陸韞青,曹程,鄭嘉妮,朱梓強(qiáng),仝佳祥,齊程成,袁磊,郭盛,宿樹(shù)蘭,康宏杰,段金廒,朱悅

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,中藥資源產(chǎn)業(yè)化與方劑創(chuàng)新藥物國(guó)家地方聯(lián)合工程中心,江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過(guò)程協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇省方劑高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京 210023;2.寧夏枸杞創(chuàng)新中心,寧夏 銀川 750002)

視覺(jué)障礙已與腫瘤、心血管疾病共同成為全球嚴(yán)重影響人類(lèi)生存質(zhì)量的疾患。尤其在老齡化日趨加劇的當(dāng)今社會(huì),視網(wǎng)膜疾病中的年齡相關(guān)性黃斑變性(Age-related macular degeneration,AMD)已成為導(dǎo)致全球范圍內(nèi)老年人失明的最主要疾病[1]。流行病學(xué)研究結(jié)果顯示,全球45～85歲人群中AMD患病率約為8.7%[2]。到2040年,受AMD影響的人數(shù)預(yù)計(jì)將增加到2.88億[3-4]。在中國(guó),AMD患者累計(jì)人數(shù)已超4 000萬(wàn),AMD也是導(dǎo)致視覺(jué)障礙的主要原因[5]。AMD已成為當(dāng)今社會(huì)重大公共衛(wèi)生問(wèn)題[2]。

視網(wǎng)膜特定的高氧分壓、高光照暴露、高脂質(zhì)化合物代謝的生理環(huán)境,促進(jìn)了氧自由基的產(chǎn)生,使視網(wǎng)膜特別容易受到氧自由基以及脂類(lèi)衍生物修飾的氧化蛋白的損害[6],導(dǎo)致視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞凋亡與玻璃膜疣形成,一部分患者引發(fā)Bruch膜破裂與脈絡(luò)膜血管新生而導(dǎo)致濕性AMD[7-8]。而另一部分患者出現(xiàn)視網(wǎng)膜地圖樣萎縮,最終形成干性AMD[9]。目前,所有上市的AMD藥物均是針對(duì)濕性AMD,以玻璃體內(nèi)注射抗VEGF藥物作為治療手段[10]。而干性AMD至今尚未有上市的治療藥物,僅推薦服用AREDS2營(yíng)養(yǎng)配方補(bǔ)充劑進(jìn)行預(yù)防[11]。因此,干性AMD迫切需要新的預(yù)防和治療方案。

中醫(yī)眼科中多以“視瞻昏渺”“視直如曲”“暴盲”來(lái)描述AMD導(dǎo)致的視力下降[12]。菊睛丸始載于北宋(1078年)《太平惠民和劑局方·卷之七·治眼目疾》[13],在治療描述其功效為“補(bǔ)不足,強(qiáng)目力”,主治“肝腎不足,眼目昏暗,瞻視不明,茫茫漠漠,常見(jiàn)黑花,多有冷淚”,與AMD尤其是干性AMD視覺(jué)缺失的臨床癥狀高度一致。組方藥材中的枸杞子、菊花與肉蓯蓉為藥食同源藥材,巴戟天也為可用于保健食品的中藥材,因此該方安全性高,具有良好的開(kāi)發(fā)為食品或保健品的應(yīng)用前景。基于AMD為老年期高發(fā)疾病以及氧化應(yīng)激這一核心病理機(jī)制,我們采用小鼠皮下注射D-半乳糖構(gòu)建亞急性衰老動(dòng)物模型[14],評(píng)價(jià)菊睛丸對(duì)衰老模型動(dòng)物視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)影響及其對(duì)視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激與細(xì)胞凋亡的影響,為衰老所致視網(wǎng)膜部損傷的臨床防治與產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供更多的現(xiàn)代科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)ICR小鼠(雄性,8周齡,體質(zhì)量20～22 g),購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司,動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(滬)2017-0005,于南京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)屏障設(shè)施中常規(guī)飼養(yǎng)。普通飼料喂養(yǎng),自由飲食,溫度(23±2)℃,濕度(60±2)%,光照周期12 h。本實(shí)驗(yàn)已獲得南京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn),動(dòng)物倫理號(hào)為202201A028。

