 種稻曲菌素污染水平的精準測定。

表2 大米中3 種稻曲菌素的標準曲線與靈敏度

表3 大米中3 種稻曲菌素的回收率及精密度（n=5）

2.2 大米中稻曲菌素的總體污染水平

采用本文所建立的檢測方法對我國不同地區(qū)大米樣品中的稻曲菌素污染情況進行分析。如表4 所示，318 份大米樣品中共有123 份檢出稻曲菌素，總檢出率為38.68%。其中稻曲菌素A 污染較為嚴重，檢出率為30.19%，平均質量分數(shù)為3.21 μg/kg；其次為稻曲菌素B，檢出率為21.38%，平均質量分數(shù)為1.16 μg/kg；稻曲菌素G 的檢出率為7.86%，平均質量分數(shù)為0.88 μg/kg。

表4 我國部分地區(qū)2021 年大米樣品中3 種稻曲菌素污染狀況

目前，稻米中稻曲菌素A 和B 的污染水平僅有少量報道。2012 年，江蘇省的10 份稻谷樣本中，稻曲菌素A 的檢出率為70%，質量分數(shù)范圍為76～4 036 μg/kg[20]；2016 年，浙江省的10 份大米樣本中，分別有6 份和5 份樣本檢出稻曲菌素A 和B，質量分數(shù)分別為5.5～273.8 μg/kg 和2.7～88.7 μg/kg[17]；2019 年，全國219 份大米樣本中，稻曲菌素A 和B的總檢出率為91.3%，質量分數(shù)范圍為

此外，本研究首次報道了大米中稻曲菌素G 的污染情況。盡管污染水平不高，但稻曲菌素G 的含量與稻曲菌素A（r=0.495，P=0.027）和稻曲菌素B（r=0.479，P=0.038）均表現(xiàn)出顯著相關性。因此，在稻曲菌素的監(jiān)測中，稻曲菌素G 同樣不容忽視。

2.3 不同地區(qū)大米樣品中稻曲菌素污染水平的比較

對不同地區(qū)大米中稻曲菌素的檢出率和濃度水平進行比較分析（表4，圖2）。江西省樣品中，稻曲菌素A 和B 的檢出較高，檢出率分別為44.44%和33.33%，湖南省樣品中，稻曲菌素G 檢出最高，達到17.02%。而江蘇省樣品中，稻曲菌素檢出較低，3 種毒素的檢出率分別為16.67%、11.90%和7.14%。各地區(qū)間大米樣品中，稻曲菌素的檢出率無顯著差異（P>0.05）。污染濃度方面，四川省樣品中，稻曲菌素A 的濃度最高，達到6.04 μg/kg，顯著高于上海市樣品（2.07 μg/kg）（P=0.043），其余各地區(qū)間污染水平無明顯差異（P>0.05）。稻曲菌素B 也是四川省樣品中含量最高的（2.47 μg/kg），顯著高于湖北（0.86 μg/kg）、湖南（1.00 μg/kg）和上海（0.92 μg/kg）等地區(qū)（P<0.05）；不同地區(qū)大米樣品中稻曲菌素G 的污染濃度無明顯差異（P>0.05）。大米中稻曲菌素的污染水平與水稻生長環(huán)境、氣候條件、采樣時間和加工方式等多種因素有關?？紤]到本研究分布到各地區(qū)的樣本量仍然偏少，并不能完全代表各地實際的污染情況，今后需繼續(xù)加強大樣本，大范圍的長期、連續(xù)監(jiān)測，進一步全面了解我國大米樣品中稻曲菌素的污染狀況。

圖2 不同地區(qū)大米樣品中稻曲菌素的污染水平

3 結語

本研究建立了大米中稻曲菌素A、B 和G 的UPLC-MS/MS 檢測方法，調查了我國部分大米產區(qū)（安徽、廣東、黑龍江、湖北、湖南、江蘇、江西、上海、四川和浙江）2021 年產大米中稻曲菌素的污染情況。結果顯示，不同地區(qū)大米樣品普遍受到稻曲菌素的污染，其中稻曲菌素A 檢出較多，但總體的污染程度較輕。在后續(xù)工作中，需繼續(xù)加強對稻曲菌素的日常監(jiān)測，同時開展稻曲菌素的毒理研究、代謝和危害評價等工作，對居民日常暴露稻曲菌素的健康風險作出準確、科學的判斷，為相關政策、限量標準的制（修）訂提供科學依據(jù)，為稻米質量安全保駕護航。