1.2 藥材

枸杞子(Lycii Fructus,批號(hào):2109099)采購(gòu)于寧夏明德中藥飲片公司,菊花(Chrysanthemi Flos,批號(hào):17320722)、巴戟天(Morinda officinalis How,批號(hào):245200601)、肉蓯蓉(Cistanches Herba,批號(hào):260200602)均采購(gòu)于蘇州市天靈中藥飲片有限公司,經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)段金廒教授鑒定為正品合格藥材。PreserVision AREDS2(具體成分劑量為維生素C,100 mg·kg-1·d-1;維生素E,80 U·kg-1·d-1;氧化鋅,16 mg·kg-1·d-1;氧化銅,0.4 mg·kg-1·d-1;葉黃素,2 mg·kg-1·d-1;玉米黃質(zhì),0.4 mg·kg-1·d-1)購(gòu)自博士倫(Bausch Lomb)公司。杞菊地黃丸購(gòu)自仲景宛西制藥股份有限公司(批號(hào):200806)。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

包埋劑(4583)購(gòu)自Sakura公司。四氟乙烯(Polyfluoroalkoxy,PFA)(G1101)購(gòu)自武漢塞維爾公司。蘇木精-伊紅(Hematoxylin-eosin staining,HE)染色試劑盒(G1120-10)購(gòu)自北京索萊寶公司。TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(C1086)購(gòu)自南京金益柏生物科技有限公司。4′,6-二脒基-2苯基吲哚(DAPI)(D4080)購(gòu)自Sigma公司。蔗糖(57-50-1)、二甲苯(10023418)、無(wú)水乙醇(100092683)等購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

氧化應(yīng)激標(biāo)志物檢測(cè)相關(guān)試劑:小鼠超氧化物歧化酶(SOD)檢測(cè)試劑盒(A001-3-2)、還原性谷胱甘肽(GSH)檢測(cè)試劑盒(A006-2-1)、丙二醛(MDA)檢測(cè)試劑盒(A003-4-1)均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

組織蛋白提取相關(guān)試劑:RIPA裂解液(P0013B)、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(P0009)購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。蛋白酶抑制劑Cocktail(HY-K0010)購(gòu)自MCE公司。PBS緩沖液(BL601A,BIOSHARP)購(gòu)自北京蘭杰柯科技有限公司。

Western blot相關(guān)試劑:一抗β-actin(66009-1-Ig)、Nrf2(16396-1-AP)、HO-1(10701-1-LG)、Cleaved Caspase-3(19677-1-AP)購(gòu)自武漢三鷹公司,Cleaved Caspase-9(9508S)購(gòu)自CST公司,Bax(sc-7480)、Bcl-2(sc-7382)購(gòu)自圣克魯斯生物技術(shù)有限公司。二抗HRP-Linked Anti-mouse IgG(BA1050)、HRP-Linked Anti-rabbit IgG(BA1054)均購(gòu)自博士德公司。PAGE凝膠快速制備試劑盒(10%,PG112;12.5%,PG113)購(gòu)自上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司。蛋白上樣緩沖液(5×Loading buffer)、甘氨酸、Tris等購(gòu)自北京索萊寶公司。預(yù)染蛋白Marker(180-6003)、ECL發(fā)光液(180-5001)購(gòu)自上海天能生命科學(xué)有限公司。吐溫-20(T8220-500)購(gòu)自南京何苗生物技術(shù)有限公司。未特別說(shuō)明的試劑如氯化鈉等購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器

激光眼科診斷儀(Spectralis OCT,HEIDELBERG公司),多功能酶標(biāo)儀(Enspire,Perkin-Elmer公司),微孔板恒溫振蕩器(ST60-4,Thermo公司),高速冷凍離心機(jī)(Microfuge-22R,BECKMAN公司),熒光倒置顯微鏡(AXIO Vert.A1,Zeiss公司),干式恒溫金屬浴(SBH130D,STUART公司),凝膠電泳成像系統(tǒng)(ChemiDoc XRS+Imaging System,BIO-RAD公司)。

2 方法

2.1 藥物制備

菊睛丸(JJW)提取制備:按枸杞子∶菊花∶巴戟天∶肉蓯蓉(3∶4∶1∶2)比例稱取藥材共53 g,制備水提取物與50%乙醇提取物。水提取物制備按藥材質(zhì)量加入8倍量純水,回流提取2 h,過(guò)濾后加入相同體積純水重復(fù)回流提取2 h后過(guò)濾,合并2次濾液后減壓濃縮。50%乙醇提取物制備按藥材質(zhì)量加入8倍量50%乙醇,回流提取2 h,過(guò)濾后加入相同體積50%乙醇重復(fù)回流提取2 h后過(guò)濾,合并2次濾液后減壓濃縮。凍干后計(jì)算得率,水提取物得率為45.28%,50%乙醇提取物得率為50.94%。

2.2 動(dòng)物造模與分組給藥

健康ICR小鼠共80只,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,將動(dòng)物隨機(jī)分為8組,每組10只。動(dòng)物按如表1方式分組,除空白組外,其余每日皮下注射D-半乳糖700 mg·kg-1·d-1,持續(xù)注射7周,建立D-半乳糖亞急性衰老動(dòng)物模型。模型建立之后各組灌胃相應(yīng)藥物,灌胃體積為每10 g動(dòng)物灌胃0.1 mL,持續(xù)10 d。采用AREDS2作為西藥陽(yáng)性藥,采用杞菊地黃丸作為中成藥陽(yáng)性藥。菊睛丸提取物動(dòng)物給藥劑量按照《太平惠民和劑局方》所記載的人用量進(jìn)行折算,并分為低、高2個(gè)劑量組。低劑量組根據(jù)人用日常劑量折算,高劑量組根據(jù)人用日常劑量的2倍進(jìn)行折算。

表1 動(dòng)物分組和給藥劑量

2.3 光學(xué)相干斷層成像檢查(OCT)與視網(wǎng)膜厚度測(cè)量

小鼠給藥周期結(jié)束后,1%戊巴比妥鈉腹腔注射小鼠(40 mg·kg-1),麻醉后使用復(fù)方托吡卡胺散瞳10 min,玻璃酸鈉保護(hù)角膜后佩戴角膜接觸鏡,進(jìn)行小鼠眼底OCT檢測(cè)。使用Image J對(duì)小鼠視網(wǎng)膜橫截面圖進(jìn)行平均厚度測(cè)量分析小鼠眼底情況。

2.4 眼部組織病理形態(tài)分析

2.4.1 眼部組織切片制作 采用OCT拍攝受試動(dòng)物眼底視網(wǎng)膜結(jié)束后,解剖獲得動(dòng)物模型眼球組織,于4%PFA固定24 h,梯度蔗糖、乙醇脫水。之后按步驟浸蠟,再進(jìn)行OCT包埋,用切片機(jī)切片,60 ℃烘箱內(nèi)烘片后最終制作獲得模型動(dòng)物眼球組織病理石蠟切片。

2.4.2 眼球組織病理切片HE染色 將2.4.1所得的眼球組織石蠟切片脫蠟之后,按步驟進(jìn)行HE染色,純水慢速洗滌10 s,乙醇梯度脫水,最后用中性樹(shù)脂封片。

2.5 TUNEL檢測(cè)眼部細(xì)胞凋亡水平

將“2.4.1”所得的眼球組織石蠟切片脫蠟之后,根據(jù)TUNEL試劑盒標(biāo)準(zhǔn)步驟,避光進(jìn)行染色,洗滌后DAPI染細(xì)胞核,乙醇梯度脫水,滴加防熒光淬滅劑后封片。檢測(cè)模型動(dòng)物視網(wǎng)膜部細(xì)胞凋亡水平。

2.6 血清及組織蛋白提取

行為學(xué)測(cè)試結(jié)束后,異氟烷吸入麻醉小鼠,眼眶取血,常溫條件下800×g離心10 min,小心吸取上清血清。解剖獲得模型動(dòng)物眼球組織,液氮迅速冷凍、粉碎,稱取20～30 mg組織,PBS制備勻漿(含Cocktail蛋白酶抑制劑),4 ℃條件下800×g離心10 min,小心吸取上清。保存于-80 ℃冰箱內(nèi)待測(cè)。

按照BCA試劑盒所列步驟,建立BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線,96孔板加入樣品與BCA工作液,37 ℃孵育20～30 min,于562 nm處檢測(cè)OD值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各樣品眼球組織蛋白濃度。

Western blot所需的蛋白樣品用含Cocktail蛋白酶抑制劑的RIPA組織裂解液提取制備,提取步驟及蛋白濃度檢測(cè)步驟同上。

2.7 眼球組織及血清中氧化應(yīng)激標(biāo)志物水平檢測(cè)

吸取20 μL待測(cè)樣品(制備過(guò)程2.6),按照SOD、MDA、GSH微量法檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作,試劑盒中標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行梯度稀釋后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,采用酶標(biāo)法在相應(yīng)波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度OD值,并計(jì)算模型動(dòng)物血清及眼球組織中相關(guān)因子表達(dá)。

2.8 Western blot法檢測(cè)小鼠眼部組織目的蛋白表達(dá)

將2.6中RIPA裂解液提取所獲得的眼球組織蛋白樣品,根據(jù)所測(cè)蛋白濃度加入PBS將各樣品蛋白濃度稀釋至相同水平。將蛋白上樣緩沖液與蛋白樣品按照1∶4混合均勻,98 ℃金屬浴高溫變性15 min,保存于-80 ℃冰箱內(nèi)待用。

按照凝膠試劑盒所列實(shí)驗(yàn)步驟,制備10%、12.5%的PAGE凝膠,上樣后120 V恒壓電泳跑至合適位置,切膠后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜,300 mA恒流條件轉(zhuǎn)相應(yīng)時(shí)間,5%脫脂奶粉室溫下?lián)u床低速封閉2 h,Tris-buffered saline plus Tween(TBS-T)洗膜5 min×3次,孵育目的蛋白一抗Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9、Bax、Bcl-2、Nrf2、HO-1(稀釋比例1∶2 000),4 ℃過(guò)夜?；謴?fù)室溫1 h后用TBS-T洗膜15 min×4次,加入2.5%脫脂奶粉稀釋配制的二抗HRP-Linked Anti-mouse IgG/HRP-Linked Anti-rabbit IgG(稀釋比例1∶10 000),室溫下?lián)u床低速孵育1 h,TBS-T洗膜10 min×6次,ECL顯色液顯色,凝膠成像曝光檢測(cè),利用Image J數(shù)字成像軟件將條帶圖像進(jìn)行可視化分析,以β-actin作為內(nèi)參蛋白,分析計(jì)算目的蛋白條帶相對(duì)灰度值。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析,組間比較采用One-wayANOVA,數(shù)據(jù)以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 菊睛丸對(duì)D-半乳糖亞急性衰老模型小鼠眼底和視網(wǎng)膜的影響

如圖1所示,模型小鼠視網(wǎng)膜厚度與空白組小鼠相比顯著變薄(P<0.01),給予菊睛丸后,視網(wǎng)膜有相應(yīng)增厚的趨勢(shì),其中JJW-S-L和JJW-50-L給藥組小鼠視網(wǎng)膜厚度顯著增厚(P<0.05),與西藥陽(yáng)性藥AREDS2作用趨勢(shì)一致(P<0.01),作用趨勢(shì)優(yōu)于中藥陽(yáng)性藥杞菊地黃丸。

注:與空白組比較,##P<0.01;與模型組比較,比例尺=200 μm。

采用HE染色評(píng)價(jià)小鼠視網(wǎng)膜部細(xì)胞病理組織形態(tài)改變情況,如圖2所示?？瞻捉MHE切片顯示,小鼠視網(wǎng)膜厚度適中,內(nèi)核層(INL)、外核層(ONL)、叢狀層(PL)均清晰可見(jiàn),各層細(xì)胞排列規(guī)則、緊密,無(wú)炎細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組小鼠INL顯著變薄彎曲,部分呈現(xiàn)空泡狀,ONL細(xì)胞排列紊亂。感光細(xì)胞層局部變薄,RPE細(xì)胞皺縮。菊睛丸提取物均可改善視網(wǎng)膜細(xì)胞排列紊亂,恢復(fù)視網(wǎng)膜厚度,并且對(duì)視網(wǎng)膜ONL、INL和PL厚度均具有顯著的恢復(fù)作用。分別測(cè)量ONL、INL、GL的厚度發(fā)現(xiàn),模型組小鼠視網(wǎng)膜各層厚度顯著變薄(P<0.05),菊睛丸提取物可以顯著增加視網(wǎng)膜各層厚度(P<0.05),與西藥陽(yáng)性藥AREDS2有相同的作用趨勢(shì),JJW-S-L、JJW-50-L、JJW-50-H的作用趨勢(shì)略優(yōu)于杞菊地黃丸。以上病理學(xué)HE染色結(jié)果及視網(wǎng)膜各層厚度的測(cè)量結(jié)果表明,D-半乳糖注射導(dǎo)致小鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞排列紊亂,視網(wǎng)膜ONL、INL和PL變薄,視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞皺縮,菊睛丸水提物和50%乙醇提取物均可恢復(fù)視網(wǎng)膜厚度,改善細(xì)胞排列紊亂情況。菊睛丸水提物低劑量組的作用趨勢(shì)優(yōu)于杞菊地黃丸。

注:與空白組比較,#P<0.05,##P<0.01;與模型組比較,比例尺=50 μm。

3.2 菊睛丸對(duì)D-半乳糖亞急性衰老模型動(dòng)物眼球組織及血清氧化應(yīng)激標(biāo)志物水平的影響

如圖3所示,和空白組相比,模型組小鼠眼球組織中SOD活力和GSH含量顯著下降(P<0.01),MDA含量顯著上升(P<0.01),表明D-半乳糖模型動(dòng)物眼部氧化水平顯著增高。與模型組相比,菊睛丸水提取物及50%乙醇提取物低劑量顯著上調(diào)眼球組織中SOD活力(P<0.01)和GSH含量(P<0.05,P<0.01),顯著下調(diào)MDA含量(P<0.01)。提示菊睛丸可通過(guò)提高抗氧化酶的表達(dá)和降低氧化物的產(chǎn)生來(lái)發(fā)揮抗氧化作用,作用趨勢(shì)與AREDS2一致,其中對(duì)MDA表達(dá)的效用優(yōu)于杞菊地黃丸。菊睛丸水提物在上調(diào)SOD、下調(diào)MDA作用與醇提物的效用相當(dāng),上調(diào)GSH效用優(yōu)于醇提物。

注:與空白組比較,##P<0.01;與模型組比較,

對(duì)小鼠血清氧化應(yīng)激標(biāo)志物水平進(jìn)行檢測(cè),考察氧化應(yīng)激對(duì)小鼠全身狀況的影響。如圖4所示,和空白組相比,模型組小鼠血清中SOD活力和GSH含量顯著下降(P<0.01),MDA含量顯著上升(P<0.01),表明D-半乳糖亞急性衰老模型動(dòng)物全身氧化水平顯著增高。與模型組相比,不同提取溶劑的菊睛丸提取物顯著上調(diào)血清中SOD活力(P<0.01)和GSH含量(P<0.01),顯著下調(diào)MDA含量(P<0.01),作用趨勢(shì)與AREDS2一致。菊睛丸50%乙醇提取物低劑量組具有較優(yōu)的作用趨勢(shì),并優(yōu)于杞菊地黃丸。

注:與空白組比較,##P<0.01;與模型組比較,

3.3 菊睛丸對(duì)D-半乳糖亞急性衰老模型小鼠眼球組織抗氧化蛋白表達(dá)的影響

結(jié)果如圖5所示,模型組小鼠Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)較空白組顯著下降(P<0.05)。給藥后,菊睛丸水提取物和50%乙醇提取物能顯著提高抗氧化蛋白Nrf2和HO-1表達(dá)(P<0.05,P<0.01),作用趨勢(shì)與AREDS2一致,優(yōu)于杞菊地黃丸。提示菊睛丸可通過(guò)調(diào)控Nrf2/HO-1抗氧化通路發(fā)揮抗氧化作用。菊睛丸水提物低劑量組具有較優(yōu)的作用趨勢(shì)。

注:與空白組比較,#P<0.05;與模型組比較,

3.4 菊睛丸對(duì)D-半乳糖亞急性衰老模型小鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡的影響

進(jìn)一步采用TUNEL染色考察模型小鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡情況。如圖6所示,模型組小鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞較空白組凋亡顯著增強(qiáng)(凋亡細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光,P<0.01),給予菊睛丸水提取物和50%乙醇提取物后,視網(wǎng)膜部細(xì)胞凋亡顯著減少(P<0.05,P<0.01),提示菊睛丸可以通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡保護(hù)視網(wǎng)膜部細(xì)胞,作用趨勢(shì)與西藥陽(yáng)性藥AREDS2一致。菊睛丸水提物高劑量組具有較優(yōu)的作用趨勢(shì)。

3.5 菊睛丸對(duì)D-半乳糖亞急性衰老模型小鼠眼球凋亡通路蛋白表達(dá)的影響

采用Western blot法檢測(cè)小鼠眼球凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá),考察菊睛丸對(duì)凋亡相關(guān)通路的調(diào)控作用。如圖7所示,模型組小鼠眼球Bcl-2/Bax比值顯著降低(P<0.05),凋亡蛋白Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9表達(dá)含量顯著增加(P<0.05)。給予菊睛丸水提取物和50%乙醇提取物后,Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9表達(dá)顯著下降(P<0.05,P<0.01),Bcl-2/Bax比值顯著上升(P<0.05,P<0.01),作用趨勢(shì)與AREDS2一致。提示菊睛丸調(diào)節(jié)凋亡通路抑制眼球細(xì)胞凋亡。

4 討論

隨著人類(lèi)平均壽命延長(zhǎng)和生育率下降,社會(huì)老齡化加劇。按照世界衛(wèi)生組織標(biāo)準(zhǔn),我國(guó)也即將步入中度老齡化社會(huì)[15]。因此,衰老引起的疾病逐步得到重視,衰老機(jī)制和抗衰老措施逐漸成為研究熱點(diǎn)。氧化應(yīng)激學(xué)說(shuō)是目前公認(rèn)的衰老假說(shuō),其核心內(nèi)容是機(jī)體代謝產(chǎn)生的活性氧(ROS)攻擊細(xì)胞內(nèi)包括DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在內(nèi)的大分子物質(zhì)而造成氧化損傷,氧化損傷物質(zhì)在體內(nèi)的不斷積累導(dǎo)致線粒體功能喪失與生物體衰老[16]。D-半乳糖本身存在于食物和人體內(nèi)。長(zhǎng)期接觸高劑量D-半乳糖可被半乳糖氧化酶催化轉(zhuǎn)化為醛糖和過(guò)氧化氫,產(chǎn)生ROS而導(dǎo)致氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)、線粒體功能障礙和細(xì)胞凋亡[17]。因此D-半乳糖小鼠皮下注射常用于構(gòu)建亞急性衰老動(dòng)物模型而用于抗衰老研究或藥物效用評(píng)價(jià)。在本研究中我們同樣發(fā)現(xiàn),D-半乳糖皮下注射導(dǎo)致小鼠視網(wǎng)膜INL層顯著變薄彎曲,部分呈現(xiàn)空泡狀,外核層細(xì)胞排列紊亂。感光細(xì)胞層局部變薄,視網(wǎng)膜上皮色素細(xì)胞皺縮,與干性AMD臨床視網(wǎng)膜萎縮具有高度相似性,同時(shí)該病理現(xiàn)象可被唯一推薦的干性AMD預(yù)防與控制膳食添加劑AREDS2[18]所抑制。與公認(rèn)的小鼠NaIO3注射擬干性AMD模型[19]相比,該模型同時(shí)還兼具了衰老的因素,更符合AMD的實(shí)際病理情況。與自然衰老小鼠模型相比,實(shí)驗(yàn)周期也大大縮短,因此該模型可作為干性AMD病理研究與藥物評(píng)價(jià)模型。

中醫(yī)認(rèn)為,年事日高,精血暗耗,肝腎漸虧,水不涵木,陰虛火旺,肝陽(yáng)上亢則疏泄失權(quán),水谷不歸正化則濕聚為痰,積聚眼底變生玻璃膜疣;同時(shí),腎精虧虛,肝血不足,氣血生化乏源,目睛失養(yǎng),眼底萎縮,形成干性AMD。病程進(jìn)一步發(fā)展為肝失疏泄,木橫伐土,肝失藏血之責(zé),脾失攝血之權(quán),導(dǎo)致津血不能循經(jīng),停留眼底形成瘀血痰濕,形成濕性AMD?！案文I不足,陰虛火旺”的病機(jī)貫穿于AMD病程發(fā)展全過(guò)程,因此,“滋肝補(bǔ)腎,平肝明目”也相應(yīng)成為了干性AMD遣方用藥的主要原則。菊睛丸最早以“傅延年酒”之名記載于唐代王冰《元和紀(jì)用經(jīng)》,其功效為“利血?dú)?耐老輕身,明目安神,養(yǎng)志,補(bǔ)勞傷”[20],記載其具有延緩衰老與明目之效?！毒址健穭t首次明確了菊睛丸在眼科的具體應(yīng)用。此后,同樣四味藥又以“內(nèi)養(yǎng)丸”“草還丹”(《圣濟(jì)總錄》[21])與“菊花丸”(《三因極一病證方論》[22])等同方異名見(jiàn)于多本代表性方書(shū)著作,且被描述為有清利頭目,益壽延年之效,足見(jiàn)該方抗衰老與明目效用之確切。方中枸杞子滋肝血,益腎精,補(bǔ)肝腎陰而明目;肉蓯蓉補(bǔ)腎助陽(yáng),潤(rùn)燥益精;巴戟天溫陽(yáng)助火,補(bǔ)益精血。三藥相伍,陰陽(yáng)既濟(jì),則肝血腎精得充而目明,本患得除。菊花疏風(fēng)散邪,清熱平肝,標(biāo)患得解;又可籍其升散之功引三藥上滋于目,補(bǔ)益肝腎明目之功益彰;復(fù)以其“清”之性防枸杞子、肉蓯蓉滋膩礙脾,杜巴戟天溫燥傷陰之患。同時(shí),方中的枸杞子與菊花為滋肝腎陰常用藥對(duì),肉蓯蓉與巴戟天為溫補(bǔ)腎陽(yáng)常用藥對(duì),共同伍用,不僅體現(xiàn)了中醫(yī)理論“善補(bǔ)陽(yáng)者,必于陰中求陽(yáng);善補(bǔ)陰者,必于陽(yáng)中求陰”的治則,更與老年人精血虧虛,腎陽(yáng)虛衰的體質(zhì)特征絲絲入扣。與AMD的另一味常用中成藥杞菊地黃丸偏于補(bǔ)肝腎陰[23]相比,似乎更吻合老年人易于陰陽(yáng)兩虛的體質(zhì)特征。而本研究也發(fā)現(xiàn),菊睛丸提取物在改善模型小鼠視網(wǎng)膜厚度、調(diào)控氧化應(yīng)激與視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡等環(huán)節(jié)上,比杞菊地黃丸給藥組有更好的改善趨勢(shì)。

現(xiàn)代研究表明,菊睛丸方中藥味雖為藥食同源類(lèi)藥材,但其所含成分對(duì)視疲勞緩解與視網(wǎng)膜保護(hù)具有顯著效用。枸杞子中所含枸杞多糖可通過(guò)抗氧化、調(diào)節(jié)血管、神經(jīng)保護(hù)以及免疫調(diào)節(jié)等多種途徑發(fā)揮視網(wǎng)膜保護(hù)作用[24];玉米黃質(zhì)和葉黃素、類(lèi)胡蘿卜素類(lèi)成分是國(guó)際公認(rèn)的可顯著降低白內(nèi)障與晚期AMD發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的物質(zhì)[25]。菊花所含黃酮成分可抵御視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞氧化損傷與細(xì)胞凋亡[26]。本課題組前期研究同樣發(fā)現(xiàn),枸杞子和菊花配伍可改善氫醌誘導(dǎo)的AMD小鼠視網(wǎng)膜INL紊亂,降低視網(wǎng)膜炎癥因子的表達(dá),降低多種因素?fù)p傷的視網(wǎng)膜部細(xì)胞凋亡,增加保護(hù)視網(wǎng)膜區(qū)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性,且效用強(qiáng)于單獨(dú)使用枸杞子[27]。相對(duì)而言,肉蓯蓉與巴戟天中的成分對(duì)AMD的改善作用報(bào)道較少,更多則集中于抗衰老的研究,如巴戟天多糖具有抗氧化、抗衰老和免疫調(diào)節(jié)等功效[28],肉蓯蓉所含松果菊苷與多糖成分具有提升機(jī)體免疫力與調(diào)節(jié)免疫的效用[29]。上述研究均充分證明了菊睛丸在抗老年期視網(wǎng)膜退行性疾病方面的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用價(jià)值。值得注意的是,枸杞子中的玉米黃質(zhì)、葉黃素、類(lèi)胡蘿卜素及菊花所含黃酮成分均屬脂溶性成分,支持了菊睛丸以丸劑用藥的合理性。但是在考察該方的歷史應(yīng)用發(fā)現(xiàn),方中四味藥材也常作湯劑應(yīng)用。因此我們?cè)谘芯恐斜容^了菊睛丸水提物與50%乙醇提取物的效用差異,但未發(fā)現(xiàn)有顯著性差異。在后續(xù)研究中,我們將深入探索菊睛丸改善衰老模型小鼠視網(wǎng)膜部損傷的作用機(jī)制與功效物質(zhì)基礎(chǔ),以期為菊睛丸的臨床應(yīng)用與產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供更多的現(xiàn)代科學(xué)依據(jù)支持。